Protocol
NOTE: Cette étude a été approuvée par les comités d'éthique appropriés.
1. Culture primaire des fibroblastes pulmonaires humains
- Collecte de tissu pulmonaire:
- Obtenir des échantillons humains de tissus pulmonaires de la salle d'opération chirurgicale directement. Prélever environ 1 cm 3 pâtés de maisons de tissus pulmonaires cancéreuses et non-cancéreuses, avec l'échantillon non-cancéreuse recueillies aussi loin de la tumeur que possible.
- Suspendre les échantillons dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 0,25 pg / ml d'amphotéricine B (milieu sans sérum). Maintenir les échantillons en suspension dans 50 ml tubes stériles et de transférer au laboratoire.
NOTE: Les fibroblastes sont hautement migratoires et proliférative rapport à d'autres types de cellules, comme épithéliales, endothéliales et les cellules musculaires lisses. Le procédé de l'excroissance tire profit de ces caractéristiques de fibroblastes, et outgrocellules de l'aile de coupes de tissus sont abondants dans les fibroblastes. Après plusieurs passages cellulaires, d'autres types de cellules ne parviennent pas à survivre et à se propager dans du DMEM avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), ce qui entraîne dans des cultures cellulaires de fibroblastes purifiés. Les cellules pourraient être utilisées 3-7 passages suivants culture primaire.
- Explantation culture et de conditionnement pour excroissance de cellules:
- Effectuer culture primaire de fibroblastes en utilisant un protocole indiqué précédemment avec des modifications 5.
- Dans le laboratoire, placer l'échantillon de tissu sur une boîte de 10 cm de culture de tissu sans milieu de culture et les couper en petites sections ~ 2-3 mm de taille à l'aide de pinces stériles et un scalpel. Pendant ce processus, éviter de faire la section sèche, sinon l'efficacité de l'excroissance des cellules est altérée.
- La séparation de la couche de cellules epitheliales et du tissu conjonctif:
- Faire tremper les coupes de tissus de coupe dans un milieu de culture contenant 2000 PU / ml dispase I et la culture pendant 16 heures à 4 ° C. </ Li>
- Transférer les sections de tissu à plat, et on sépare la couche de cellules épithéliales à partir du tissu conjonctif adjacent. Traiter les sections dans un banc propre pour éviter la contamination des micro-organismes.
NOTE: Si la culture primaire de cellules épithéliales est nécessaire, effectuer l'étape 1.3. Si seulement les fibroblastes sont d'être isolé, omettre l'étape 1.3, car les Explant et cellulaires passages ultérieurs sont défavorables pour les cellules épithéliales, qui donnent populations de fibroblastes purifiés.
- Fixation des coupes de tissus:
- Émincer les tissus en morceaux de 1 mm à l'aide de deux scalpels. Si les pièces ne sont pas assez petit, elles se détachent plus facilement de l'antenne, et les cellules ne parviennent pas à dépasser sur la surface de la boîte.
- Passer petites sections de tissu pulmonaire les unes des autres pour maintenir une zone vide entourant chaque pièce. Assurez-rayures sur la surface de la boîte de culture tissulaire en utilisant une lame de scalpel pour faciliter la fixation des coupes de tissus.
REMARQUE: Grattersemble également faciliter l'excroissance des cellules, fournissent des pistes le long de laquelle les cellules peuvent migrer.- Alternativement, placer des morceaux de tissus hachés individuellement dans chaque puits d'une plaque à 6 puits, et les couvrir avec une lamelle. Fixez la lamelle à la surface de la plaque avec de la graisse de silicone.
- Placez la graisse de silicone à deux points 1,5 cm à part dans chaque puits en utilisant une goupille stérile. Couverture des morceaux de tissu améliore l'efficacité de l'excroissance des cellules et la propagation des cellules après plusieurs passages.
- Explant ultérieure:
- Ajouter délicatement milieu de culture à l'antenne avant les coupes de tissus se dessèchent, aussi efficace excroissance cellulaire est perdu pour la plupart si les échantillons sécher. Ne versez pas le support trop rapidement que les coupes de tissus seraient détacher.
- des cellules de culture dans du DMEM avec 10% de FBS. Utiliser suffisamment de support pour couvrir tout le tissu, mais pas trop qu'il permet flottant, comme la flottabilité supplémentaire favorise le détachement duplat.
- Cellule passage:
- Manipulez le milieu de culture avec soin en tout temps que les mouvements répétés de la boîte de culture peuvent conduire au détachement des sections de tissus.
- Placez les boîtes de culture dans un incubateur à 37 ° C pendant 5-7 jours. Actualiser le milieu tous les deux jours, et de gérer les boîtes de culture minimale pendant les moyennes changements. Fibroblastes grandissent à partir du bord des sections de tissus au cours des prochaines semaines.
