Protocol
HINWEIS: Diese Studie wurde von den zuständigen Ethikkommissionen genehmigt.
1. Primär Kultur der menschliche Lungen-Fibroblasten
- Sammlung von Lungengewebe:
- Erhalten menschlichen Lungengewebeproben aus dem Operationsraum unmittelbar. Sammeln Sie ca. 1 cm 3 Blocks von krebsartigen und nicht krebsartigen Lungengewebe, die nicht krebsartigen Probe so weit weg von den Tumor wie möglich gesammelt.
- Aussetzung der Proben in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,25 ug / ml Amphotericin B (serumfreies Medium) ergänzt. Pflegen Sie die suspendierten Proben in sterilen 50-ml-Röhrchen und übertragen an das Labor.
HINWEIS: Die Fibroblasten sind hoch Migration und Proliferation im Vergleich zu anderen Zelltypen, wie Epithelzellen, Endothelzellen und glatten Muskelzellen. Der Auswuchs Verfahren nutzt diese Features von Fibroblasten und outgroFlügelzellen aus Gewebeschnitten sind reichlich in Fibroblasten. Nach mehreren Zellpassagen anderen Zelltypen nicht zu überleben und vermehren sich in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), wodurch gereinigte Fibroblasten-Zellkulturen. Die Zellen könnten 3-7 Passagen folgenden Primärkultur verwendet werden.
- Explantatkultur und Anlage für Zell Auswuchs:
- Führen Primärkultur von Fibroblasten mit einem zuvor berichtet Protokoll mit Modifikationen 5.
- Im Labor, legen Sie die Gewebeprobe auf einer 10 cm Gewebekulturschale ohne Kulturmedium und in kleine Stücke geschnitten ~ 2-3 mm Größe mit einer sterilen Pinzette und Skalpell. Dabei verhindern, dass die trockenen Abschnitt, da sonst die Wirksamkeit der Zellauswuchs beeinträchtigt wird.
- Trennung der epithelialen Zellschicht und Bindegewebe:
- Tränken der geschnittenen Gewebeabschnitte in Kulturmedium, das 2000 PU / ml Dispase I und die Kultur für 16 Stunden bei 4 ° C. </ Li>
- Übertragen Sie die Gewebeschnitte in eine Schale, und trennen Sie die Epithelzellschicht vom benachbarten Bindegewebe. Verarbeiten Sie die Abschnitte in einer Sterilbank, um eine Kontamination von Mikroorganismen zu vermeiden.
HINWEIS: Wenn der Primärkultur von Epithelzellen ist erforderlich, führen Sie Schritt 1.3. Wenn nur Fibroblasten isoliert werden sollen, lassen Sie Schritt 1.3, da die nachfolgenden Explantatkultur und Zellpassagen ungünstig für Epithelzellen, die gereinigte Fibroblasten-Populationen zu erhalten sind.
- Befestigung von Gewebeschnitten:
- Hackfleisch das Gewebe in 1 mm Stücke mit zwei Skalpelle. Wenn die Stücke nicht klein genug sind, leicht löst sie aus der Schale, und die Zellen werden nicht auf der Geschirroberfläche hinauswachsen.
- Legen Sie kleine Lungengewebe Abschnitte voneinander auf einen leeren Bereich jedes Stück Umgebung aufrecht zu erhalten. Make Kratzer auf der Oberfläche der Gewebekulturschale mit einem Skalpell, um die Befestigung von Gewebeschnitten zu erleichtern.
HINWEIS: Scratchingscheint auch Zellauswuchs erleichtern, wodurch Spuren entlang dem Zellen migrieren können.- Alternativ stellen Hackfleisch Gewebestücke einzeln in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen, und sie mit einem Deckglas. Befestigen Sie das Deckglas auf die Oberfläche der Platte mit Silikonfett.
- Zeigen Silikonfett an zwei Punkten 1,5 cm Abstand in jedem Well mit einem sterilen Stift. Coverage der Gewebestücke erhöht die Wirksamkeit der Zell Auswuchs und Zellvermehrung nach mehreren Durchgängen.
