Protocol
MERK: Denne studien ble godkjent av de aktuelle etiske komiteer.
1. Primær Culture of Human lungefibroblaster
- Samling av lungevev:
- Skaff menneskelige lunge vevsprøver fra kirurgisk operasjonsstuen direkte. Samle omtrent 1 cm 3 blokker fra cancerøs og ikke-cancerøs lungevev, med det ikke-kreft prøve samlet så langt borte fra tumor som mulig.
- Suspen prøvene i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 100 enheter / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 0,25 ug / ml amfotericin B (serumfritt medium). Opprettholde den suspenderte prøvene i sterile 50 ml rør og overføre til laboratoriet.
MERK: Fibroblaster er svært trekkfugl og proliferativ sammenlignet med andre celletyper, som epitel, endothelial og glatte muskelceller. Den utvekst metoden tar nytte av disse funksjonene i fibroblaster, og outgrovinge celler fra vev seksjoner er rikelig i fibroblaster. Etter flere cellepassasjer, andre celletyper som ikke klarer å overleve og formere seg i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS), noe som resulterer i renset fibroblast-cellekulturer. Cellene kan brukes 3-7 passeringer følgende primære kultur.
- Explant kultur og condition for celleutvekst:
- Utføre primærkultur fibroblaster ved hjelp av en tidligere rapportert protokoll med modifikasjoner 5.
- I laboratoriet, plasserer vevsprøve på en 10 cm vevskulturskål uten kulturmedium og skåret i små seksjoner ~ 2-3 mm i størrelse ved hjelp av sterile pinsett og en skalpell. I løpet av denne prosessen, unngå å lage den tørre delen, ellers effektiviteten av celleutvekst er nedsatt.
- Separasjon av epitelcellelaget og bindevev:
- Bløt kutt vevsdelene i dyrkingsmedium som inneholder 2000 PU / ml dispase jeg og kultur i 16 timer ved 4 ° C. </ Li>
- Overfør vevssnittene til en tallerken, og separere epitelcellelaget fra tilstøtende bindevev. Behandle seksjonene i en ren benk for å unngå forurensning av mikroorganismer.
MERK: Hvis primærkultur av epitelceller er nødvendig, utfører du trinn 1.3. Hvis bare fibroblaster er å være isolert, hoppe over trinn 1.3 fordi de påfølgende explant kultur og celle passasjer er ugunstig for epitelceller, som gir rensede fibroblast populasjoner.
- Vedlegg av vevssnitt:
- Finhakk vev i en mm brikker bruker to skalpeller. Hvis bitene er ikke små nok, de løsner lettere fra fatet, og cellene vil mislykkes i å vokse på fatet overflaten.
- Plasser små lunge vevssnitt fra hverandre for å opprettholde et tomt område som omgir hver brikke. Gjør riper på overflaten av vevet kulturskål ved hjelp av et skalpellblad for å lette festing av vevssnitt.
MERK: Kloringsynes også å legge til rette celleutvekst, som gir spor langs hvilke celler kan migrere.- Alternativt, plasserer hakket vev stykker individuelt i hver brønn av en seks-brønns plate, og dekk dem med et dekkglass. Feste dekkglass på overflaten av platen ved hjelp av silikonfett.
- Plasser silikonfett på to punkter 1,5 cm fra hverandre i hver brønn med en steril pin. Dekning av vev stykker forbedrer effekten av celleutvekst og celle forplantning etter flere passasjer.
- Påfølgende explant kultur:
- Tilsett kulturmedium til parabolen før vevssnittene tørke ut, så effektiv celleutvekst er tapt for det meste om prøvene tørke ut. Ikke hell mediet for fort som vevsdelene ville løsne.
- Kultur celler i DMEM med 10% FBS. Bruk nok medium å bare dekke vev, men ikke så mye at det tillater flytende, som ekstra oppdrift fremmer løsgjøring fraparabolen.
- Celle passasje:
- Håndtak kulturmediet med forsiktighet på alle tider som gjentatte bevegelser av kulturskål kan føre til løsgjøring av vevssnitt.
- Plasser kulturskåler i en inkubator ved 37 ° C i 5-7 dager. Oppdatere medium annenhver dag, og håndtere kultur retter minimalt i løpet av de mellom endringer. Fibroblaster vokse fra kanten av vevsdelene i løpet av de neste ukene.
