Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

Protocol

NOTA: Este estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética apropriados.

1. cultura primária de pulmão fibroblastos humanos

1. Coleta de tecido pulmonar:
   1. Obter amostras de tecido pulmonar humanos da sala de operação cirúrgica diretamente. Recolha cerca de 1 cm a ³ quarteirões do tecido pulmonar cancerosos e não cancerosos, com a amostra não-cancerosas recolhido o mais longe possível do tumor.
   2. Suspender as amostras em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 0,25 ng / mL de anfotericina B (meio isento de soro). Manter as amostras em suspensão na estéreis tubos de 50 ml e transferir para o laboratório.
      NOTA: Os fibroblastos são altamente migratório e proliferativo em comparação com outros tipos de células, tais como epiteliais, células endoteliais e do músculo liso. O método excrescência aproveita esses recursos de fibroblastos, e outgrocélulas asa de cortes de tecido são abundantes em fibroblastos. Depois de várias passagens de células, outros tipos de células não conseguem sobreviver e propagar em DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS), resultando em culturas de células de fibroblastos purificadas. As células podem ser usadas 3-7 passagens seguintes cultura primária.
2. Cultura explante e condicionado para crescimento celular:
   1. Execute cultura primária de fibroblastos, utilizando um protocolo previamente notificados com modificações ^5.
   2. No laboratório, colocar a amostra de tecido em 10 cm de prato de cultura de tecidos sem meio de cultura e cortado em pequenos troços ~ 2-3 mm de tamanho usando fórceps esterilizados e bisturi. Durante este processo, evitar que a secção seca, de outro modo a eficiência da excrescência da célula é prejudicado.
3. A separação da camada de células epiteliais e do tecido conjuntivo:
   1. Embeber as secções de tecido cortado em meio de cultura contendo 2,000 PU / ml de dispase I e cultura durante 16 horas a 4 ° C. </ Li>
   2. Transferem-se as secções de tecido para um prato, e separar a camada de células epiteliais do tecido conjuntivo adjacente. Processe as seções em uma bancada limpa para evitar a contaminação de microorganismos.
      NOTA: Se for necessário a cultura primária de células epiteliais, executar o passo 1.3. Se apenas os fibroblastos estão a ser isolado, omitir o passo 1.3 porque a cultura explante e celulares passagens subsequentes são desfavoráveis ​​para as células epiteliais, que produzem populações de fibroblastos purificados.
4. Penhora de cortes de tecido:
   1. Picar os tecidos em um milímetro pedaços usando dois bisturis. Se as peças não são suficientemente pequenas, elas retirar mais facilmente a partir da placa, e as células irão falhar a ultrapassar na superfície do prato.
   2. Coloque pequenas secções de tecido pulmonar afastados um do outro para manter um espaço vazio em torno de cada peça. Adicione arranhões na superfície do prato de cultura de tecido usando uma lâmina de bisturi para facilitar a ligação de secções de tecido.
      NOTA: CoçarTambém parece facilitar a excrescência de células, proporcionando faixas ao longo do qual as células podem migrar.
      1. Em alternativa, colocar as peças de tecidos picados, individualmente, em cada poço de uma placa de 6 poços, e cobri-los com uma lamela de cobertura. Fixe a tampa de deslizamento para a superfície da placa usando graxa de silicone.
      2. Coloque graxa de silicone em dois pontos 1.5 cm de distância em cada poço, utilizando um pino estéril. Cobertura de pedaços de tecido aumenta a eficácia do crescimento de células e propagação de células após diversas passagens.
5. Subsequente cultura explante:
   1. Adicionar cuidadosamente meio de cultura para o prato antes de as secções de tecido de secar, como crescimento celular eficaz é perdido para a maior parte, se as amostras secarem. Não despeje o meio muito rapidamente como as secções de tecido seria separar.
   2. Células de cultura em DMEM com 10% de FBS. Use médio suficiente apenas para cobrir o tecido, mas não muito que ele permite flutuante, como flutuabilidade adicional promove a separação doprato.
6. Passagem Cell:
   1. Lidar com o meio de cultura com cuidado em todos os momentos como movimentos repetidos da placa de cultura pode levar ao descolamento dos cortes de tecido.
   2. Colocar as placas de cultura numa incubadora a 37 ° C durante 5-7 dias. Atualizar o meio todos os dias, e lidar com as placas de cultura minimamente durante as médias alterações. Os fibroblastos superar a partir da borda das secções de tecido ao longo das próximas semanas.
      NOTA: ~ Após 2-3 semanas, os fibroblastos superando quase atingem confluência, dependendo da quantidade de área de superfície.
   3. Lavar as células com PBS 1x, e adicionar 1 ml de tripsina I do prato.
   4. Após tripsinização, separar as células utilizando 9 ml de DMEM suplementado com FBS a 10%. Recolher as células em suspensão no meio de um tubo de 10 ml, juntamente com as secções de tecido. A seguir à centrifugação para formar sedimentos celulares, ressuspender as peletes resultantes em meio novo.
   5. Semente as células e os cortes de tecido para um novo culture prato, altura em que os tecidos não conseguem anexar ao prato, enquanto as células aderir e crescer. No dia seguinte, retire os pedaços de tecido flutuantes por aspiração, e mudar o meio. Fibroblastos anexados propagar com culturas subsequentes.

