Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Tredimensionell Samodling modell för Tumör-stromal Interaktion

doi: 10.3791/52469 Published: February 2, 2015

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OBS: Denna studie har godkänts av lämpliga etiska kommittéer.

1. Primär kultur för mänskliga lungfibroblaster

  1. Insamling av lungvävnad:
    1. Skaffa lungvävnadsprover mänskliga från det kirurgiska operationssalen direkt. Samla cirka 1 cm 3 kvarter från cancerös och icke-cancerös lungvävnad, och det icke-cancerösa prov samlas så långt bort från tumören som möjligt.
    2. Suspendera proverna i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 100 enheter / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 0,25 ug / ml amfotericin B (serumfritt medium). Behåll de suspenderade proven i sterila 50 ml rör och överför till laboratoriet.
      OBS: Fibroblaster är ständigt vandrande och proliferativ jämfört med andra celltyper, såsom epitel-, endotel- och glatta muskelceller. Den utväxt Metoden utnyttjar dessa funktioner i fibroblaster, och outgroving celler från vävnadssnitt finns rikligt i fibroblaster. Efter flera cellpassager, andra celltyper inte överlever och fortplantas i DMEM med 10% fetalt bovint serum (FBS), vilket resulterar i renade fibroblast-cellkulturer. Cellerna kan användas 3-7 passager efter primärkulturen.
  2. Explantation kultur och konditione för cell utväxt:
    1. Utför primär kultur av fibroblaster med hjälp av en tidigare rapporterade protokoll med ändringar 5.
    2. I laboratoriet, placera vävnadsprovet på en 10 cm vävnadsodlingsskål utan odlingsmedium och skär i små sektioner ~ 2-3 mm i storlek med sterila pincett och en skalpell. Under denna process, undvika att göra sektionen torrt, annars effektiviteten av cell utväxt är nedsatt.
  3. Separation av det epiteliala cellskiktet och bindväv:
    1. Blöt de skurna vävnadssnitt i odlingsmedium innehållande 2000 PU / ml dispas I och kultur under 16 timmar vid 4 ° C. </ Li>
    2. Överför vävnadssnitten till en maträtt, och separera den epiteliala cellskiktet från den intilliggande bindväv. Bearbeta sektioner i en ren bänk för att undvika kontaminering av mikroorganismer.
      OBS: Om det behövs primär kultur av epitelceller, utför steg 1.3. Om bara fibroblaster ska isoleras, hoppa över steg 1.3, eftersom de efterföljande Explantation kultur och cellpassager är ogynnsamma för epitelceller, som ger renade fibroblast populationer.
  4. Utmätning av vävnadssnitt:
    1. Finhacka vävnaderna i 1 mm bitar med hjälp av två skalp. Om bitarna är inte tillräckligt små, de lossnar lättare från skålen, och cellerna kommer att misslyckas att växa ur på diskytan.
    2. Placera små lungvävnadssnitt från varandra för att upprätthålla ett tomt område som omger varje bit. Gör repor på ytan av vävnadsodlingsskålen med användning av ett skalpellblad för att underlätta fastsättning av vävnadssnitt.
      OBS: sprättaverkar också för att underlätta cell utväxt, som ger spår längs vilka celler kan migrera.
      1. Alternativt, placera malet vävnadsbitar individuellt i varje brunn i en 6-brunnars platta, och täcka dem med ett täckglas. Fäst locket glida på ytan av plattan med användning av silikonfett.
      2. Placera silikonfett på två punkter 1,5 cm mellanrum i varje brunn med en steril stift. Täckning av vävnadsstycken förstärker effekten av cell utväxt och cellutbredning efter flera passager.
  5. Efterföljande Explantation kultur:
    1. Försiktigt lägga odlingsmedium till skålen innan vävnadssnitt torka ut, så effektiv cell utväxt förloras för det mesta, om proverna torka ut. Häll inte mediet för snabbt eftersom vävnadssnitt skulle lossna.
    2. Kultur celler i DMEM med 10% FBS. Använd tillräckligt med medel för att bara täcka vävnaden, men inte för mycket att det gör flytande, som extra flytkraft främjar avskildhet frånskålen.
  6. Cell passage:
    1. Hantera odlingsmediet med omsorg vid alla tillfällen som upprepade rörelser kulturen skålen kan leda till avlossning av vävnadssnitt.
    2. Placera odlingsskålama i en inkubator vid 37 ° C under 5-7 dagar. Uppdatera mediet varannan dag, och hantera kultur rätter minimalt under medel ändras. Fibroblaster växa ur från kanten av vävnadssnitt under de närmaste veckorna.
      OBS: Efter ~ 2-3 veckor, outgrowing fibroblaster nästan når konfluens, beroende på mängden av ytarea.
    3. Tvätta cellerna med 1 x PBS, och tillsätt 1 ml trypsin I till plattan.
    4. Efter trypsinisering, lossa cellerna med hjälp 9 ml DMEM kompletterat med 10% FBS. Samla celler suspenderade i mediet i en 10 ml rör, tillsammans med de vävnadssnitt. Efter centrifugering för att bilda cellpellets, resuspendera de resulterande pelletarna i det nya mediet.
    5. Seed cellerna och vävnadssnitt på en ny culTure maträtt, vid vilken punkt vävnaderna inte fästa till skålen medan cellerna fastnar och växer. Följande dag, ta bort de flytande vävnadsbitar genom aspiration, och ändra mediet. Bifogade fibroblaster propagera med efterföljande kulturer.

