Protocol
LET OP: Deze studie werd goedgekeurd door de bevoegde ethische commissies.
1. Primaire cultuur van de mens longfibroblasten
- Het verzamelen van longweefsel:
- Verkrijgen menselijk longweefsel monsters uit de chirurgische operatiekamer direct. Verzamel ongeveer 1 cm 3 blokken van kankerachtige en niet-kankerachtige longweefsel met de niet-kwaadaardige monster verzameld ver van de tumor mogelijk.
- Suspendeer de monsters in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,25 pg / ml amfotericine B (serumvrij medium). Handhaaf de monsters gesuspendeerd in steriele 50 ml buizen en overbrengen naar het laboratorium.
OPMERKING: Fibroblasten zijn sterk migrerende en proliferatieve vergelijking met andere celtypen, zoals epitheel, endotheel en gladde spiercellen. De uitgroei methode maakt gebruik van deze functies van fibroblasten, en outgrowing cellen van weefsel secties zijn er in overvloed in fibroblasten. Na diverse overentingen andere celtypen niet overleven en voortplanten in DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS), resulterend in gezuiverde fibroblast celkweken. De cellen kunnen worden gebruikt 3-7 passages na primaire cultuur.
- Explantaatkweek en conditionering voor mobiele uitgroei:
- Voeren primaire cultuur van fibroblasten met behulp van een eerder gemelde protocol met aanpassingen 5.
- In het laboratorium, plaats het weefselmonster op een 10 cm weefselkweekschaal zonder kweekmedium en in kleine secties ~ 2-3 mm groot met steriele pincet en een scalpel. Daarbij vermijdt de sectie droge, anders de efficiëntie van de cel uitgroei wordt aangetast.
- Scheiding van de epitheliale cellaag en bindweefsel:
- Week de cut weefselcoupes in kweekmedium bevattende 2000 PU / ml Dispase I en kweek gedurende 16 uur bij 4 ° C. </ Li>
- Breng de weefselcoupes een schotel, en scheiden de epitheliale cellaag van het aangrenzende bindweefsel. Verwerk de secties in een schone werkbank om verontreiniging van micro-organismen te voorkomen.
OPMERKING: Als de primaire cultuur van epitheelcellen nodig is, stap 1.3 uit te voeren. Als alleen fibroblasten zijn om geïsoleerd te worden, wordt punt 1.3, omdat de daaropvolgende explantaatkweek en celpassages zijn ongunstig voor de epitheelcellen, die gezuiverd fibroblast populatie opleveren.
- Aanhechting van weefsel secties:
- Hak de weefsels tot 1 mm gesneden met twee scalpels. Als de stukken zijn niet klein genoeg, dat MOET gemakkelijker uit de schaal en de cellen niet ontgroeien op de schotel oppervlak.
- Plaats kleine longweefsel secties van elkaar naar een leeg gebied rond elk stuk handhaven. Maak krassen op het oppervlak van de weefselkweekschaal met een scalpel om hechting van weefselcoupes vergemakkelijken.
OPMERKING: KrassenOok lijkt cel uitgroei bevorderen, waardoor sporen waarlangs cellen kunnen migreren.- Als alternatief, plaats gehakt weefsel stukken individueel in elk putje van een 6-wells plaat, en bedek ze met een dekglas. Bevestig het deksel slip aan het oppervlak van de plaat met behulp van siliconenvet.
- Plaats siliconenvet op twee punten van 1,5 cm van elkaar in elk putje met behulp van een steriele pin. Dekking van het weefsel stukken verhoogt de effectiviteit van de cel uitgroei en cel voortplanting na verscheidene passages.
- Daaropvolgende explantaatkweek:
- Voeg voorzichtig kweekmedium de schaal voor de weefselcoupes uitdrogen zo efficiënt cel uitgroei verloren grotendeels indien de monsters uitdrogen. Wees niet te snel als het weefsel secties zou losmaken giet het medium.
- Kweekcellen in DMEM met 10% FBS. Gebruik voldoende medium om alleen het weefsel omvatten, maar niet zo veel dat het mogelijk maakt drijven, als extra drijfvermogen bevordert onthechting van degerecht.
- Passage van de cellen:
- Behandel het kweekmedium met zorg te allen tijde als herhaalde bewegingen van de cultuur schotel kan leiden tot onthechting van het weefsel secties.
- Plaats de kweekschalen in een incubator bij 37 ° C gedurende 5-7 dagen. Vernieuw het medium om de andere dag, en omgaan met de cultuur gerechten minimaal tijdens het medium verandert. Fibroblasten ontgroeien van de rand van het weefsel secties in de komende weken.