MERK: Etter ~ 2-3 uker, outgrowing fibroblaster nesten nå samløpet, avhengig av hvor mye areal. - Vask cellene med 1 x PBS, og tilsett 1 ml trypsin I til platen.
- Etter trypsinering, løsne cellene ved bruk av 9 ml av DMEM supplert med 10% FBS. Samle celler suspendert i mediet i et 10 ml rør, sammen med de vevssnitt. Etter sentrifugering for å danne celle pellets, suspender de resulterende pellets i det nye medium.
- Seed cellene og vevsdelene på en ny blindture fatet, noe som medførte at vevet ikke klarer å feste til parabolen mens cellene holder seg og vokse. Dagen etter, fjerne flytende vev stykker ved aspirasjon, og bytter mediet. Vedlagte fibroblaster forplante med påfølgende kulturer.
2. Tredimensjonal Co-kultur menneskerettighets lungefibroblaster og kreftceller
- Fremstilling av celler og reagenser:
- Omtrent bruke 2 x 10 5 epitelceller og 2,5 x 10 5 fibroblaster per brønn. Forbered kollagen type IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), rekonstituering buffer (50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES), 5x DMEM, DMEM supplert med 10% FBS for fibroblast kultur, og en 3D-ko-kulturmedium (en 1: 1 blanding av fibroblast kulturmedium og dyrkningsmedium for kreftceller).
- Kultur A549 lunge adenokarsinom celler, fibroblaster og A549 3D ko-kultur i DMEM supplert med 10% FBS.
- Kollagen gel formasjon:
- Vask fibroblaster dyrket på 10 cm tallerken med 1x PBS, og tilsett 1 ml trypsin jeg til plate. Etter trypsinering i ~ 5 min ved 37 ° C, løsne cellene ved bruk av 9 ml DMEM supplert med 10% FBS. Samle celler suspendert i mediet i et 10 ml rør, og sentrifugere dem ved 200-300 x g for å danne cellepellets.
- Resuspender de resulterende pellets i 100% FBS ved en tetthet på 5 x 10 5 / ml.
- Forberede kollagen gel på is. Avkjøl reagensene, pipetter og rør i et kjøleskap før den følgende prosedyre. Selv på is, stivner blandingen til en viss grad, og det totale volum er mindre enn summen av alle bestanddelene.
- I hver brønn, forberede kollagen-gel ved å blande 0,5 ml av fibroblast-suspensjonen (2,5 x 10 5 celler) i FBS, 2,3 ml type IA kollagen, 670 ul 5x DMEM, og 330 ul buffer rekonstituering. Tillat gelene for å sette lett ved værelsestemperatur.
- Kraftig pipette for å sikre en homogen mixture. Unngå å skape bobler under pipettering prosessen.
- Tilsett blandingen (3 ml) til hver brønn i en 6-brønns plate og tillater å gelatinere i inkubator ved 37 ° C uten forstyrrelse i 30-60 min.
- Kreftcellekultur på kollagen gel:
- Utføre tredimensjonale co-kultur ved hjelp av en tidligere rapportert protokoll med modifikasjoner 6.
- Resuspender kreftceller i 3D-ko-kulturmedium (eller i DMEM med 10% FBS i tilfelle av A549-celler) ved en tetthet på 1 x 10 5 / ml.
- Hell 2 ml av den resuspenderte celle-løsning (2 x 10 5 celler) på overflaten av hver gel. Endre celle antall kreftceller eller fibroblaster i co-kultur avhengig av eksperimentelle forhold.
- Gel sammentrekning:
- Inkuber geler over natten ved 37 ° C, slik at kreftcellene kan følge den kollagen-gelen. Løsner hver gel, og generere en "flytende kultur" i hver brønn of 6-brønns plate.
MERK: Ved å bruke en flytende kultur, ulike endringer i gel størrelse indusert av mekaniske spenninger og kollagen degradering, som er formidlet av mobilnettet interaksjon mellom co-kultivert kreftceller og fibroblaster. - Bruke en vinklet 21 G nål eller liten spatel for å skille hver gel fra kanten av brønnen. 2-3 dager, oppdatere brønnene med 2 ml av 3D ko-kulturmedium. Måle størrelsen på hver gel hver dag i 5 dager.
- Inkuber geler over natten ved 37 ° C, slik at kreftcellene kan følge den kollagen-gelen. Løsner hver gel, og generere en "flytende kultur" i hver brønn of 6-brønns plate.