REMARQUE: Après ~ 2-3 semaines, les fibroblastes excroissance presque atteignent la confluence, en fonction de la quantité d'aire de surface. - Laver les cellules avec PBS 1x, et ajouter 1 ml de trypsine I de la plaque.
- Après trypsinisation, détacher les cellules en utilisant 9 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS. Recueillir les cellules en suspension dans le milieu dans un tube de 10 ml, ainsi que les coupes de tissu. Après centrifugation pour former des pastilles de cellules, remettre en suspension les culots obtenus dans le nouveau milieu.
- Ensemencer les cellules et des coupes de tissus sur un nouveau culplat de ture, à quel point les tissus ne parviennent pas à fixer à la boîte tandis que les cellules adhèrent et se développent. Le lendemain, retirez les morceaux de tissu flottant par aspiration, et de changer le milieu. Fibroblastes attachés propagent avec les cultures suivantes.
2. Trois dimensions Co-culture de fibroblastes de poumon humain et les cellules cancéreuses
- Préparation des cellules et des réactifs:
- Utiliser environ 2 x 10 5 cellules épithéliales et 2,5 x 10 5 fibroblastes par puits. Préparation de collagène de type IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), un tampon de reconstitution (NaOH 50 mM, 260 mM NaHCO 3 mM, HEPES 200), 5x DMEM, DMEM complété avec 10% de FBS pour la culture des fibroblastes, et un milieu de co-culture en 3D (un mélange 1: de milieu de culture de fibroblastes et une milieu de culture pour les cellules cancéreuses).
- Des cellules d'adénocarcinome du poumon A549, la culture des fibroblastes et la co-culture 3D A549 dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS.
- Collagène gel formation:
- Laver les fibroblastes cultivés sur 10 cm plat avec 1x PBS, et ajouter 1 ml de trypsine I de la plaque. Après trypsinisation de ~ 5 min à 37 ° C, de détacher les cellules en utilisant 9 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS. Recueillir les cellules en suspension dans le milieu dans un tube de 10 ml, et les centrifuger à 200 à 300 xg pour former des pastilles cellulaires.
- Remettre en suspension les pastilles résultantes à 100% de FBS à une densité de 5 x 10 5 / ml.
- Préparer le gel de collagène sur de la glace. Refroidir les réactifs, pipettes et les tubes dans un réfrigérateur avant la procédure suivante. Même sur de la glace, le mélange se solidifie dans une certaine mesure, et le volume total est inférieur à la somme de tous les constituants.
- Dans chaque puits, de préparer le gel de collagène en mélangeant 0,5 ml de suspension de fibroblastes (2,5 x 10 5 cellules) de FBS, 2,3 ml de collagène de type IA, 670 ul de DMEM 5x, et 330 ul de tampon de reconstitution. Laisser les gels de mettre facilement à la température ambiante.
- Pipette vigoureusement pour assurer un km homogènexture. Éviter de créer des bulles pendant le processus de pipetage.
- Ajouter le mélange (3 ml) à chaque puits d'une plaque à 6 puits et laisser gélifier dans l'incubateur à 37 ° C sans perturbation pendant 30 à 60 min.
- culture de cellules de cancer sur le gel de collagène:
- Effectuer co-culture en trois dimensions en utilisant un protocole indiqué précédemment, avec les adaptations 6.
- Resuspendre les cellules cancéreuses dans le milieu de co-culture en 3D (ou dans du DMEM avec 10% de FBS dans le cas des cellules A549) à une densité de 1 x 10 5 / ml.
- Verser 2 ml de la solution de cellules remis en suspension (2 x 10 5 cellules) sur la surface de chaque gel. Modifier le nombre de cellules des cellules cancéreuses ou des fibroblastes en co-culture en fonction des conditions expérimentales.
- Gel contraction:
- Incuber des gels pendant une nuit à 37 ° C de sorte que les cellules cancéreuses peuvent adhérer au gel de collagène. Détachez chaque gel, et de générer une «culture flottant» dans chaque puits of la plaque de 6 puits.
NOTE: En utilisant une culture flottante, divers changements dans la taille du gel sont induits par une tension mécanique et la dégradation du collagène, qui sont médiés par l'interaction cellulaire entre les cellules cancéreuses et des fibroblastes co-cultivés. - Utilisez une aiguille 21 G angle ou petite spatule pour séparer chaque gel à partir du bord du puits. Tous les 2-3 jours, rafraîchir les puits avec 2 ml de 3D milieu de co-culture. Mesurer la taille de chaque gel tous les jours pendant 5 jours.
