Tridimensional Modelo Co-cultura para la interacción tumor estromal

Protocol

NOTA: Este estudio fue aprobado por los Comités de Ética apropiados.

1. cultivo primario de fibroblastos humanos de pulmón

1. Colección de tejido pulmonar:
   1. Obtener muestras de tejido de pulmón humano de la sala de operaciones quirúrgicas directamente. Recoger aproximadamente 1 cm ³ cuadras del tejido pulmonar canceroso y no canceroso, con la muestra no cancerosa recogido tan lejos de tumor posible.
   2. Suspender las muestras en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,25 mg / ml de anfotericina B (medio libre de suero). Mantener las muestras en suspensión en 50 ml tubos estériles y traslado al laboratorio.
      NOTA: Los fibroblastos son altamente migratoria y proliferativa en comparación con otros tipos de células, tales como células epiteliales, endoteliales y células musculares lisas. El método de derivación se aprovecha de estas características de los fibroblastos, y outgrolas células del ala de las secciones de tejido son abundantes en los fibroblastos. Después de varios pases celulares, otros tipos de células no sobreviven y propagar en DMEM con suero bovino fetal al 10% (FBS), resultando en cultivos celulares de fibroblastos purificados. Las células podrían utilizarse 3-7 pasajes siguientes cultivo primario.
2. Cultura explante y acondicionamiento de crecimiento externo celular:
   1. Realizar cultivo primario de fibroblastos utilizando un protocolo informó anteriormente con modificaciones ^5.
   2. En el laboratorio, colocar la muestra de tejido en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos sin medio de cultivo y se corta en pequeñas secciones ~ 2-3 mm de tamaño usando pinzas estériles y un bisturí. Durante este proceso, evitar hacer la sección seca, de lo contrario la eficiencia del crecimiento de la célula está alterada.
3. La separación de la capa de células epiteliales y del tejido conectivo:
   1. Remoje las secciones de tejido cortado en medio de cultivo que contiene 2.000 UF / ml dispasa I y cultura durante 16 horas a 4 ° C. </ Li>
   2. Transferencia de las secciones de tejido a un plato, y separar la capa de células epiteliales del tejido conectivo adyacente. Procesar las secciones en un banco limpio para evitar la contaminación de microorganismos.
      NOTA: Si se necesita un cultivo primario de células epiteliales, realice el paso 1.3. Si sólo fibroblastos deben ser aislados, omita el paso 1.3 porque la cultura explante y celulares pasajes posteriores son desfavorables para las células epiteliales, que producen poblaciones de fibroblastos purificados.
4. La unión de las secciones de tejido:
   1. Picar los tejidos en piezas de 1 mm utilizando dos escalpelos. Si las piezas no son lo suficientemente pequeños, se desprenden más fácilmente del plato, y las células no podrán superar en la superficie del plato.
   2. Coloque pequeñas secciones de tejido de pulmón separados unos de otros para mantener un área vacía rodea a cada pieza. Hacer arañazos en la superficie de la placa de cultivo de tejidos utilizando una hoja de bisturí para facilitar la unión de secciones de tejido.
      NOTA: Rascarsetambién parece facilitar la derivación de células, proporcionando pistas a lo largo de la cual las células pueden migrar.
      1. Como alternativa, coloque trozos de tejido picado individualmente en cada pocillo de una placa de 6 pocillos y cubrirlos con un cubreobjetos. Coloque la hoja de la cubierta a la superficie de la placa con grasa de silicona.
      2. Coloque grasa de silicona en dos puntos 1.5 cm de separación, en cada pocillo utilizando un pasador estéril. Cobertura de las piezas de tejido mejora la eficacia del crecimiento de las células y la propagación de células después de varios pasajes.
5. Cultura explante subsiguiente:
   1. Añadir suavemente medio de cultivo para el plato antes de las secciones de tejido se secan, como consecuencia de células eficiente se pierde en su mayor parte si las muestras se sequen. No vierta el medio con demasiada rapidez como las secciones de tejido se separe.
   2. Células de cultivo en DMEM con 10% de FBS. Utilice medio suficiente para cubrir sólo el tejido, pero no demasiado, que permite flotante, como la flotabilidad adicional promueve la separación de laplato.
6. Pasaje de la célula:
   1. Maneje el medio de cultivo con cuidado en todo momento como movimientos repetidos de la placa de cultivo puede dar lugar al desprendimiento de las secciones de tejido.
   2. Coloque las placas de cultivo en una incubadora a 37 ° C durante 5-7 días. Actualizar el medio cada dos días, y manejar las placas de cultivo mínimamente durante los cambios de medio. Los fibroblastos superan desde el borde de las secciones de tejido en las próximas semanas.
      NOTA: Después de ~ 2-3 semanas, los fibroblastos outgrowing casi alcanzan la confluencia, dependiendo de la cantidad de área de superficie.
   3. Lavar las células con PBS 1x, y añadir 1 ml de tripsina I de la placa.
   4. Después de tripsinización, separar las células usando 9 ml de DMEM suplementado con 10% FBS. Recoger las células suspendidas en el medio en un tubo de 10 ml, junto con las secciones de tejido. Después de la centrifugación para formar sedimentos celulares, resuspender los sedimentos resultantes en el nuevo medio.
   5. Sembrar las células y las secciones de tejido en un nuevo callejónplato tura, momento en el que los tejidos fallan para insertarse en el plato, mientras que las células se adhieran y crezcan. Al día siguiente, retire los trozos de tejido que flotan por aspiración, y cambiar el medio. Fibroblastos adjuntos se propagan con culturas posteriores.