- Analyse av kollagen gels:
- Mål kollageninnholdet i hver gel ved å bruke kollagen kvantiteringsstandarder metoder, slik som Sircol analysen. Utføre transcriptomic analyse eller kvantitativ RT-PCR etter å samle RNA fra gels 5.
3. Air-væske Interface Kultur og Invasion analysen
- Etter dyrking kollagen geler ved 37 ° C i 5 dager, utsettes de sammentrukne geler til luft ved å plassere dem på et mesh (70 um porestørrelse) i ny 6-brønners plater. Gjør mesh fra kommersielt tilgjengelige celle siler brukes for flowcytometri.
- Forsiktig fylle hver brønn med 11 ml 3D-ko-kulturmedium.
- Plasser gels på nettet ved hjelp av en steril skje, og fjerne eventuelle gjenværende medium fra geler. I denne tilstanden, senk geler i mediet mens eksponere den øvre overflaten av gelen til luft. Definere denne kulturen tilstand som luft-væske-grensesnittet.
MERK: Etter 5-7 dager for å opprettholde luft-væske-grensesnittet kultur ved 37 ° C i inkubatoren, invasive kreftceller migrere inn i gelen. Avhengig av celletypen og som et resultat av cellulære interaksjoner, er variable grader av celle morfologisk endring i kreftceller indusert ved luft-væske-grensesnittet kultur. - For histologisk evaluering, fikse gelen i formalin løsning over natten ved romtemperatur og bygge inn i parafin. Flekk vertikale seksjoner (4 mikrometer) med hematoxylin og eosin (H & E). Utføre immunhistokjemisk analyse on seksjonene 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette co-kultur metode, etterligne svulstens mikromiljø, er et nyttig verktøy for å undersøke samspillet mellom kreftceller og fibroblaster innebygd i kollagen gels. I forrige undersøkelse ble tre parametere evaluert i denne eksperimentelle modellen: kollagen gel sammentrekning, kreftcelle invasjon og morfologisk endring. Kreftcelle spredning ble også beregnet ved hjelp av Ki67 immunofarging 4. Lungevev Prøver ble samlet fra kreft og ikke-kreft seksjoner av en resektert lungelapp (figur 1A). Prøver ble hakket opp i små biter og dyrket i DMEM supplert med 10% FBS (figur 1B). Fibroblaster som vokser ut av vevet delen ble observert under mikroskop (figur 1C). Primære dyrkede lungefibroblaster ble innleiret i en kollagen-gel (figur 2A, a) og A549 lungekreftceller ble ko-dyrket på gelen (Figur 2A, B). Etter flytende cruk i mediet (figur 2A, c), gelen ble ytterligere dyrket under forutsetning av luft-væske-grenseflate (figur 2A, d). Gelen ble fiksert i formalin og anvendt for immunhistokjemiske analyser (figur 2A, E). For luft-væske-grensesnittet kultur ble gelen plasseres på et nett i en brønn på 6-brønners plate (figur 2B). Histologiske analyser av gelen viste invasjon av A549-celler i kollagen-gel innebygd med lungekreft-assosiert fibroblaster (figur 3).
Figur 1: utvekst av fibroblaster fra kirurgisk resected menneskelig lungevevet. (A) Prøver ble samlet fra kreft og ikke-kreft seksjoner av en resektert lunge lapp. (B) Prøver ble hakket opp i små biter og dyrket i DMEM supplert med 10% FBS.(C) Fibroblaster vokste ut av vevet seksjon (pil). Legg merke til at cellene migrert langs riper gjort av skalpellblader på kultur parabolen. Scale bar, 200 mikrometer.
Fig. 2: Luft-væske-grensesnittet kultur av kollagen-gel A549-celler ble ko-dyrket på en kollagen-gel innebygd med fibroblaster, og sjiktet av A549 celler ble eksponert for luft ved å plassere gelen på en maske i medium (A. ) Eksperimentelle prosedyrer for tredimensjonal ko-kultur og luft-væske-grenseflate. (a) Kollagen gel innebygd med lungefibroblaster. (b) A549-celler ko-dyrket i kollagen-gel. (c) Flytende kultur. (d) Luft- flytende grensesnitt (ALI). (E) Fiksering av gelen i formalin. (B) Representant bilde av the gel plasseres på duken i en brønn på 6-brønners plate. O / N: over natten.