OPMERKING: Na ~ 2-3 weken uitgroeiende fibroblasten bijna confluentie bereiken, afhankelijk van de hoeveelheid oppervlak. - Was de cellen met 1x PBS, en voeg 1 ml trypsine ik aan de plaat.
- Na trypsinisatie, los de cellen met 9 ml DMEM aangevuld met 10% FBS. Verzamel cellen gesuspendeerd in het medium in een 10 ml buis, samen met de weefselcoupes. Na centrifugatie naar cel pellets, resuspendeer de verkregen pellets in het nieuwe medium.
- Zaad de cellen en weefselcoupes op een nieuw cultuur schotel, waarna het weefsel niet hechten aan de schotel, terwijl de cellen hechten en te groeien. De volgende dag, verwijder de drijvende stukken weefsel door aspiratie, en verander het medium. Bijgevoegde fibroblasten propageren met latere culturen.
2. Driedimensionale Co-cultuur van de Mens longfibroblasten en kankercellen
- Bereiding van cellen en reagentia:
- Ongeveer gebruik 2 x 10 5 epitheelcellen en 2,5 x 10 5 fibroblasten per putje. Bereid collageen type IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), reconstitutie buffer (50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES), 5x DMEM, DMEM aangevuld met 10% FBS voor fibroblast cultuur, en een 3D co-kweekmedium (een 1: 1 mengsel van fibroblast kweekmedium en kweekmedium voor kankercellen).
- Cultuur A549 long adenocarcinoom cellen, fibroblasten en A549 3D co-cultuur in DMEM aangevuld met 10% FBS.
- Collageen gel formatie:
- Was fibroblasten gekweekt op 10 cm schotel met 1x PBS, en voeg 1 ml trypsine ik aan de plaat. Na behandeling met trypsine gedurende ~ 5 min bij 37 ° C, los de cellen met 9 ml DMEM aangevuld met 10% FBS. Verzamel cellen gesuspendeerd in het medium in een 10 ml buis en centrifugeer ze op 200-300 xg naar cel pellets.
- Resuspendeer de verkregen pellets 100% FBS bij een dichtheid van 5 x 10 5 / ml.
- Bereid de collageen-gel op ijs. Koel de reagentia, pipetten en buizen in een koelkast voor de volgende procedure. Zelfs op ijs, het mengsel stolt enigszins, en het totale volume kleiner is dan de som van alle bestanddelen.
- In elk putje, de voorbereiding van de collageen-gel door het mengen van 0,5 ml van fibroblast suspensie (2,5 x 10 5 cellen) in FBS, 2,3 ml type IA collageen, 670 ul 5x DMEM, en 330 ul reconstitutie buffer. Laat de gels gemakkelijk ingesteld op kamertemperatuur.
- Krachtig pipet om een homogene mi zorgenxture. Vermijd het creëren van bubbels tijdens het pipetteren proces.
- Voeg het mengsel (3 ml) aan elk putje van een 6-wells plaat en laat gelatineren in de incubator bij 37 ° C ongestoord gedurende 30-60 min.
- Kankercel cultuur op het collageen gel:
- Voer driedimensionaal co-cultuur met een eerder beschreven protocol met 6 modificaties.
- Resuspendeer kankercellen in de 3D co-kweekmedium (of DMEM met 10% FBS bij A549 cellen) in een dichtheid van 1 x 10 5 / ml.
- Giet 2 ml van de geresuspendeerde cellen (2 x 10 5 cellen) op het oppervlak van elke gel. Wijzig cel aantal kankercellen of fibroblasten in co-kweek afhankelijk van experimentele omstandigheden.
- Gel samentrekking:
- Incubeer gels overnacht bij 37 ° C zodat de kankercellen kan hechten aan de collageengel. Losmaken elke gel, en het genereren van een 'zwevende cultuur' in elk putje of 6-wells plaat.
Opmerking: Door een zwevende cultuur, zijn verschillende veranderingen in gel omvang veroorzaakt door mechanische spanning en collageen afbraak, die worden gemedieerd door cellulaire interactie tussen co-gekweekte kankercellen en fibroblasten. - Gebruik een schuine 21 G naald of kleine spatel elke gel scheiden van de rand van de put. Elke 2-3 dagen, ververs de putjes met 2 ml 3D co-kweekmedium. Meet de grootte van elke gel elke dag gedurende 5 dagen.
- Incubeer gels overnacht bij 37 ° C zodat de kankercellen kan hechten aan de collageengel. Losmaken elke gel, en het genereren van een 'zwevende cultuur' in elk putje of 6-wells plaat.