- Incuber des gels pendant une nuit à 37 ° C de sorte que les cellules cancéreuses peuvent adhérer au gel de collagène. Détachez chaque gel, et de générer une «culture flottant» dans chaque puits of la plaque de 6 puits.
- L'analyse des gels de collagène:
- Mesure de la teneur en collagène de chaque gel en utilisant des méthodes de quantification de collagène, tels que le dosage Sircol. Effectuer une analyse transcriptomique ou RT-PCR quantitative après avoir recueilli l'ARN à partir des gels 5.
3. Air-liquide Interface Culture et Invasion Assay
- Après la culture des gels de collagène à 37 ° C pendant 5 jours, exposer les gels contractés à l'air en les plaçant sur un maillage (70 um taille des pores) dans la nouvelle 6-plaques à puits. Faire le maillage du tamis cellulaires disponibles dans le commerce utilisés pour la cytométrie de flux.
- Versez doucement chaque puits avec 11 ml de 3D milieu de co-culture.
- Placez les gels sur le maillage en utilisant une cuillère stérile, et retirer tout support restant dans les gels. A cette condition, gels immerger dans le milieu tandis que d'exposer la surface supérieure du gel à l'air. Définir cette condition de la culture comme interface air-liquide.
REMARQUE: Après 5-7 jours de culture en maintenant l'interface air-liquide à 37 ° C dans l'incubateur, les cellules cancéreuses invasives migrent dans le gel. Selon le type de cellule et à la suite d'interactions cellulaires, des degrés variables de changement morphologique cellulaire dans les cellules cancéreuses sont induits par la culture d'interface air-liquide. - Pour l'évaluation histologique, fixer le gel dans une solution de formol nuit à la température ambiante et l'intégrer dans de la paraffine. Colorer sections verticales (4 um) avec hématoxyline et l'éosine (H & E). Effectuer une analyse immunohistochimique on les sections 4.
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Representative Results
Cette méthode de co-culture, imitant le micro-environnement de la tumeur, est un outil utile pour étudier les interactions entre les cellules cancéreuses et les fibroblastes incorporés dans des gels de collagène. Dans l'étude précédente, trois paramètres ont été évalués dans ce modèle expérimental: contraction du gel de collagène, l'invasion des cellules cancéreuses et les changements morphologiques. la prolifération des cellules du cancer a également été estimée en utilisant une immunocoloration 4 Ki67. Des échantillons de tissus pulmonaires ont été collectés à partir de sections cancéreuses et non cancéreuses d'un lobe pulmonaire réséqué (figure 1A). Les échantillons ont été hachés en petits morceaux et cultivées dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS (figure 1B). Les fibroblastes en croissance sur la coupe de tissu ont été observées au microscope (Figure 1C). Fibroblastes pulmonaires en culture primaire ont été incorporés dans un gel de collagène (figure 2A, a) et des cellules de cancer du poumon A549 ont été co-cultivées sur du gel (figure 2A, B). Après c flottanteULTURE dans le milieu (figure 2A, c), le gel a été ensuite mis en culture dans les conditions de l'interface air-liquide (figure 2A, d). Le gel a été fixé dans de la formaline et utilisée pour des analyses immunohistochimiques (figure 2A, e). Pour la culture d'interface air-liquide, le gel a été placé sur une grille dans un puits de plaque à 6 puits (figure 2B). Des analyses histologiques du gel a révélé l'invasion des cellules A549 dans le gel de collagène avec des fibroblastes embarqué associé au cancer du poumon (Figure 3).
Figure 1: Excroissance des fibroblastes provenant de tissu pulmonaire humain réséqué chirurgicalement. (A) Les échantillons ont été recueillis à partir de sections cancéreuses et non cancéreuses d'un lobe pulmonaire réséqué. (B) Des échantillons ont été hachés en petits morceaux et cultivées dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS.(C) Les fibroblastes est née de la coupe de tissu (flèche). On notera que les cellules ont migré le long des rayures faites par les lames de scalpel sur la boîte de culture. La barre d'échelle, 200 um.
Figure 2:. Interface air-liquide de culture de gel de collagène cellules A549 ont été co-cultivées sur un gel de collagène incorporé avec les fibroblastes, et la couche de cellules A549 a été exposé à l'air en plaçant le gel sur une maille dans un milieu (A. ) Les procédures expérimentales de tridimensionnel co-culture et de l'interface air-liquide. (a) un gel de collagène incorporé avec des fibroblastes pulmonaires. (b) des cellules A549 co-cultivées sur du gel de collagène. (c) culture flottante. (d) Air- interface liquide (ALI). (E) Fixation du gel dans du formol. (B) de l'image représentant de ee gel placé sur le treillis dans un puits de plaque à 6 puits. O / N: nuit.