2. Tredimensionell Co-kultur av mänskliga lungfibroblaster och cancerceller

  1. Beredning av celler och reagenser:
    1. Ungefär använda 2 x 10 5 epitelceller och 2,5 x 10 5 fibroblaster per brunn. Förbered kollagen typ IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), rekonstitution buffert (50 mM NaOH, 260 mM NaHCOs 3, 200 mM HEPES), 5x DMEM, DMEM kompletterat med 10% FBS under fibroblast kultur, och en 3D sam-odlingsmedium (en 1: 1 blandning av fibroblast-odlingsmedium och odlingsmedium för cancerceller).
    2. Kultur A549 lung adenokarcinomceller, fibroblasterna och A549 3D samodling i DMEM kompletterat med 10% FBS.
  2. Kollagengel formation:
    1. Tvätta fibroblaster odlade på 10 cm skålen med 1x PBS, och tillsätt 1 ml trypsin jag till plattan. Efter trypsinering för ~ 5 min vid 37 ° C, lossa cellerna med användning av 9 ml DMEM kompletterat med 10% FBS. Samla celler suspenderade i mediet i en 10 ml rör och centrifugera dem vid 200-300 xg för att bilda cellpellets.
    2. Resuspendera de erhållna pellets i 100% FBS vid en täthet av 5 x 10 5 / ml.
    3. Bered kollagengelen på is. Kyl reagensen, pipetter och rör i ett kylskåp före följande förfarande. Även på is, stelnar blandningen i viss utsträckning, och den totala volymen är mindre än summan av alla ingående beståndsdelar.
    4. I varje brunn, förbereda kollagengelen genom att blanda 0,5 ml fibroblast suspension (2,5 x 10 5 celler) i FBS, 2,3 ml typ IA kollagen, 670 pl 5x DMEM, och 330 pl beredning buffert. Låt gelerna att ställa lätt vid rumstemperatur.
      1. Kraftfullt pipett för att säkerställa en homogen mixture. Undvik att skapa bubblor under pipettering processen.
    5. Tillsätt blandningen (3 ml) till varje brunn i en 6-brunnars platta och tillåta att gelatinera i inkubatorn vid 37 ° C utan störning under 30-60 min.
  3. Cancer cellodling på kollagengelen:
    1. Utför tredimensionella samodling med hjälp av en tidigare rapporterade protokoll med ändringar 6.
    2. Resuspendera cancerceller i 3D sam-odlingsmedium (eller i DMEM med 10% FBS i fallet med A549-celler) vid en densitet av 1 x 10 5 / ml.
    3. Häll 2 ml av den återsuspenderade celllösning (2 x 10 5 celler) på ytan av varje gel. Ändra cell antal cancerceller eller fibroblaster i samodling beroende på experimentella betingelser.
  4. Gel kontraktion:
    1. Inkubera geler över natt vid 37 ° C, så att cancercellerna kan vidhäfta till kollagengel. Lossa varje gel, och generera en "flytande kultur" i varje brunn of den 6-brunnar.
      OBS: Genom att använda en flytande kultur, är olika förändringar i gel storlek induceras genom mekanisk spänning och kollagennedbrytning, som är medierade av cellulär interaktion mellan samodlade cancerceller och fibroblaster.
    2. Använd en vinklad 21 G nål eller liten spatel för att separera varje gel från kanten av brunnen. Var 2-3 dagar, uppdatera brunnarna med 2 ml av 3D samodling medium. Mät storleken på varje gel varje dag under 5 dagar.
  5. Analys av kollagengeler:
    1. Mät innehållet i varje gel som använder kollagen kvantifiering metoder, såsom Sircol analyskollagen. Utför transcriptomic analys eller kvantitativ RT-PCR efter insamling RNA från gelerna 5.