- Nachfolgende Explantatkultur:
- Kulturmedium hinzufügen, vorsichtig in die Schale, bevor die Gewebeschnitte austrocknen, so effizient Zellauswuchs wird zum größten Teil verloren, wenn die Proben trocknen. Stellen Sie das Medium strömen nicht zu schnell, wie die Gewebeschnitte würde abnehmen.
- Kulturzellen in DMEM mit 10% FBS. Verwenden Sie ausreichend Medium nur das Gewebe zu bedecken, aber nicht zu viel, dass es ermöglicht, schwebend, als zusätzliche Auftriebs fördert Loslösung von derGericht.
- Zellpassage:
- Gehen Sie mit dem Kulturmedium mit Sorgfalt zu allen Zeiten als wiederholte Bewegungen der Kulturschale kann zur Ablösung der Gewebeschnitte führen.
- Legen Sie die Kulturschalen in einem Brutschrank bei 37 ° C für 5-7 Tage. Aktualisieren Sie das Medium jeden zweiten Tag, und übernehmen die Kulturschalen minimal während des Mediums ändert. Fibroblasten entwachsen von der Kante der Gewebeschnitte in den nächsten Wochen.
HINWEIS: Nach ~ 2-3 Wochen entwachsen Fibroblasten fast bis Konfluenz in Abhängigkeit von der Höhe der Oberfläche. - Waschen Sie die Zellen mit 1 × PBS und 1 ml Trypsin ich auf den Teller.
- Nach Trypsinierung lösen sich die Zellen unter Verwendung von 9 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS. Sammeln Zellen in dem Medium in einer 10-ml-Röhrchen suspendiert, zusammen mit den Gewebeschnitten. Nach der Zentrifugation, um Zellpellets zu bilden, Resuspendieren der resultierenden Pellets in dem neuen Medium.
- Seed die Zellen und Gewebeschnitte auf eine neue cultur Schüssel, an welchem Punkt das Gewebe nicht an den Teller zu befestigen, während die Zellen anhaften und wachsen. Am folgenden Tag, nehmen Sie die schwimmenden Gewebestücke durch Aspiration, und ändern Sie das Medium. Angehängte Fibroblasten breiten sich mit nachfolgenden Kulturen.
2. Dreidimensionale Co-Kultur der menschliche Lungen-Fibroblasten und Krebszellen
- Herstellung von Zellen und Reagenzien:
- Etwa verwenden 2 × 10 5 Epithelzellen und 2,5 x 10 5 Fibroblasten pro Vertiefung. Bereiten Kollagen Typ IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), Rekonstitutionspuffer (50 mM NaOH, 260 mM NaHCO 3, 200 mM HEPES), 5x DMEM, DMEM mit 10% FBS für Fibroblastenkultur ergänzt, und ein 3D-Co-Kulturmedium (eine 1: 1-Mischung von Fibroblastenkulturmedium und das Kulturmedium für die Krebszellen).
- Kultur A549 Lungenadenokarzinomzellen, die Fibroblasten und die A549 3D Kokultur in DMEM, ergänzt mit 10% FBS.
- Kollagen-Gel formationen:
- Fibroblasten auf 10 cm Schüssel mit 1x PBS kultiviert waschen und mit 1 ml Trypsin ich auf den Teller. Nach Trypsinisierung für ~ 5 min bei 37 ° C lösen sich die Zellen unter Verwendung von 9 ml DMEM mit 10% FBS ergänzt. Sammeln Zellen in dem Medium in einer 10-ml-Röhrchen suspendiert und zentrifugieren bei 200-300 xg Zellpellets zu bilden.
- Resuspendieren der resultierenden Pellets in 100% FBS bei einer Dichte von 5 × 10 5 / ml.
- Bereiten Sie die Kollagen-Gel auf Eis. Kühlung der Reagenzien, Pipetten und Röhren in einem Kühlschrank vor dem folgenden Verfahren. Auch auf Eis erstarrt die Mischung zu einem gewissen Grad, und das Gesamtvolumen weniger als die Summe aller Bestandteile ist.