Figure 3. hématoxyline et éosine de sections transversales d'un gel en culture tridimensionnelle composée de cellules A549 et les fibroblastes pulmonaires humains. Notez que les cellules A549 en culture sur du gel de collagène ont envahi le gel intégré avec des fibroblastes (flèches). La barre d'échelle, 200 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
CAF forment une composante majeure de l'ECM entourant les cellules cancéreuses et non seulement fournir un échafaudage pour la tumeur, mais aussi participer activement au développement de la tumeur 7. L'accumulation de preuves dénoue l'impact de la CAF ou de leurs molécules apparentées sur le pronostic éventuelle, en soulignant le rôle crucial de la progression tumorale CAF médiation 8.
Dans l'étude précédente, nous avons utilisé la méthode pour isoler CAF excroissance pulmonaires 4. Dans cette expérience, le maintien de la section de tissu adhérence sur la surface du plat est critique. Les cellules sont incapables de migrer à partir de coupes de tissus qui flottent dans le milieu de culture, et une fois que les sections de tissu se détachent de la surface, ils ne peuvent plus être utilisés pour excroissance de cellules sur la même boîte de culture. Coupe du tissu donne exsudats, qui servent en tant que colle pour la fixation à la surface de la vaisselle. Lors de la fixation de la section de tissu avec une lamelle, la quantité de graisse utilisée est également Critical. De petites quantités de graisse ne parviennent pas à conserver le bordereau de couvercle fixé, tandis que la graisse excessive obscurcit la zone de culture de cellules. Fixation des coupes de tissus en utilisant une lamelle et la pression appropriée est également un facteur clé favorisant l'excroissance des cellules.
Les modèles expérimentaux pour la prolifération des cellules cancéreuses et l'invasion ont principalement appuyé sur des cultures de tissus monocouches bidimensionnelles ou des dosages de la chambre de Boyden. Afin de mieux comprendre la communication intercellulaire et ECM modulation dépendant du comportement des cellules cancéreuses, des co-cultures tridimensionnelles sont des outils puissants. Cultures organotypiques sont également utiles pour étudier les interactions multicellulaires, se ils ont besoin de compétences techniques élevées et les conditions expérimentales sont limitées.
Notre modèle de co-culture sert de plate-forme pour évaluer les interactions tumeur-stroma dans des conditions mimant le microenvironnement tumoral. Les cellules avec surexpression du gène spécifique ou knockdown sont facilement applicable dans notre culture système, ce qui est un avantage par rapport culture organotypique. En particulier, nos observations précédentes ont suggéré que les fibroblastes co-cultivés moduler activement la différenciation cellulaire et l'invasion du cancer 4. Il serait intéressant de tester les interactions multicellulaires possibles dans notre cadre expérimental, comme les cellules endothéliales, les cellules inflammatoires et les cellules épithéliales non-cancéreuses.
Caractéristiques distinctes de CAF ont été démontrées dans des études de co-culture ou par profilage d'expression génique, en utilisant des cultures primaires de la CAF et leurs homologues normales neuf. D'autre part, ces études ont également montré l'hétérogénéité intra-tumorale ou inter-individuelle de CAF 10, dont une partie pourrait être attribuable à différents niveaux de facteur de croissance de signalisation 11 ou facteur de transcription 12 activation. Ainsi, il est essentiel pour caractériser davantage CAF hétérogènes provenant de 13 patients atteints de cancer. A la suite des passages répétés de la cellule,les caractéristiques de CAF en culture primaire peuvent être modifiés. Par conséquent, il serait mieux pour caractériser CAF au début des passages.
CAF contribuent au dépôt et le remodelage ECM, qui à son tour, peut activer CAF par la signalisation cellulaire tension déclenchée. Un tel feed-forward boucle de mécanotransduction médiation de l'activation de la CAF a été suggéré 14, et notre modèle de contraction de gel de collagène peut fournir des indications sur ces mécanismes. Les mécanismes de gel de collagène comprennent contraction contraction cellulaire, la prolifération, la migration, la différenciation et le remodelage du collagène 15. Études et expériences histologiques détaillées utilisant des ligands, des inhibiteurs, ou ARNi peuvent être utiles pour obtenir un aperçu mécaniste sur les interactions entre la tumeur stromale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Collagen type IA | Nitta gelatin Inc. | CELL-1A | |
| Reconstitution buffer | Nitta gelatin Inc. | ||
| Cover slip | NUNC | 174934 | |
| Silicone grease | Dow Corning Toray | High vacuum grease | |
| Dispase I | WAKO | 386-02271 | |
| 6-well plate | BD Falcon | 353046 | |
| Cell strainer (70 μm) | BD Falcon | 352350 |
References
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