3. Luft vätska Interface kultur och Invasion analys

  1. Efter odling av kollagengeler vid 37 ° C under 5 dagar, exponera de kontrakte gelerna till luft genom att placera dem på ett nät (70 um porstorlek) i nytt 6-brunnsplattor. Gör maskan från kommersiellt tillgängliga cell silar som används för flödescytometri.
  2. Fyll försiktigt varje brunn med 11 ml 3D co-odlingsmedium.
  3. Placera gelerna på nätet med hjälp av en steril sked, och ta bort eventuella återstående medel från gelerna. På detta villkor, dränka geler i mediet medan exponera den övre ytan av gelén för luft. Definiera denna kultur skick som luft-vätskegränssnittet.
    OBS: Efter 5-7 dagar för att upprätthålla gränssnittet kulturluft vätska vid 37 ° C i inkubatorn, invasiva cancerceller migrerar in i gelén. Beroende på celltypen och som ett resultat av cellulära interaktioner, är variabla grader av cell morfologisk förändring av cancerceller som induceras av gränsytan odlings luft-vätska.
  4. För histologisk utvärdering, fixera gelén i formalinlösning över natten vid rumstemperatur och bädda in i paraffin. Fläck vertikala sektioner (4 pm) med hematoxylin och eosin (H & E). Utför immunohistokemisk analys on avsnitten 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna sam-odlingsmetod, mimicking tumörens mikromiljö, är ett användbart verktyg för att undersöka interaktioner mellan cancerceller och fibroblaster inbäddade i kollagengeler. I den tidigare studien, tre parametrar utvärderades i denna experimentella modell: kollagengel kontraktion, cancercellinvasion och morfologisk förändring. Cancer celltillväxt också uppskattas med hjälp av Ki67 immunfärgning 4. Lungvävnadsprover uppsamlades från cancerösa och icke-cancerösa sektioner av en resekerade lungloben (Figur 1A). Prover hackades till små bitar och odlades i DMEM kompletterat med 10% FBS (Figur 1B). Fibroblaster växer ut av sektionen vävnaden observerades under mikroskop (Figur 1C). Primära odlade lungfibroblaster var inbäddade i en kollagen-gel (Figur 2A, a) och A549 lungcancerceller samodlades på gelén (figur 2A, B). Efter flytande culture i mediet (figur 2A, c), varvid gelén var odlas vidare under förhållandet av luft-vätskegränssnittet (figur 2A, d). Gelén fixerades i formalin och användas för immunohistokemiska analyser (Figur 2A, e). För luft-vätskegränssnittet kultur gelén placerades på ett nät i en brunn på 6-brunnars platta (Figur 2B). Histologiska analyser av gelén avslöjade invasionen av A549-celler i kollagengelen inbäddade med lungcancer-associerade fibroblaster (Figur 3).

Figur 1
Figur 1: utväxt av fibroblaster från kirurgiskt opererande human lungvävnad. (A) Prover togs från cancer och godartade sektioner av en opererande lungloben. (B) Prover malet i små bitar och odlades i DMEM kompletterat med 10% FBS.(C) fibroblaster växte fram ur vävnadssnittet (pil). Notera att cellerna migrerat längs repor gjorts av skalpellblad på odlingsskålen. Skala bar, 200 nm.

Figur 2
Figur 2:. Luft-vätskegränssnittet kultur av kollagengelen A549-celler samodlades på en kollagengel inbäddad med fibroblasterna, och skiktet av A549-celler exponerades för luft genom att placera gelen på en maska ​​i medium (A. ) Experimentella förfaranden tredimensionella samodling och luft-vätske-gränssnittet. (a) Collagen gel inbäddade med lungfibroblaster. (b) A549 celler samar odlade på kollagengelen. (c) Flytande kultur. (d) Luft- vätskegränssnittet (ALI). (E) Fixering av gelén i formalin. (B) representant bild av the gel placeras på nätet i en brunn på 6-brunnar. O / N: över natten.

Figur 3
Figur 3. Hematoxylin och eosin-färgning av tvärsektioner av ett tre-dimensionellt odlade gel sammansatt av A549-celler och humana lungfibroblaster. Observera att A549-celler odlade på kollagengelen invaderade gelén inbäddade med fibroblasts (pilar). Skala bar, 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cafs utgör en stor del av ECM omger cancerceller och inte bara ge en byggnadsställning för tumören, utan också aktivt delta i tumörutveckling 7. Ackumulerande bevis river upp effekten av cafs eller deras närstående molekyler på eventuell prognos, belysa de kritiska roller CAF-medierad tumörprogression 8.