- Analyse van collageen gels:
- Meet het collageengehalte van elke gel met collageen kwantificatie werkwijzen, zoals Sircol assay. Voer transcriptoom analyse of kwantitatieve RT-PCR na het verzamelen van RNA uit de gels 5.
3. Air-vloeistof Interface Cultuur en Invasion Assay
- Na het kweken van de collageen gel bij 37 ° C gedurende 5 dagen, bloot de gecontracteerde gels lucht door ze op een mesh (70 um poriegrootte) in nieuwe 6-well platen. Maak het gaas uit commercieel beschikbare mobiele filters gebruikt voor flowcytometrie.
- Vullen zachtjes elk putje met 11 ml van 3D co-kweekmedium.
- Plaats de gels op het gaas met een steriele lepel, en verwijder alle resterende medium uit de gels. Op deze voorwaarde, onderdompelen gels in het medium terwijl het bovenoppervlak van de gel bloot aan de lucht. Definieer deze cultuur staat als lucht-water grensvlak.
OPMERKING: Na 5-7 dagen handhaven lucht-water grensvlak kweek bij 37 ° C in de incubator, invasieve kankercellen migreren in de gel. Afhankelijk van het celtype en als gevolg van cellulaire interacties, wordt een variabele mate van cel morfologische veranderingen in de kankercellen geïnduceerd door de lucht-vloeistof grensvlak kweek. - Voor histologische evaluatie, bevestig de gel in formaline oplossing overnacht bij kamertemperatuur en inbedden in paraffine. Vlek verticale secties (4 micrometer) met hematoxyline en eosine (H & E). Voeren immunohistochemische analyse on de hoofdstukken 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze samenwerking kweekmethode nabootsen van de tumor micro-omgeving is een nuttig hulpmiddel om de interacties tussen kankercellen en fibroblasten ingebed in collageen gels onderzoeken. In de vorige studie werden drie parameters geëvalueerd in dit experimentele model: collageengel contractie, kankercel invasie en morfologische verandering. Kankercelproliferatie werd ook geschat met behulp van Ki67 immunostaining 4. Lung weefselmonsters werden verzameld van kankerachtige en niet-kankerachtige gedeelten van een resectie long kwab (Figuur 1A). Monsters werden gehakt in kleine stukjes en gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS (Figuur 1B). Fibroblasten groeien uit de sectie weefsel werden waargenomen onder de microscoop (figuur 1C). Primaire gekweekte long fibroblasten werden ingebed in een collageen gel (figuur 2A, a) en A549 longkankercellen werden samen gekweekt op de gel (figuur 2A, B). Na drijvende cultuur in het medium (Figuur 2A, c), de gel werd verder gekweekt onder voorwaarde air-vloeistof interface (Figuur 2A, d). De gel werd gefixeerd in formaline en voor immunohistochemische analyses (figuur 2A, e). Voor lucht-vloeistof-grensvlak kweek, werd de gel op een gaas geplaatst in een putje van 6-well plaat (Figuur 2B). Histologische analyses van de gel onthulde invasie van A549 cellen in de collageengel ingebed met longkanker-geassocieerde fibroblasten (Figuur 3).
Figuur 1: uitgroei van fibroblasten van chirurgisch weggesneden menselijk longweefsel. (A) De monsters werden verzameld van kankerachtige en niet-kankerachtige gedeelten van een resectie long kwab. (B) De monsters werden in kleine stukjes gehakt en gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS.(C) fibroblasten groeide uit van de sectie weefsel (pijl). Merk op dat de cellen gemigreerd langs de krassen door de scalpelmesjes op de kweekschaal. Schaal bar, 200 micrometer.
Figuur 2:. Lucht-vloeistof grensvlak kweek van de collageengel A549-cellen werden tezamen gekweekt op een collageengel ingebed met fibroblasten en de laag van A549 cellen blootgesteld aan lucht door het plaatsen van de gel op een maas in medium (A. ) Experimentele procedures van driedimensionale co-cultuur en lucht-water grensvlak. (a) Collageen gel ingebed met long fibroblasten. (b) A549-cellen co-gekweekt op de collageengel. (c) Floating kweek. (d) Air- vloeistof interface (ALI). (E) Fixatie van de gel in formaline. (B) representatief beeld van the gel geplaatst op het gaas in een putje van 6-wells plaat. O / N: 's nachts.
Figuur 3. hematoxyline en eosine kleuring van dwarsdoorsneden van een driedimensionaal gekweekt gel uit A549 cellen en humane long fibroblasten. Let A549 cellen gekweekt op de collageengel vielen de gel ingebed met fibroblasten (pijlen). Schaal bar, 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAF vormen een belangrijke component van de ECM omringende kankercellen en niet alleen een ondersteuning voor de tumor, maar ook actief deelnemen aan tumorontwikkeling 7. Accumuleren bewijs ontrafelt de impact van CAF of hun verwante moleculen op de uiteindelijke prognose, aandacht voor de cruciale rol van de CAF-gemedieerde tumorprogressie 8.
In eerder onderzoek gebruikten we uitgroei methode long CAF 4 isoleren. In dit experiment, de handhaving van weefselsectie hechting op het schaaloppervlak kritisch. Cellen zijn in staat om te migreren van weefselcoupes drijvend in het kweekmedium, en wanneer de weefselcoupes loskomen van het oppervlak, kan deze niet langer worden gebruikt voor cel uitgroei op dezelfde kweekschaal. Het snijden van het weefsel levert uitscheidingen, die als lijm voor bevestiging aan de schotel oppervlak. Bij de vaststelling van de sectie weefsel met een dekglas, de hoeveelheid vet gebruikt is ook critical. Kleine hoeveelheden vet niet aan de dekglas bevestigd te houden, terwijl een overmaat aan smeervet verduistert de celkweek gebied. Aanhechting van weefsel secties met behulp van een dekglas en de juiste druk is ook een sleutel tot het faciliteren cel uitgroei.
De experimentele modellen voor kanker cel proliferatie en de invasie hebben vooral vertrouwd op tweedimensionale monolaag weefsel culturen of Boyden kamer assays. Om beter te begrijpen intercellulaire communicatie en ECM-afhankelijke modulatie van kankercel gedrag, driedimensionaal co-culturen zijn krachtige hulpmiddelen. Organotypische kweken zijn ook bruikbaar voor het onderzoeken meercellige interacties, maar ze moeten ook meer techniek en experimentele omstandigheden beperkt.
Onze co-cultuur model dient als een platform om tumor-stroma interacties te evalueren onder omstandigheden nabootsen van de tumor micro-omgeving. Cellen met een specifiek gen overexpressie of knock-down zijn eenvoudig toepasbaar in onze culture, dat is een voordeel boven organotypische kweek. Met name onze eerdere opmerkingen gesuggereerd dat co-gekweekte fibroblasten actief moduleren kankercel differentiatie en invasie 4. Het zou interessant mogelijke meercellige interacties in onze experimentele omgeving, zoals endotheelcellen, inflammatoire cellen en niet-kwaadaardige epitheliale cellen te testen.
Verschillende kenmerken van de CAF zijn aangetoond in co-cultuur studies of door genexpressie profilering, met behulp van primaire CAF culturen en hun normale tegenhangers 9. Anderzijds hebben deze studies ook aangetoond intratumorale of interindividuele heterogeniteit van CAF 10, waarvan een deel kan worden toegeschreven aan verschillende groeifactor signalering 11 of transcriptiefactoractivatie 12 zijn. Het is dus essentieel om verder te karakteriseren heterogene CAF afkomstig van kankerpatiënten 13. Na herhaalde cell passages,de kenmerken van primaire gekweekte CAF kan worden gewijzigd. Daarom zou het beter zijn om CAF karakteriseren op vroege passages.
CAF bijdragen aan ECM-depositie en verbouwing, die op zijn beurt, kan CAF door spanning veroorzaakt celsignalering activeren. Zo'n-mechanotransduction gemedieerde feed-forward loop van CAF activering is gesuggereerd 14, en onze collageen gel samentrekking model kan inzicht in deze mechanismen te voorzien. De mechanismen van collageengel contractie omvatten celcontractie, proliferatie, migratie, differentiatie en collageen remodeling 15. Gedetailleerde histologische studies en experimenten met liganden, remmers, of RNAi kan nuttig zijn om een mechanistisch inzicht in tumor-stroma interacties te krijgen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Collagen type IA | Nitta gelatin Inc. | CELL-1A | |
| Reconstitution buffer | Nitta gelatin Inc. | ||
| Cover slip | NUNC | 174934 | |
| Silicone grease | Dow Corning Toray | High vacuum grease | |
| Dispase I | WAKO | 386-02271 | |
| 6-well plate | BD Falcon | 353046 | |
| Cell strainer (70 μm) | BD Falcon | 352350 |
References
- Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).
- Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).
- Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62 (2014).
- Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
- Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).
- Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).
- Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).
- Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5 (5), e10747 (2010).
- Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
- Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).
- Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).