- In jede Vertiefung, bereiten Sie die Kollagen-Gel durch Mischen von 0,5 ml Fibroblastensuspension (2,5 x 10 5 Zellen) in FBS, 2,3 ml Typ IA Kollagen, 670 ul 5x DMEM, und 330 & mgr; Rekonstitutionspuffer. Lassen Sie die Gele leicht bei Raumtemperatur eingestellt.
- Kräftig pipettieren, um eine homogene mi gewährleistenBefestigung. Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipettieren.
- Hinzufügen der Mischung (3 ml) zu jedem Well einer 6-Well-Platte und zu ermöglichen, in den Inkubator bei 37 ° C für 30-60 min gelatinieren ohne Störung.
- Krebszellkultur auf das Kollagengel:
- Führen dreidimensionalen Co-Kultur mit einem zuvor berichtet Protokoll mit Modifikationen 6.
- Resuspendieren Krebszellen in der 3D-Co-Kulturmedium (oder in DMEM mit 10% FBS bei der A549-Zellen) in einer Dichte von 1 x 10 5 / ml.
- Pour 2 ml des resuspendierten Zelllösung (2 x 10 5 Zellen) auf die Oberfläche eines jeden Gels. Ändern der Zellzahl der Krebszellen oder Fibroblasten in Kokultur je nach Versuchsbedingungen.
- Gelkontraktion:
- Gele über Nacht bei 37 ° C, so dass die Krebszellen zu dem Kollagengel haften. Trennen Sie jedes Gel, und erzeugen einen "schwebenden Kultur" in jede Vertiefung of 6-Well-Platte.
HINWEIS: Durch die Verwendung eines schwimmenden Kultur, sind verschiedene Änderungen in Gelgröße durch mechanische Spannung und Kollagenabbau, die von zellulären Wechselwirkungen zwischen co-kultivierten Krebszellen und Fibroblasten vermittelt werden induziert. - Verwenden eine abgewinkelte 21 G Nadel oder Spachtel, jedes Gel, das aus dem Rand des Bohrlochs abzutrennen. Alle 2-3 Tage, aktualisieren Sie die Vertiefungen mit 2 ml 3D-Co-Kulturmedium. Messen der Größe jedes Gel täglich für 5 Tage.
- Gele über Nacht bei 37 ° C, so dass die Krebszellen zu dem Kollagengel haften. Trennen Sie jedes Gel, und erzeugen einen "schwebenden Kultur" in jede Vertiefung of 6-Well-Platte.
- Analyse Kollagengelen:
- Messung der Kollagengehalt von jeweils unter Verwendung von Kollagen-Quantifizierungsverfahren, wie dem Sircol Assay. Führen Transkriptom-Analyse oder quantitativer RT-PCR nach dem Sammeln von RNA aus den Gelen 5.
3. Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, Kultur und Invasion Assay
- Nach Kultivieren der Kollagengele bei 37 ° C für 5 Tage, setzen die kontrahierten Gele Luft, indem sie auf ein Sieb (70 & mgr; m Porengrße) in neue 6-Well-Platten. Stellen Sie das Netz aus kommerziell erhältlichen Zellsiebe für die Durchflusszytometrie verwendet.
- Vorsichtig füllen jede Vertiefung mit 11 ml 3D Co-Kulturmedium.
- Positionieren Sie die Gele auf das Netz mit einem sterilen Löffel, und entfernen Sie alle verbleibenden Medium aus den Gelen. Unter dieser Bedingung, tauchen Gele in dem Medium während setzen die obere Oberfläche des Gels in die Luft. Definieren Sie diesen Kulturbedingungen wie Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche.
HINWEIS: Nach 5-7 Tagen der Beibehaltung des Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche bei 37 ° C im Brutschrank migrieren invasive Krebszellen in das Gel. Je nach Zelltyp und als Ergebnis zellulärer Wechselwirkungen sind variable Grad der Zell morphologische Veränderung in den Krebszellen durch die Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle Kultur induziert. - Für die histologische Beurteilung, beheben Sie das Gel in Formalin-Lösung über Nacht bei Raumtemperatur und in Paraffin eingebettet werden. Fleck Vertikalschnitte (4 & mgr; m) mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). Führen immunhistochemische Analyse on die Abschnitte 4.