2. tridimensional Co-cultura de fibroblastos humanos pulmão e células cancerosas

1. Preparação de células e reagentes:
   1. Aproximadamente usar 2 x 10 ⁵ células epiteliais e 2,5 x 10 ⁵ fibroblastos por poço. Prepare o colagénio tipo IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), tampão de reconstituição (NaOH 50 mM, 260 mM de _NaHCO3, 200 mM de HEPES), 5x de DMEM, meio DMEM suplementado com FBS a 10% para a cultura de fibroblastos, e um meio de co-cultura em 3D (uma mistura 1: 1 de meio de cultura de fibroblastos e meio de cultura para as células cancerosas).
   2. Células de adenocarcinoma do pulmão A549, a cultura, os fibroblastos e a co-cultura 3D A549 em DMEM suplementado com FBS a 10%.
2. O colagénio em gel de formação:
   1. Lavar fibroblastos em cultura em placa de 10 cm com 1x PBS, e adicionar 1 ml de tripsina I do prato. Após tripsinização durante ~ 5 min a 37 ° C, separar as células utilizando 9 mL de DMEM suplementado com FBS a 10%. Recolher as células em suspensão no meio num tubo de 10 ml e centrifugar para a 200-300 xg para formar sedimentos celulares.
   2. Ressuspender as peletes resultantes em 100% de FBS a uma densidade de 5 x 10 ⁵ / ml.
   3. Prepare o gel de colagénio em gelo. Arrefecer os reagentes, pipetas e tubos no frigorífico antes do procedimento seguinte. Mesmo em gelo, a mistura solidifica, em certa medida, e o volume total é menor do que a soma de todos os constituintes.
   4. Em cada poço, preparar o gel de colagénio por mistura de 0,5 ml de suspensão de fibroblastos (2,5 x 10 ⁵ células) em FBS, 2,3 ml de colagénio do tipo IA, 670 ul de DMEM 5x, e 330 ul de tampão de reconstituição. Permitir que os geles para definir facilmente à temperatura ambiente.
      1. Vigorosamente pipeta de modo que a mi homogéneaxture. Evite a criação de bolhas durante o processo de pipetagem.
   5. Adicionar a mistura de (3 ml) a cada poço de uma placa de 6 poços e deixa-se gelatinizar na incubadora a 37 ° C, sem perturbação durante 30-60 min.
3. Cultura de células do cancro no gel de colagénio:
   1. Execute co-cultura tridimensional usando um protocolo previamente notificados com modificações ^6.
   2. Ressuspender as células cancerosas em meio de co-cultura em 3D (ou em DMEM com FBS a 10%, no caso de células A549) a uma densidade de 1 x 10 ⁵ / ml.
   3. Pour 2 ml da solução de células ressuspenso (2 x 10 ⁵ células) sobre a superfície de cada gel. Modifique o número de células de células cancerosas ou fibroblastos em co-cultura, dependendo das condições experimentais.
4. Contração gel:
   1. Incubar géis noite a 37 ° C de modo que as células cancerosas podem aderir ao gel de colagénio. Separe cada gel, e gerar uma "cultura flutuante 'em cada poço of a placa de 6 poços.
      NOTA: Ao utilizar uma cultura flutuante, várias modificações no tamanho de gel são induzidas por tensão mecânica e degradação do colagénio, que são mediados por interacção celular entre as células cancerosas e fibroblastos co-cultivadas.
   2. Utilize uma agulha G 21 angular ou pequena espátula para separar cada um gel a partir do bordo do poço. A cada 2-3 dias, atualizar os poços com 2 ml de meio 3D co-cultura. Medir o tamanho de cada gel todos os dias durante 5 dias.
5. Análise de géis de colagénio:
   1. Meça o conteúdo de colágeno de cada gel, utilizando métodos de quantificação de colágeno, tais como o ensaio Sircol. Realizar análise do transcriptoma ou RT-PCR quantitativo após a recolha de RNA a partir dos géis ^5.