2. tridimensional Co-cultivo de fibroblastos humanos de pulmón y células cancerosas

1. Preparación de las células y reactivos:
   1. Utilizar Aproximadamente 2 x 10 ⁵ células epiteliales y 2,5 x 10 ⁵ fibroblastos por pocillo. Preparar el colágeno de tipo IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), tampón de reconstitución (NaOH 50 mM, 260 mM NaHCO _3, mM HEPES 200), 5x DMEM, DMEM suplementado con 10% FBS para cultivo de fibroblastos, y un medio de co-cultivo 3D (una mezcla 1: 1 de medio de cultivo de fibroblastos y medio de cultivo para las células cancerosas).
   2. A549 Cultura células de adenocarcinoma de pulmón, los fibroblastos y el co-cultivo 3D A549 en DMEM suplementado con 10% FBS.
2. El colágeno gel formación:
   1. Lave fibroblastos cultivados en placa de 10 cm con 1x PBS, y añadir 1 ml de tripsina I de la placa. Después de tripsinización durante ~ 5 min a 37 ° C, separar las células usando 9 ml de DMEM suplementado con 10% FBS. Recoger las células suspendidas en el medio en un tubo de 10 ml y centrifugar ellos a 200-300 xg para formar sedimentos celulares.
   2. Resuspender los sedimentos resultantes en 100% de FBS a una densidad de 5 x 10 ⁵ / ml.
   3. Preparar el gel de colágeno en el hielo. Enfriar los reactivos, pipetas y tubos en un refrigerador antes de la siguiente procedimiento. Incluso en el hielo, la mezcla solidifica en cierto grado, y el volumen total es menor que la suma de todos los componentes.
   4. En cada pocillo, preparar el gel de colágeno mediante la mezcla de 0,5 ml de la suspensión de fibroblastos (2,5 x 10 ⁵ células) en FBS, 2,3 ml de colágeno de tipo IA, 670 l 5x DMEM, y 330 l tampón de reconstitución. Permitir que los geles para ajustar fácilmente a temperatura ambiente.
      1. Vigorosamente pipeta para asegurarse a mi homogéneaxture. Evitar la creación de burbujas durante el proceso de pipeteado.
   5. Añadir la mezcla (3 ml) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos y se deja gelatinizar en la incubadora a 37 ° C sin perturbaciones durante 30-60 min.
3. Cultivo de células de cáncer en el gel de colágeno:
   1. Realizar co-cultivo tridimensional usando un protocolo informó anteriormente con modificaciones ^6.
   2. Resuspender las células cancerosas en el medio de co-cultivo 3D (o en DMEM con 10% FBS en el caso de las células A549) a una densidad de 1 x 10 ⁵ / ml.
   3. Verter 2 ml de la solución de células resuspendido (2 x 10 ⁵ células) sobre la superficie de cada gel. Modificar el número de células de las células cancerosas o fibroblastos en co-cultivo dependiendo de las condiciones experimentales.
4. Gel contracción:
   1. Incubar geles durante la noche a 37 ° C de modo que las células cancerosas pueden adherirse a la gel de colágeno. Separe cada gel, y generar una "cultura flotante" en cada pozo of la placa de 6 pocillos.
      NOTA: Mediante el uso de una cultura flotante, diversos cambios en el tamaño de gel son inducidas por la tensión mecánica y la degradación de colágeno, que están mediadas por la interacción celular entre co-cultivaron células cancerosas y fibroblastos.
   2. Utilice un ángulo 21 G aguja o pequeña espátula para separar cada gel desde el borde del pozo. Cada 2-3 días, refrescan los pocillos con 2 ml de medio de cultivo conjunto 3D. Medir el tamaño de cada gel cada día durante 5 días.
5. Análisis de geles de colágeno:
   1. Mida el contenido de colágeno de cada gel utilizando métodos de cuantificación de colágeno, tales como el ensayo Sircol. Realizar análisis transcriptómica o RT-PCR cuantitativa después de recoger el ARN de los geles ^5.

3. Aire líquido Interfaz cultura y la invasión de ensayo

1. Después de cultivar los geles de colágeno a 37 ° C durante 5 días, exponga los geles contratados a la atmósfera que los coloca en una malla (70 micras de tamaño de poro) en el nuevo 6-placas de pocillos. Hacer la malla de los tamices de células disponibles comercialmente utilizados para citometría de flujo.
2. Llenar suavemente cada pocillo con 11 ml de medio de co-cultivo 3D.
3. Coloque los geles sobre la malla con una cuchara estéril y retire cualquier medio restante de los geles. En esta condición, se sumergen geles en el medio mientras exponer la superficie superior del gel al aire. Definir esta condición cultura como interfase aire-líquido.
   NOTA: Después de 5-7 días de mantenimiento de la cultura interfase aire-líquido a 37 ° C en la incubadora, las células cancerosas invasivas migrar en el gel. Dependiendo del tipo de célula y como resultado de interacciones celulares, grados variables de cambio morfológico celular en las células cancerosas son inducidas por la cultura interfase aire-líquido.
4. Para la evaluación histológica, fijar el gel en solución de formalina durante la noche a temperatura ambiente y embeber en parafina. Teñir secciones verticales (4 m) con hematoxilina y eosina (H & E). Realizar análisis inmunohistoquímico on las secciones ^4.

Representative Results

Este método de co-cultivo, imitando el microambiente tumoral, es una herramienta útil para investigar las interacciones entre las células cancerosas y los fibroblastos embebidos en geles de colágeno. En el estudio anterior, tres parámetros fueron evaluados en este modelo experimental: la contracción de gel de colágeno, la invasión de células de cáncer y el cambio morfológico. Proliferación de las células del cáncer se estimó utilizando también Ki67 inmunoticción ^4. Muestras de tejido pulmonar se recogieron a partir de secciones cancerosas y no cancerosas de un lóbulo de pulmón resecado (Figura 1A). Las muestras se desmenuzaron en trozos pequeños y se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS (Figura 1B). Los fibroblastos que crecen fuera de la sección de tejido se observaron bajo el microscopio (Figura 1C). Fibroblastos de pulmón de cultivos primarios fueron incorporados en un gel de colágeno (Figura 2A, a) y las células de cáncer de pulmón A549 fueron co-cultivadas en el gel (Figura 2A, B). Después de c flotanteulture en el medio (Figura 2A, c), el gel se cultivaron adicionalmente bajo la condición de la interfaz aire-líquido (Figura 2A, d). El gel se fijó en formalina y se utilizó para los análisis de inmunohistoquímica (Figura 2A, e). Para el cultivo de interfase aire-líquido, el gel se colocó en una malla en un pocillo de placa de 6 pocillos (Figura 2B). Los análisis histológicos del gel reveló la invasión de las células A549 en el gel de colágeno incrustado con fibroblastos asociados con cáncer de pulmón (Figura 3).

Figura 1: consecuencia de fibroblastos de tejido pulmonar humano resecado quirúrgicamente. Se recogieron muestras (A) a partir de secciones cancerosas y no cancerosas de un lóbulo de pulmón resecado. (B) Las muestras se picaron en trozos pequeños y se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS.(C) Los fibroblastos surgió de la sección de tejido (flecha). Tenga en cuenta que las células migran a lo largo de los arañazos hechos por las hojas de bisturí en la placa de cultivo. Barra de escala, 200 micras.

Figura 2:. Cultura interfase aire-líquido del gel de colágeno las células A549 fueron co-cultivadas en un gel de colágeno encajado con los fibroblastos, y la capa de las células A549 se expuso al aire colocando el gel sobre una malla en el medio (A. ) Los procedimientos experimentales de co-cultivo y la interfaz aire-líquido tridimensional. (a) El colágeno gel integrado con fibroblastos de pulmón. (b) células A549 co-cultivadas en el gel de colágeno. (c) la cultura flotante. (d) con aire interfaz líquido (ALI). (E) Fijación del gel en formalina. (B) imagen representativa de ºgel e colocado en la malla en un pocillo de placa de 6 pocillos. O / N: durante la noche.

Figura 3. tinción con hematoxilina y eosina de secciones transversales de un gel tridimensional cultivado compuesto de células A549 y los fibroblastos pulmonares humanos. Tenga en cuenta que las células A549 cultivadas en el gel de colágeno invadieron el gel embebido con fibroblastos (flechas). Barra de escala, 200 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

CAF forman un componente importante de la ECM que rodea las células del cáncer y no sólo proporcionan un andamio para el tumor, pero también participan activamente en el desarrollo del tumor ^7. La acumulación de pruebas revela el impacto de la CAF o sus moléculas relacionadas en el eventual pronóstico, destacando el papel fundamental de la progresión tumoral mediada por CAF ^8.

En el estudio anterior, hemos empleado el método consecuencia de aislar CAF pulmón ^4. En este experimento, el mantenimiento de la sección de tejido adhesión sobre la superficie del plato es crítica. Las células son incapaces de migrar hacia fuera de las secciones de tejido que flotan en el medio de cultivo, y una vez que las secciones de tejido desprendido de la superficie, que ya no se pueden utilizar para excrecencia celular en la misma placa de cultivo. El corte del tejido produce exudados, que sirven como un pegamento para la unión a la superficie del plato. Al fijar la sección de tejido con una hoja de la cubierta, la cantidad de grasa utilizada también es critical. Pequeñas cantidades de grasa no pueden mantener la hoja de la cubierta adjunta, mientras que el exceso de grasa oscurece la zona de cultivo de células. La unión de las secciones de tejido utilizando una hoja de cubierta y la presión adecuada es también una clave para facilitar el crecimiento externo celular.

Los modelos experimentales para la proliferación de células de cáncer y la invasión se han basado principalmente en cultivos de tejidos en monocapa de dos dimensiones o ensayos de cámara de Boyden. Para entender mejor la comunicación intercelular y ECM dependiente de modulación del comportamiento de células de cáncer, co-cultivos tridimensionales son herramientas poderosas. Los cultivos organotípicos son también útiles para la investigación de interacciones multicelulares, aunque necesitan habilidades técnicas superiores y las condiciones experimentales son limitadas.

Nuestro modelo de co-cultivo sirve como una plataforma para evaluar las interacciones de tumor estromal bajo condiciones que imitan el microambiente tumoral. Las células con sobreexpresión del gen específico o desmontables son de fácil aplicación en nuestra culture sistema, que es una ventaja sobre cultivo organotípico. Notablemente, nuestras observaciones anteriores sugieren que la co-cultivaron fibroblastos modular activamente la diferenciación de células de cáncer y la invasión ^4. Sería de interés para probar las posibles interacciones multicelulares en nuestro entorno experimental, tales como células endoteliales, células inflamatorias y células epiteliales no cancerosas.

Características particulares de CAF se han demostrado en estudios de co-cultivo o por perfiles de expresión génica, utilizando cultivos primarios de CAF y sus contrapartes normales ^9. Por otra parte, estos estudios también han demostrado la heterogeneidad intratumoral o interindividual de CAF ^10, parte de las cuales podrían ser atribuibles a diferentes niveles de factor de crecimiento de señalización ¹¹ o factor de transcripción de activación ^12. Por lo tanto, es esencial para caracterizar adicionalmente CAF heterogéneas derivadas de pacientes de cáncer ^13. Después de repetidos pases celulares,las características de los CAF cultivo primario pueden ser modificados. Por lo tanto, sería mejor para caracterizar CAF en los primeros pasajes.

CAF contribuyen a la deposición de ECM y la remodelación, lo que a su vez, puede activar CAF a través de la señalización celular tensión por alarma. Tal feed-forward loop mecanotransducción mediada por la activación de la CAF se ha sugerido ^14, y nuestro modelo de contracción de gel de colágeno puede ayudar a comprender estos mecanismos. Los mecanismos de contracción de gel de colágeno incluyen contracción celular, la proliferación, migración, diferenciación y remodelación del colágeno ^15. Estudios histológicos detallados y experimentos con ligandos, inhibidores o RNAi puede ser útil para obtener una visión mecanicista en la interacción tumor estromal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
FBS	GIBCO	10437
Collagen type IA	Nitta gelatin Inc.	CELL-1A
Reconstitution buffer	Nitta gelatin Inc.
Cover slip	NUNC	174934
Silicone grease	Dow Corning Toray	High vacuum grease
Dispase I	WAKO	386-02271
6-well plate	BD Falcon	353046
Cell strainer (70 μm)	BD Falcon	352350