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Representative Results
Diese Co-Kulturverfahren, imitiert der Tumor-Mikroumgebung ist ein nützliches Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen den Krebszellen und Fibroblasten in Kollagengele eingebettet untersuchen. Kollagengel Kontraktion, Invasion von Krebszellen und morphologische Veränderungen: In der früheren Studie wurden drei Parameter in diesem experimentellen Modell bewertet. Krebszellproliferation wurde ebenfalls mit Ki67 Immunfärbung 4 geschätzt. Lungengewebeproben wurden von krebsartigen und nicht-krebsartigen Abschnitte eines resezierten Lungenlappen (1A) gesammelt. Die Proben wurden in kleine Stücke zerkleinert und in DMEM kultiviert, das mit 10% FBS (1B). Fibroblasten aus dem Gewebeschnitt wuchsen unter dem Mikroskop (Figur 1C) beobachtete. Primären kultivierten Lungenfibroblasten wurden in ein Kollagengel eingebettet sind (2A, a) und A549 Lungenkrebszellen wurden auf das Gel co-kultiviert (2A, B). Nach schwimm culture im Medium (2A, c), wurde das Gel unter der Bedingung der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche weiter kultiviert (2A, d). Das Gel wurde in Formalin fixiert und für immunhistochemische Analysen (2A, e) verwendet. Für Luft-Flüssig-Grenzkultur wurde das Gel auf einem Gitter in einer Vertiefung Platte mit 6 Vertiefungen (2B) angeordnet sind. Histologische Analysen der Gel zeigte Invasion von A549 Zellen in das Kollagengel mit Lungen-Krebs assoziierten Fibroblasten (3) eingebettet ist.
Abbildung 1: Auswachsen von Fibroblasten aus chirurgisch entfernten menschlichen Lungengewebe. (A) Die Proben wurden von krebsartigen und nicht-krebsartigen Abschnitte eines resezierten Lungenlappen gesammelt. Wurden (B) Proben in kleine Stücke zerkleinert und in DMEM mit 10% FBS kultiviert.(C) Fibroblasten wuchs aus dem Gewebeschnitt (Pfeil). Man beachte, dass die Zellen wanderten entlang der Kratzer durch die Skalpellklingen auf der Kulturschale gemacht. Maßstabsbalken, 200 um.
Fig. 2: Air-Flüssig-Grenzkultur Kollagengel A549-Zellen wurden auf einem Collagen-Gel mit den Fibroblasten eingebettet cokultiviert, und die Schicht aus A549-Zellen wurde durch Anordnen des Gels auf einem Gitter in einem Medium an der Luft (A. ) Versuchsverfahren von dreidimensionalen Co-Kultur und der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. (a) Collagen-Gel mit Lungen-Fibroblasten eingebettet ist. (b) A549-Zellen auf dem Kollagen-Gel, kokultiviert. (c) Schwimm Kultur. (d) Air- Flüssig-Grenzfläche (ALI). (E) Fixation des Gels in Formalin. (B) repräsentatives Bild the Gel auf dem Gitter in eine Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen gelegt. O / N: über Nacht.
Abbildung 3. Hämatoxylin und Eosin-Färbung von Querschnitten eines dreidimensional kultivierten Gel von A549-Zellen und menschliche Lungenfibroblasten bestehen. Beachten Sie, daß A549-Zellen auf dem Kollagen-Gel kultiviert Invasion des Gels mit Fibroblasten (Pfeile) eingebettet. Maßstabsbalken, 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
CAF bilden eine wichtige Komponente der ECM Krebszellen umgibt, und nicht nur ein Gerüst für den Tumor, sondern auch aktiv in Tumorentwicklung 7 beteiligen. Immer mehr deutet entwirrt die Auswirkungen der CAF oder die entsprechenden Moleküle auf der eventuelle Prognose, Hervorhebung der kritischen Rolle der CAF-vermittelte Tumorprogression 8.
In der vorangegangenen Studie beschäftigten wir Auswuchs Methode zur Lungen CAF 4 zu isolieren. In diesem Experiment ist die Aufrechterhaltung der Gewebeschnitt Haftung auf der Geschirroberfläche kritisch. Zellen sind nicht in der Lage aus Gewebeschnitten schwebend in dem Kulturmedium herauswandern, und sobald die Gewebeschnitte aus der Oberfläche gelöst sind, können sie nicht mehr für Zellauswuchs auf demselben Kulturschale verwendet werden. Schneiden des Gewebes ergibt Ausscheidungen, das als Kleber für die Befestigung an der Geschirroberfläche dienen. Bei der Befestigung des Gewebeschnitts mit einem Deckglas, ist auch die Fettmenge verwendet kritical. Kleine Mengen von Fett nicht, das Deckglas befestigt zu halten, während überschüssiges Fett verschleiert die Zellkulturbereich. Befestigung der Gewebeschnitte mit einem Deckglas und den entsprechenden Druck ist auch ein Schlüssel zur Erleichterung Zellauswuchs.
Die experimentellen Modelle für Krebszellproliferation und Invasion sich zumeist auf die zweidimensionalen Monoschicht-Zellkulturen oder Boyden-Kammer-Assays herangezogen. Um interzellulären Kommunikation und ECM abhängige Modulation von Krebszellverhalten besser zu verstehen, dreidimensionalen Co-Kulturen sind leistungsstarke Werkzeuge. Organotypischen Kulturen sind auch nützlich für die Untersuchung von multizellulären Wechselwirkungen, wenn sie brauchen mehr technische Fähigkeiten und Versuchsbedingungen sind begrenzt.
Unser Co-Kultur-Modell dient als Plattform, um Tumor-Stroma-Interaktionen unter Bedingungen imitiert die Tumor-Mikroumgebung zu bewerten. Zellen mit spezifischen Gen-Überexpression oder Knockdown in unserem cultu leicht anwendbarre-System, das einen Vorteil über die organotypische Kultur. Bemerkenswert ist, schlug vor, unsere früheren Beobachtungen, dass co-kultivierten Fibroblasten aktiv Krebszelldifferenzierung und Invasion 4 zu modulieren. Es wäre von Interesse, um mögliche Wechselwirkungen vielzelligen in unserem experimentellen Umgebung, wie Endothelzellen, Entzündungszellen und Nicht-Krebs Epithelzellen testen.
Verschiedene Merkmale der CAF in Co-Kultur-Studien oder durch Genexpressionsanalysen gezeigt, unter Verwendung von primären CAF Kulturen und ihre normalen Gegenstücke 9. Auf der anderen Seite haben diese Studien auch intratumorale oder interindividuelle Heterogenität CAF 10, von denen ein Teil könnte auf verschiedenen Ebenen der Wachstumsfaktor-Signalisierungs 11 oder Transkriptionsfaktor-Aktivierung 12 werden gezeigt. Somit ist es wichtig, weiter zu charakterisieren heterogenen CAFs von Krebspatienten 13 abgeleitet. Nach wiederholter Zellpassagen,die Eigenschaften der primären gezüchteten CAF kann modifiziert werden. Daher wäre es besser, CAFs bei frühen Passagen charakterisieren.
CAF tragen zur ECM-Ablagerung und Umbau, die wiederum kann CAF durch Spannung ausgelöste Zellsignalisierung aktivieren. Eine solche Mechanotransduktion vermittelte Feed-Forward-Schleife von CAF-Aktivierung wurde vorgeschlagen, 14, und unsere Kollagen-Gel Kontraktion Modell kann Einblick in diese Mechanismen zu schaffen. Die Mechanismen der Kollagengel Kontraktion umfassen Zellkontraktion, Proliferation, Migration, Differenzierung und Kollagen Remodeling 15. Detaillierte histologische Untersuchungen und Versuchen mit Liganden, Inhibitoren, oder RNAi kann hilfreich sein, eine mechanistische Einblicke in Tumor-Stroma-Interaktionen zu gewinnen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Collagen type IA | Nitta gelatin Inc. | CELL-1A | |
| Reconstitution buffer | Nitta gelatin Inc. | ||
| Cover slip | NUNC | 174934 | |
| Silicone grease | Dow Corning Toray | High vacuum grease | |
| Dispase I | WAKO | 386-02271 | |
| 6-well plate | BD Falcon | 353046 | |
| Cell strainer (70 μm) | BD Falcon | 352350 |
References
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