Cultura da Interface e Invasion Ensaio 3. Air-líquido

1. Após cultura das géis de colagénio a 37 ° C durante 5 dias, expor os géis contraídos para o ar, colocando-os sobre uma malha (70 de tamanho de poro) no novo 6-placas de poços. Faça a malha a partir de filtros celulares disponíveis comercialmente usados ​​para citometria de fluxo.
2. Suavemente encher cada poço com 11 ml de 3D meio de co-cultura.
3. Posicionar os géis para a malha usando uma colher esterilizada, e remover qualquer meio remanescente dos géis. Nesta condição, submergir em geles a forma enquanto expor a superfície superior do gel de ar. Definir essa condição cultura como interface de ar líquido.
   NOTA: Depois de 5-7 dias de manutenção da cultura de interface ar-líquido, a 37 ° C na incubadora, as células cancerosas invasivas migrar para dentro do gel. Dependendo do tipo de célula e, como resultado de interacções celulares, graus variáveis ​​de alterações morfológicas em células, as células cancerosas são induzidas pela cultura de interface ar-líquido.
4. Para a avaliação histológica, fixar o gel em formol durante a noite a temperatura ambiente e incorporar em parafina. Mancha seções verticais (4 mm) com HE (H & E). Realizar análise imuno-histoquímica on as seções ^4.

Representative Results

Este método de co-cultura, imitando o microambiente tumoral, é uma ferramenta útil para pesquisar as interacções entre as células cancerosas e fibroblastos embebidos no gel de colagénio. No estudo anterior, os três parâmetros foram avaliados neste modelo experimental: contração gel de colágeno, a invasão das células do câncer e alteração morfológica. Proliferação de células cancerosas também foi estimado usando Ki67 immunostaining ^4. Amostras de tecido pulmonar foram colhidos a partir de secções cancerosas e não cancerosas de um lobo pulmonar ressecado (Figura 1A). As amostras foram picadas em pequenos pedaços e cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10% (Figura 1B). Os fibroblastos crescem para fora da secção de tecido foram observadas sob o microscópio (Figura 1C). Fibroblastos de pulmão de cultura principal foram embebidos num gel de colagénio (Figura 2A, a) e células de cancro do pulmão A549 foram co-cultivados sobre o gel (figura 2A, b). Após c flutuanteultura no meio (Figura 2A, c), o gel foi ainda cultivadas sob a condição de interface ar-líquido (Figura 2A, d). O gel foi fixado em formalina e utilizados para análises de imuno-histoquímica (Figura 2A, e). Para a cultura de interface ar-líquido, o gel foi colocado numa rede em um poço de placa de 6 poços (Figura 2B). As análises histológicas do gel revelado invasão de células A549 no gel de colagénio encaixado com fibroblastos associados a cancro de pulmão (Figura 3).

Figura 1: Conseqüência de fibroblastos de tecido do pulmão humano ressecadas cirurgicamente. (A) As amostras foram recolhidas a partir de secções cancerosas e não cancerosas de um lobo pulmonar ressecado. (B) As amostras foram picadas em pequenos pedaços e cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10%.(C) Os fibroblastos cresceu a partir da secção de tecido (seta). Note-se que as células migraram ao longo dos riscos feitos por as lâminas de bisturi, na antena de cultura. Barra de escala, de 200 mm.

Figura 2:. Cultura de interface ar-líquido do gel de colagénio As células A549 foram co-cultivadas num gel de colagénio com os fibroblastos incorporado, e a camada de células A549 foram expostos ao ar, colocando o gel sobre uma malha em forma (A. ) Procedimentos experimentais de tridimensional de co-cultura e da interface ar-líquido. (a) O gel de colagénio encaixado com fibroblastos de pulmão. (b) células A549 co-cultivados sobre o gel de colagénio. (c) cultura de flutuação. (d) Ar- interface líquido (ALI). (E) Fixação do gel em formol. (B) imagem Representante do the colocado sobre o gel de malha em um poço de placa de 6 poços. O / N: durante a noite.

Figura 3. Coloração de Hematoxilina-eosina de secções transversais de um gel tridimensionalmente cultivadas composto por células A549 e fibroblastos de pulmão humanos. Note-se que as células A549 cultivadas sobre o gel de colagénio invadiram o gel incorporado com fibroblastos (setas). Barra de escala, 200 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

FAC formam um dos principais componentes da MEC células cancerosas e não apenas fornecer um andaime para o tumor, mas também participar activamente no desenvolvimento do tumor ^7. As evidências acumuladas desvenda o impacto da FAC ou suas moléculas relacionadas à eventual prognóstico, com destaque para os papéis críticos de progressão do tumor CAF mediada ^8.

No estudo anterior, foram empregados método consequência de isolar FAC pulmonares ^4. Nesta experiência, a manutenção da secção de tecido de adesão sobre a superfície do prato é crítica. As células são incapazes de migrar para fora a partir de secções de tecido que flutuam no meio de cultura, e uma vez que as secções de tecido de ruptura da superfície, já não podem ser usadas para crescimento de células no mesmo prato de cultura. O corte do tecido produz os exsudados, que servem como uma cola para a fixação à superfície do prato. Ao fixar a secção de tecido com uma lamela, a quantidade de graxa utilizada também é critical. Pequenas quantidades de gordura não conseguem manter o deslizamento tampa instalada, quando a graxa excessiva obscurece a área de cultura de células. Penhora de cortes de tecido, utilizando uma lâmina de cobertura e a pressão adequada é também uma chave para facilitar crescimento celular.

Os modelos experimentais para a proliferação de células cancerosas e invasão ter confiou em culturas de tecido em monocamada bidimensionais ou ensaios de câmara de Boyden. Para entender melhor a comunicação intercelular e modulação dependente de ECM do comportamento das células do câncer, tridimensionais co-culturas são ferramentas poderosas. Culturas organot�icas também são úteis para a investigação de interações multicelulares, embora eles precisam de habilidades técnicas mais elevadas e condições experimentais são limitadas.

Nosso modelo de co-cultura serve como uma plataforma para avaliar as interações de tumor estromal-em condições que imitam o microambiente do tumor. As células com superexpressão de genes específicos ou knockdown são facilmente aplicáveis ​​em nossa culture sistema, o que é uma vantagem sobre a cultura organotípica. Notavelmente, as nossas observações anteriores sugeriram que os fibroblastos co-cultivadas activamente modular a diferenciação de células de cancro e invasão ^4. Seria de interesse para testar possíveis interacções multicelulares na nossa configuração experimental, tais como as células endoteliais, as células inflamatórias e as células epiteliais não-cancerosas.

Características distintas do FAC foram demonstradas em estudos de co-cultura ou por Perfil de expressão gênica, utilizando culturas CAF primárias e suas contrapartes normais ^9. Por outro lado, esses estudos também têm demonstrado a heterogeneidade intra-tumoral ou inter-individual da FAC ^10, parte do que pode ser atribuído a diferentes níveis de fator de crescimento de sinalização ¹¹ ou fator de transcrição ativação ^12. Assim, é essencial para caracterizar adicionalmente FAC heterogéneos derivados de ¹³ pacientes com cancro. Após passagens celulares repetidas,as características de FAC de cultura principal pode ser modificado. Portanto, seria melhor para caracterizar FAC nas primeiras passagens.

FAC contribuir para a deposição de ECM e de remodelação, o qual, por sua vez, podem activar a sinalização celular através de FAC desencadeada-tensão. Essa ponte feed-forward mediada por mechanotransduction de ativação CAF tem sido sugerido ^14, e nosso modelo de contração gel de colágeno pode fornecer insights sobre esses mecanismos. Os mecanismos de contracção de gel de colagénio incluem a contracção celular, proliferação, migração, diferenciação, remodelação do colagénio e ^15. Estudos e experimentos histológicos detalhados usando ligantes, inibidores, ou RNAi pode ser útil para obter uma visão mecanicista em interações de tumor estromal-.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
FBS	GIBCO	10437
Collagen type IA	Nitta gelatin Inc.	CELL-1A
Reconstitution buffer	Nitta gelatin Inc.
Cover slip	NUNC	174934
Silicone grease	Dow Corning Toray	High vacuum grease
Dispase I	WAKO	386-02271
6-well plate	BD Falcon	353046
Cell strainer (70 μm)	BD Falcon	352350