Figur 3. hematoxylin og eosin farging av tverrsnitt av et tredimensjonalt dyrket gel bestående av A549-celler og humane lungefibroblaster. Merk at A549-celler dyrket i kollagen-gel invaderte gelen innebygd med fibroblaster (piler). Scale bar, 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kafeer utgjør en stor del av ECM rundt kreftceller og ikke bare gi et stillas for svulsten, men også delta aktivt i svulst utvikling 7. Akkumulere bevis avslører virkningen av kafeer eller deres nærstående molekyler på eventuell prognose, fremhever de kritiske roller CAF-mediert tumorprogresjon 8.
I forrige undersøkelse, benyttet vi utvekst metode for å isolere lunge kafeer fire. I dette eksperimentet, er opprettholdelsen av vev seksjonen adhesjon mot skåloverflaten kritisk. Celler er ikke i stand til å migrere ut av vevssnitt flytende i kulturmediet, og en gang vevssnittene løsne fra overflaten, kan de ikke lenger anvendes for celleutvekst på den samme dyrkningsskål. Skjæring av vevet gir eksudater, som tjener som lim for feste til skåloverflaten. Ved fastsettelse av vev seksjon med et dekkglass, er mengden fett brukes også Critical. Små mengder av fett ikke klarer å holde dekkglass festet, mens overflødig fett tilslører cellekulturområde. Vedlegg av vevssnitt ved hjelp av en dekkglass og riktig trykk er også en nøkkel til å tilrettelegge celleutvekst.
De eksperimentelle modeller for kreftcelle spredning og invasjonen har stolte for det meste på to-dimensjonale monolayer vev kulturer eller Boyden kammer analyser. For bedre å forstå inter kommunikasjon og ECM-avhengige modulering av kreft celle atferd, tredimensjonale co-kulturer er kraftige verktøy. Organotypiske kulturer er også nyttig for å undersøke flercellede interaksjoner, selv om de trenger høyere tekniske ferdigheter og eksperimentelle forhold er begrenset.
Vår co-kultur modell fungerer som en plattform for å evaluere tumor-stromal interaksjoner under forhold som etterligner svulsten mikromiljøet. Celler med bestemte genet overekspresjon eller knockdown er lett anvendelig i vår Culture system, noe som er en fordel i forhold organotypiske kultur. Spesielt våre tidligere observasjoner antydet at co-kultivert fibroblaster aktivt modulere kreftcelledifferensiering og invasjon 4. Det ville være av interesse å teste mulige flercellede interaksjoner i vår eksperimentelle omgivelser, for eksempel endotelceller, inflammatoriske celler og ikke-kreft epitelceller.
Distinkte kjennetegn kafeer har blitt demonstrert i co-kulturstudier eller ved genuttrykk profilering, med primær CAF kulturer og deres normale kolleger 9. På den annen side har disse studiene også vist intra-tumoral eller inter-individuell heterogenitet av kafeer 10, som delvis kan tilskrives ulike nivåer av vekstfaktor signale 11 eller transkripsjonsfaktor aktivering 12. Således er det viktig å ytterligere karakterisere heterogene kafeer avledet fra kreftpasienter 13. Etter gjentatte celle passasjer,karakteristikkene av primære dyrkede kafeer kan endres. Derfor ville det være bedre å karakter kafeer på tidlige passasjer.
Kafeer bidra til ECM deponering og ombygging, noe som i sin tur kan aktivere kafeer gjennom spenningen utløst cellesignalering. En slik mechanotransduction-mediert feed-forward løkke av CAF aktivering har blitt antydet 14, og vår kollagen gel sammentrekning modellen kan gi innsikt i disse mekanismene. Mekanismene for kollagen gel sammentrekning inkluderer celle sammentrekning, spredning, migrasjon, differensiering, og kollagen ombygging 15. Detalj histologiske studier og eksperimenter med ligander, hemmere, eller RNAi kan være nyttig å få en mekanistisk innsikt i tumor-stromal interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Collagen type IA | Nitta gelatin Inc. | CELL-1A | |
| Reconstitution buffer | Nitta gelatin Inc. | ||
| Cover slip | NUNC | 174934 | |
| Silicone grease | Dow Corning Toray | High vacuum grease | |
| Dispase I | WAKO | 386-02271 | |
| 6-well plate | BD Falcon | 353046 | |
| Cell strainer (70 μm) | BD Falcon | 352350 |
References
- Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).
- Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).
- Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62 (2014).
- Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
- Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).
- Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).
- Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).
- Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5 (5), e10747 (2010).
- Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
- Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).
- Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).