I den tidigare studien, anställd vi utväxt metod att isolera lung CAFS 4. I detta experiment är upprätthållandet av vävnadssektion vidhäftning på diskytan kritisk. Celler är inte migrera ut ur vävnadssnitt flyter i odlingsmediet, och en gång vävnadssektionerna lossnar från ytan, kan de inte längre kan användas för cell utväxt på samma odlingsskålen. Skärning av vävnaden ger utsöndringar, som fungerar som ett lim för fastsättning på diskytan. Vid fastställandet av vävnadssektionen med ett täckglas, är mängden fett som används också critical. Små mängder fett misslyckas med att hålla locket glida bifogade, medan överdriven fett döljer cellodlingsområdet. Utmätning av vävnadssnitt med en täckglas och rätt tryck är också en nyckel till att underlätta cell utväxt.

De experimentella modeller för cancercelltillväxt och invasion har förlitade sig främst på tvådimensionella monolager vävnadskulturer eller Boyden kammaranalyser. För att bättre förstå intercellulär kommunikation och ECM-beroende modulering av cancercellbeteende, tre-dimensionella samkulturer är kraftfulla verktyg. Organotypiska kulturer är också användbara för att undersöka flercelliga interaktioner, även om de behöver högre tekniska färdigheter och experimentella förhållanden är begränsade.

Vår co-kultur-modellen fungerar som en plattform för att utvärdera tumör stromal interaktioner under förhållanden som härmar tumörens mikromiljö. Celler med specifika genen överuttryck eller knockdown är lättare att tillämpa i vår Culture systemet, vilket är en fördel jämfört organotypisk kultur. Noterbart är våra tidigare observationer antydde att co-odlade fibroblaster modulerar aktivt cancercelldifferentiering och invasion 4. Det skulle vara av intresse att testa möjliga flercelliga interaktioner i vår experimentella inställning, såsom endotelceller, inflammatoriska celler och icke-cancerösa epitelceller.

Distinkta egenskaper hos CAFS har visats i samarbete kulturstudier eller genom genuttryck profilering, med hjälp av primära CAF kulturer och deras normala motsvarigheter 9. Å andra sidan har dessa studier också visat heterogenitet intratumoral eller interindividuella av cafer 10, varav en del kan bero på olika nivåer av tillväxtfaktorn signalering 11 eller transkriptionsfaktorn aktivering 12. Därför är det viktigt att ytterligare karakterisera heterogena CAFS härrör från cancerpatienter 13. Efter upprepade cellpassager,egenskaperna hos odlade primär cafs kan modifieras. Därför skulle det vara bättre att karaktärisera cafs vid tidiga passager.

Cafs bidrar till ECM-inlagring och remodellering, vilket i sin tur kan aktivera cafs genom spänningstriggad cellsignalering. En sådan mechanotransduction-medierad feed-forward slinga av CAF aktivering har föreslagits 14, och vår kollagengelen kontraktion modell kan ge insikter i dessa mekanismer. Mekanismerna av kollagen gel kontraktion inkluderar cell kontraktion, proliferation, migration, differentiering, och kollagen ombyggnad 15. Detaljerade histologiska studier och experiment med ligander, hämmare, kan eller RNAi vara till hjälp för att få en mekanistisk insikt i tumör stromal interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma-Aldrich D5796
FBS GIBCO 10437
Collagen type IA Nitta gelatin Inc. CELL-1A
Reconstitution buffer Nitta gelatin Inc.
Cover slip NUNC 174934
Silicone grease Dow Corning Toray High vacuum grease
Dispase I WAKO 386-02271
6-well plate BD Falcon 353046
Cell strainer (70 μm) BD Falcon 352350

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117, (2), 187-195 (2012).
  2. Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3, (1), 167-176 (2010).
  3. Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62 (2014).
  4. Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423, (1), 158-163 (2012).
  5. Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89, (11), 1315-1321 (2010).
  6. Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12, (2), 197-207 (2007).
  7. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5, (15), 1597-1601 (2006).
  8. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  9. Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, (17), 7160-7165 (2011).
  10. Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19, (21), 5914-5926 (2013).
  11. Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5, (5), e10747 (2010).
  12. Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70, (7), 2644-2654 (2010).
  13. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, (5), 392-401 (2006).
  14. Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15, (6), 637-646 (2013).
  15. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40, (5), 222-236 (2014).
Tredimensionell Samodling modell för Tumör-stromal Interaktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Horie, M., Saito, A., Yamaguchi, Y., Ohshima, M., Nagase, T. Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction. J. Vis. Exp. (96), e52469, doi:10.3791/52469 (2015).More

Horie, M., Saito, A., Yamaguchi, Y., Ohshima, M., Nagase, T. Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction. J. Vis. Exp. (96), e52469, doi:10.3791/52469 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter