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Immunology and Infection

Nucleocapsid एनीलिंग की मध्यस्थता वैद्युतकणसंचलन (नाम) परख एचआईवी -1 nucleocapsid inhibitors का तेजी से पहचान की अनुमति देता है

Published: January 19, 2015 doi: 10.3791/52474
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2The RNA Institute, SUNY Albany

Abstract

शाही सेना या स्थिर निरीक्षण तह में मुड़ा हुआ डीएनए अर्बुदरोधी या एंटीवायरल दवाओं के विकास में दिलचस्प लक्ष्य कर रहे हैं। एचआईवी -1 के मामले में, वायरस गतिविधि के नियमन में शामिल वायरल प्रोटीन कई न्यूक्लिक एसिड को पहचानते हैं। nucleocapsid प्रोटीन NCp7 (नेकां) वायरस प्रतिकृति के दौरान कई प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए एक कुंजी प्रोटीन होता है। नेकां वास्तव में आरएनए और डीएनए और उनके annealing को सुविधाजनक बनाने के माध्यमिक संरचनाओं को अस्थिर करने के लिए एक निगरानी है। नेकां की निष्क्रियता के लिए एक नया दृष्टिकोण और विरोधी एचआईवी उपचार के लिए एक दिलचस्प लक्ष्य है। एन ए nnealing- एम ई lectrophoresis ediated ucleocapsid (नाम) को परख करके, ऐसे टीएआर के बाल के लिये कांटा संरचनाओं और एचआईवी के cTAR तत्व के रूप में thermodynamically स्थिर निरीक्षण रचना में मुड़ा आरएनए और डीएनए के पिघलने और annealing को बाधित करने में सक्षम अणुओं की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था एचआईवी -1 के nucleocapsid प्रोटीन। नई परख पुन या तो रोजगार मिलाउनके पिछले लेबलिंग की आवश्यकता के बिना combinant या कृत्रिम प्रोटीन, और oligonucleotides के। परिणामों के विश्लेषण के पारंपरिक न्यूक्लिक एसिड धुंधला द्वारा पीछा मानक polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) द्वारा हासिल की है। इस काम में सूचना दी प्रोटोकॉल न्यूक्लिक के रूप में सक्षम है, दोनों एसिड संरक्षिकाओं पूर्ण लंबाई प्रोटीन या बुनियादी एन टर्मिनल डोमेन कमी इसकी छोटा संस्करण के साथ नाम परख प्रदर्शन करने के लिए, और कैसे एक द्वारा नेकां निगरानी गतिविधि के निषेध का आकलन बताता है कि कैसे intercalator सूत्रण। इसके अलावा, नाम पहचान नेकां अवरोधकों की कार्रवाई की ख्यात तंत्र पर संकेत प्राप्त करने के लिए, दो अलग मोड में उपयोगी प्रदर्शन किया जा सकता है।

Introduction

मानव इम्यूनो वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) के nucleocapsid प्रोटीन NCp7 (नेकां) रिवर्स प्रतिलेखन के दौरान एक cofactor के रूप में वायरस प्रतिकृति में एक निर्णायक भूमिका निभा कसकर परिपक्व संक्रामक वायरस में जीनोमिक शाही सेना के साथ जुड़ा हुआ है कि एक छोटी सी, बुनियादी प्रोटीन है, जीनोम मान्यता, और पैकेजिंग। 1-3 नेकां स्थिर न्यूक्लिक एसिड संरचनाओं की अस्थिरता और पूरक दृश्यों की annealing उत्प्रेरित एक न्यूक्लिक एसिड निगरानी के रूप में कार्य करता है। डुप्लेक्स को अस्थिर गतिविधि अपने जस्ता उंगली संरचनाओं (12-55 पेप्टाइड) के लिए मैप किया गया है, जबकि इसकी न्यूक्लिक एसिड कुल गतिविधि 11 अमीनो एसिड में मुख्य रूप से एन टर्मिनल डोमेन रहता है। चार सकारात्मक आरोप लगाया प्रोटीन एनिलिंग प्रतिक्रिया के electrostatic बाधा को कम करती है और दो अलग-अलग पूरक दृश्यों को एक साथ आने जिस दर बढ़ जाती है।

स्थिर रचना में मुड़ा न्यूक्लिक एसिड facilitat नेकां की निगरानी गतिविधियों की आवश्यकता होती हैई उनके annealing के 5 यह नेकां कतरा हस्तांतरण की घटनाओं में महत्वपूर्ण है जहां रिवर्स प्रतिलेखन, में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। शून्य से कतरा स्थानांतरण में, शून्य से कतरा रोक डीएनए, बस retrotranscribed, अनुसंधान के क्षेत्र में एक पूरक अनुक्रम को हस्तांतरित और annealed किया जाना चाहिए thermodynamically इष्ट हालांकि आरएनए जीनोम के 3 'अंत में टेम्पलेट। 6, इस प्रतिक्रिया के कारण आर क्षेत्रों में ट्रांस सक्रियण संवेदनशील क्षेत्र (टीएआर) शाही सेना के स्थिर संरचना की उपस्थिति के लिए नेकां के अभाव में बड़े पैमाने पर उत्पन्न नहीं होती है, कि अपने डीएनए की नकल (cTAR डीएनए)। एक विशेषता स्टेम पाश रचना के साथ 7 cTAR और टार, वास्तव में, अत्यधिक संरचित कर रहे हैं क्षेत्रों को जोड़ा जाना चाहिये। नेकां प्रोटीन इन hairpins denatures, और पूरक न्यूक्लिक एसिड किस्में के बीच अंतरआणविक annealing की दर में वृद्धि से शून्य से कतरा हस्तांतरण को बढ़ावा देता है। राल और cTAR की नेकां annealing के तंत्र को अच्छी तरह से जांच की और डी की गई हैकई शोध पत्र में टीएआर annealing के परख के रूप में मानते हैं और प्रस्तावित योजना उत्कृष्ट समीक्षा में दिखाया गया है। 8-11 सारांश, नेकां, ऐसे टीएआर-शाही सेना के रूप में स्थिर शाही सेना के माध्यमिक संरचना destabilizes इसकी पूरक अनुक्रम, cTAR-डीएनए के माध्यमिक संरचना destabilizes , और एक परिणाम के रूप में annealing टीएआर / cTAR heteroduplex गठन के लिए अग्रणी आरएनए / डीएनए की प्रतिक्रिया। 10,11 को बढ़ावा देता है, एचआईवी प्रतिकृति के दौरान कतरा-हस्तांतरण कदम के पक्ष में है। 12

नेकां नेकां की ओर छोटे अणुओं से प्रेरित संभावित हस्तक्षेप एक समझौता नेकां गतिविधि का एक परिणाम के रूप में वायरल जीनोम के रिवर्स प्रतिलेखन की कमी में परिणाम होगा के बाद से नए antiviral एजेंट के विकास के लिए एक आकर्षक लक्ष्य है। 2,13 इस संपर्क कर सकते हैं अंततः सफल एचआईवी-विरोधी एजेंट के विकास के लिए नेतृत्व। नेकां के लिए एक स्क्रीनिंग के पाठ्यक्रम में हम अच्छी तरह से ज्ञात गुणों पर निर्भर एक परख विकसित 14 inhibitorsकुशलता को अस्थिर करने nucleocapsid और पानी रखना पूरक oligonucleotides के। 10,11 हम इसे एन ए nnealing- एम ई lectrophoresis (नाम) को परख ediated ucleocapsid बुलाया। नाम परख संकर टीएआर / cTAR heteroduplex उपज के लिए अपने पूरक डीएनए अनुक्रम (cTAR) के साथ एक टीएआर-आरएनए अनुक्रम के शिखर भाग के लिए इसी oligonucleotide के हमारे मामले में, पूरक न्यूक्लिक एसिड की है stably संरचित प्रतियों के बीच annealing के लिए मध्यस्थता करने के लिए नेकां का उपयोग करता है । नेकां की उपस्थिति में टीएआर / cTAR annealing के प्रतिक्रिया का विश्लेषण देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) द्वारा जांच की जा सकती है।

इस प्रोटोकॉल तेजी से स्थिर बाल के लिये कांटा संरचनाओं में मुड़ा कमरे के तापमान oligonucleotides पर पानी रखना नाम परख प्रदर्शन करने के लिए कैसे पता चलता है, कैसे प्रयोग की प्रतिक्रिया और संभव समस्या निवारण के परिणाम का विश्लेषण करने के लिए। न्यूक्लिक एसिड का रेडियोधर्मी लेबलिंग का अनुरोध किया है, और detecti नहीं हैoligonucleotide बैंड के पर पारंपरिक धुंधला तरीकों से किया जा सकता है। पुनः संयोजक पूर्ण लंबाई प्रोटीन या नेकां का एक छोटा सिंथेटिक संस्करण या तो है कि रोजगार परख, नेकां, आरएनए और डीएनए को मजबूत बंधन के साथ संबंध स्थापित करने के लिए दिखाया एक गतिविधि में बाधा सूत्रण intercalators की पहचान के लिए अनुमति देता है। 14

Protocol

सामग्री, न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की 1. तैयारी

  1. न्यूक्लिक एसिड
    1. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब आटोक्लेव और एक बाँझ कंटेनर में स्टोर। Contaminating एजेंट प्रयोगशाला उपभोग्य से न्युक्लिअसिज़ यानी खत्म करने के लिए बाँझ फिल्टर युक्तियों का उपयोग हर कदम प्रदर्शन करते हैं।
    2. DEPC इलाज पानी में Tris-एचसीएल 10 मिमी बफर पीएच 7.5 तैयार है और एक .22 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर के साथ समाधान फ़िल्टर।
    3. नोट: "राल" कहा जाता oligonucleotide कम (29-मेर) आरएनए अनुक्रम से मेल खाती है 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 '15 cTAR इसकी डीएनए पूरक अनुक्रम 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-तीन जबकि'।
      1. उपर्युक्त Tris बफर में राल और cTAR दोनों solubilize (1.1.2।) 100 माइक्रोन स्टॉक समाधान बनाने के लिए। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर cTAR शेयर समाधान (aliquots के इन परिस्थितियों में महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है)। शाही सेना की लंबी अवधि के भंडारण के लिए, टीएआर के 20 μl aliquots बनानेशेयर समाधान, एक शून्य concentrator सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करते हुए प्रत्येक विभाज्य सूखी और -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान। हौसले से उपयोग करने से पहले, 20 μl DEPC इलाज पानी में प्रत्येक टीएआर विभाज्य resuspend।
        नोट: कार्य टीएआर aliquots के दो सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
  2. नेकां प्रोटीन और (12-55) नेकां पेप्टाइड
    1. रिपोर्ट के रूप में पूर्ण लंबाई पुनः संयोजक नेकां प्रोटीन तैयार करें। 16 स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में शेयर समाधान। 6410 एम -1 सेमी -1 के 280 एनएम पर एक विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग कर एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ सटीक प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
    2. सिंथेटिक (12-55) Tris-एचसीएल 10 मिमी 7.5 पीएच में नेकां पेप्टाइड Resuspend और -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में शेयर समाधान की दुकान। 5700 एम के 280 एनएम पर एक विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग कर एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर सही पेप्टाइड एकाग्रता का निर्धारण -1 सेमी -1।
      नोट: (12-55) नेकां पेप्टाइड एचपीएलसी शुद्ध और lyoph प्राप्त हुई थीजिंक क्लोराइड के दो समकक्ष युक्त समाधान के बाहर ilized।
  3. यौगिक 1
    1. एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर lyophilized यौगिक 1 के बारे में 1 मिलीग्राम वजन और एक उच्च एकाग्रता (≈10 मिमी) शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए, 100% DMSO के 100 μl, वक्त तौला में इसे भंग। इसके विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग कर एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर सटीक यौगिक एकाग्रता का निर्धारण (354 एनएम पर: 11,387 एम -1 सेमी -1)। उपयोग करने के लिए पूर्व -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में शेयर समाधान स्टोर।

2. जेल के जेल तंत्र और कास्टिंग की स्थापना

  1. शुष्क उन्हें दो, 70% इथेनॉल के साथ (लंबे समय से एक और एक कम) दो प्लेटों कुल्ला, जेल की स्थापना की, और अब तो थाली की लंबी किनारों के साथ दो 1 मिमी spacers के स्थान के लिए; छोटी प्लेट के साथ कवर, और नीचे में दो प्लेटों के लिए पंक्ति में सुनिश्चित करें।
  2. जेल कास्ट करने के लिए, supp के द्वारा दिए गए निर्देशों का पालन करेंLier (; सैंडविच clamps और ढेर प्रत्येक कास्टिंग तंत्र द्वारा प्रदान की जाती हैं अलग आपूर्तिकर्ताओं से थोड़ा अलग तंत्र का उपयोग करें)। सभी मामलों में, Clamps, ढेर और गास्केट साफ कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित हो, और पिछले उपयोगकर्ताओं द्वारा छोड़ा acrylamide का निशान हटा दें।
  3. कास्टिंग स्टैंड में इकट्ठे जेल सैंडविच प्लेस और आपूर्तिकर्ता द्वारा विशिष्ट निर्देशों का पालन करें।
    नोट: आमतौर पर कास्टिंग स्लॉट के तल पर एक साफ सिलिकॉन गैसकेट एक अच्छा सील सुनिश्चित करता है और जेल डालने के लिये जब लीक से बचने के लिए मदद करता है।
  4. गिलास प्लेटों के बीच एक pipet का उपयोग आसुत पानी डालना, लीक के लिए जाँच करने के लिए। सैंडविच को भरने और कोई लीक होती है कि सुनिश्चित करने के लिए कुछ मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए पानी जोड़ें। सैंडविच सही ढंग से इकट्ठा किया जाता है, पानी को निकालने और चश्मा सुखाने के लिए दो गिलास के बीच एक फिल्टर पेपर डालें। अखबार निकालें और अब सैंडविच जेल ढलाई के लिए तैयार है।
  5. कमरे के तापमान (आरटी, 25 डिग्री सेल्सियस) पर जेल डालो। Polyacrylamide अत्यधिक न्यूरोटौक्सिक है, दस्ताने पहनते हैं। हमेंगैर denaturing (पैतृक) की स्थिति में ई निरंतर 12% polyacrylamide जैल नाम परख करने के लिए।
    1. 12% जेल समाधान तैयार: 40% acrylamide का 12 एमएल मिश्रण / bisacrylamide (19/1) समाधान, 4 मिलीलीटर TBE 10x बफर (10x: Tris-एचसीएल 890 मिमी, Borate 890 मिमी, EDTA के 20 मिमी) और 24 मिलीलीटर MilliQ पानी । 400 μl ए पी और उपयोग करने से पहले तुरंत TEMED 50 μl जोड़ें। समाधान मिक्स और तेजी से गिलास प्लेटों के बीच समाधान नीचे डाल करने के लिए एक pipet का उपयोग करें। बुलबुले से बचने, गिलास प्लेटों के बीच कंघी का परिचय। पूरी तरह से सैंडविच भरने के लिए जेल समाधान जोड़ें।
  6. जेल 1 घंटा 45 मिनट के लिए भाजन करते हैं। इसके तत्काल बाद नमूना लोड करने से पहले, धीरे-धीरे कंघी को हटाने और अच्छी तरह से आसुत जल के साथ कुओं कुल्ला।
  7. Polymerization और कुओं rinsing चरणों के बाद, ऊर्ध्वाधर जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए तंत्र में जेल सैंडविच स्थान के लिए सप्लायर द्वारा विशिष्ट निर्देशों का पालन करें। एक शीतलन प्रणाली मौजूद है, तो भ्रष्टाचार में जेल प्रणाली के लिए जगह सुनिश्चित कर लेंठंडा कोर के रंगरूट की स्थिति।
  8. प्रणाली एक से अधिक जेल संभाल करने के लिए तैयार है, लेकिन केवल एक ही जेल में चलाने के लिए है, तो पूरा ऊपरी बफर चैम्बर फार्म करने के लिए दूसरे पक्ष पर ठंडा कोर करने के लिए बफर बांध के रूप में एक जेल सैंडविच देते हैं।
    नोट: बांध सही ढंग से नहीं रखा गया है, तो ऊपरी बफर जेल रन रोक संभवतः रिसाव जाएगा।
  9. (: Tris-एचसीएल 89 मिमी, Borate 89 मिमी, EDTA के 2 मिमी 1x) विआयनीकृत पानी में चल बफर TBE के 2.5 एल तैयार करें। ऊपरी बफर चैम्बर के लिए TBE बफर के अलावा लगभग 500 मिलीलीटर सेट और कम बफर चेंबर में शेष डालना। ऊपरी बफर चेंबर में शेष 500 मिलीलीटर TBE बफर डालो।
  10. एनोड और कैथोड उपयुक्त स्थिति में हैं, इसलिए है कि कम बफर चैम्बर के शीर्ष पर ढक्कन रखें।
  11. अगर वर्तमान नली का उपयोग कर एक पानी के नल के लिए, ठंडा कोर कनेक्ट करें। वैद्युतकणसंचलन दौरान एक गर्मी सिंक के रूप में कार्य है, और पानी के नल के चुनाव के दौरान कोर के माध्यम से प्रसारित करने देगा जो पानी के नल के साथ कोर, भरेंrophoresis।

3. nucleocapsid एनीलिंग की मध्यस्थता वैद्युतकणसंचलन (नाम) परख

  1. बफ़र की तैयारी
    1. TNMg बफर तैयार (1x: Tris-एचसीएल 10 मिमी, सोडियम क्लोराइड 20 मिमी, मिलीग्राम (ClO 4) 2 1 मिमी, पीएच 7.5) में DEPC इलाज पानी और 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर के साथ समाधान फ़िल्टर।
      नोट: TNMg बफर 7 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है। सबसे अच्छा तह और annealing परिणामों के लिए, हम ताजा बना buffers के उपयोग की सलाह देते हैं।
    2. एसडीएस युक्त जेल लोड हो रहा बफर तैयार (GLB एसडीएस: Tris-एचसीएल 100 मिमी, EDTA के 4 मिमी, डब्ल्यू 50% / वी ग्लिसरॉल, डब्ल्यू 2% / एसडीएस वी, 0.05% नीले वी bromophenol / डब्ल्यू) DEPC इलाज पानी में।
      नोट: GLB oligonucleotides के नमूने जेल प्रणाली में चल रहे हैं कितनी दूर ट्रैक करने के लिए मदद करता है और जेल में नमूने सिंक करने के लिए अनुमति देता है। GLB के लिए एसडीएस के अलावा नाम परख का इष्टतम सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इस कदम का पालन नहीं किया जाता है, यह जीई में न्यूक्लिक एसिड बैंड भेद करने के लिए संभव नहीं हैएल प्रणाली (चित्रा 2)।
  2. तैयारी नियंत्रण
    1. क्रमानुसार oligonucleotides के शेयर समाधान पतला और टार की एक एक माइक्रोन समाधान के 10 μl तैयार करने के लिए ताजा बना 10 माइक्रोन समाधान का उपयोग करें। अलग-अलग है, उसी तरह से तैयार है एक 1 माइक्रोन cTAR के 10 μl TNMg 1x बफर में। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रत्येक ट्यूब गर्मी और फिर उनके स्टेम उभार-पाश संरचनाओं कल्पना करने के लिए राल और cTAR के लिए आदेश में आरटी को शांत करने के लिए छोड़ दें।
    2. नियंत्रण के रूप में संकर टीएआर / cTAR की एक माइक्रोन समाधान तैयार है। 10 μl की कुल मात्रा में, TNMg 1x में 10 माइक्रोन cTAR की एक μl के साथ 10 माइक्रोन टार की एक μl मिलाएं। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूब हीटिंग द्वारा oligonucleotides के denature और इसे छोड़ टीएआर इसकी पूरक अनुक्रम cTAR करने के लिए पानी रखना और डबल असहाय संकर टीएआर / cTAR फार्म करने के लिए आदेश में आर टी करने के लिए धीरे-धीरे शांत करने के लिए।
    3. समाधान आरटी ठंडा करने के लिए कर रहे हैं, एक छोटी-स्पिन centrifugation के प्रदर्शन करते हैं। GLB एसडीएस के 3 μl जोड़ें, पिपेट ईएसीएच ट्यूब 3 बार के अंदर समाधान और बर्फ पर ट्यूब डाल दिया। लोड हो रहा है चरण तक बर्फ पर स्थिर नियंत्रण के नमूने रखें।
  3. नमूने तैयारी नेकां प्रोटीन और (12-55) नेकां पेप्टाइड गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए
    1. प्रत्येक नमूने के लिए ताजा बना 4 माइक्रोन oligonucleotide समाधान के 2.5 μl का प्रयोग करें। हमेशा pipetting त्रुटियों को रोकने के लिए प्रत्येक समाधान के एक छोटे से अतिरिक्त राशि तैयार करते हैं। उपर्युक्त नियंत्रण की तैयारी के लिए के रूप में रिपोर्ट TNMg 1x बफर में cTAR की है, अलग से, टार की चार माइक्रोन समाधान की 32.5 μl मोड़ो और (कदम 3.2.1।)।
    2. MilliQ पानी के साथ 80 माइक्रोन समाधान के लिए दोनों नेकां प्रोटीन का जायजा समाधान और (12-55) नेकां पेप्टाइड पतला।
    3. राल और cTAR समाधान आरटी ठंडा करने के लिए कर रहे हैं, दोनों ट्यूब की एक छोटी-स्पिन centrifugation के प्रदर्शन और नमूने ट्यूब की तैयारी शुरू करते हैं।
    4. ट्यूब autoclaved 12 खाली 0.5 मिलीलीटर तैयार करें। प्रयोगशाला नमूनों के लिए रैक में चार ट्यूबों के तीन पंक्तियों रखें। प्रत्येक पंक्ति वें विश्लेषण करने के लिए क्रमशः नमूने इंगित करता हैई पूर्ण लंबाई नेकां प्रोटीन, प्रोटीन के बिना नमूने और नमूने (12-55) नेकां पेप्टाइड गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए।
    5. हमेशा किसी भी समय एक अलग अभिकर्मक प्रयोग किया जाता है सुझावों की जगह।
    6. प्रत्येक ट्यूब में मुड़ा टीएआर के 2.5 μl और मुड़ा cTAR के 2.5 μl जोड़ें। नेकां की और (12-55) नेकां के विश्लेषण के लिए नमूने के 4 μl DEPC इलाज पानी जोड़ें। अन्य नमूने के 5 μl DEPC इलाज पानी जोड़ें।
    7. क्रमशः, के लिए नमूने के लिए 80 माइक्रोन नेकां के एक μl या 80 माइक्रोन (12-55) के एक μl नेकां जोड़ें, नेकां या (12-55) नेकां विश्लेषण।
    8. प्रत्येक ट्यूब 3 बार के अंदर समाधान pipetting, (चित्रा 1 में 'शून्य के रूप में रिपोर्ट) समय 0 मिनट नमूने के GLB एसडीएस के तुरंत तीन μl जोड़ें, और अंत में बर्फ पर ट्यूब डाल दिया। सभी नमूनों और नियंत्रण के लिए इस चरण को दोहराएँ। लोड हो रहा है चरण तक बर्फ पर स्थिर नमूने रखें।
    9. 15 मिनट, 30 मिनट और आरटी पर ऊष्मायन के 1 घंटे बाद, GLB एसडीएस के 3 μl जोड़ने के पूर्वी वायु कमान के अंदर समाधान पिपेटएच ट्यूब 3 बार और बर्फ पर ट्यूब डाल दिया। क्रमशः सभी नमूनों और नियंत्रण के लिए इस चरण को दोहराएँ, और लदान कदम जब तक बर्फ पर रहते हैं।
    10. जेल तंत्र के ढक्कन निकालें। लोड कुओं में प्रत्येक नमूने के 13 μl के रूप में पहले से एक अच्छी तरह से गठन कंघी के साथ जेल कास्टिंग द्वारा वर्णित गठन किया था। चित्रा 1 में रिपोर्ट के आदेश के बाद नमूने लोड।
    11. जेल तंत्र के ढक्कन बदलें। बिजली की आपूर्ति करने के लिए जेल तंत्र के सुराग संलग्न। इलेक्ट्रोड बिजली की आपूर्ति में सही स्लॉट में खामियों को दूर कर रहे हैं कि जाँच करें।
    12. सत्ता पर बारी और डाई जेल के नीचे से ऊपर 1.5 सेमी करने के लिए चले गए है, जब तक दो घंटा और 200 वी के एक निरंतर वोल्टेज पर 30 मिनट के लिए जेल चला रहे हैं।
  4. नमूना तैयार नेकां और (12-55) नेकां पर Anthraquinone गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए
    1. यौगिक एक शेयर समाधान पतला। 500 माइक्रोन के 10 μl, 250 माइक्रोन, परिसर के 50 माइक्रोन, 5 माइक्रोन कमजोर पड़ने को तैयार <MilliQ पानी में 1> मजबूत है।
    2. इसके बाद के संस्करण के रूप में रिपोर्ट नियंत्रण के नमूने तैयार (पैरा 3.2।)।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए ताजा बना 4 माइक्रोन oligonucleotide समाधान के 2.5 μl का प्रयोग करें। हमेशा pipetting त्रुटियों को रोकने के लिए प्रत्येक समाधान के एक छोटे से अतिरिक्त राशि तैयार करते हैं। TNMg 1x बफर में cTAR की है, अलग से, टार की चार माइक्रोन समाधान की 27.5 μl मोड़ो और ऊपर के रूप में (कदम 3.2.1।) का उल्लेख किया।
    4. पानी में 80 माइक्रोन समाधान के लिए दोनों नेकां प्रोटीन का जायजा समाधान और (12-55) नेकां पेप्टाइड पतला।
    5. राल और cTAR समाधान आरटी ठंडा करने के लिए कर रहे हैं, दोनों ट्यूब की एक छोटी-स्पिन centrifugation के प्रदर्शन और नमूनों की तैयारी शुरू करते हैं।
    6. ट्यूब autoclaved 20 खाली 0.5 मिलीलीटर तैयार करें। प्रयोगशाला नमूनों के लिए रैक में 10 ट्यूब प्रत्येक की दो पंक्तियों रखें।
    7. हमेशा किसी भी समय एक अलग अभिकर्मक प्रयोग किया जाता है सुझावों की जगह।
    8. मुड़ा टीएआर के 2.5 μl के साथ पहली पंक्ति के हर ट्यूब जोड़ें। मुड़ा cTAR के 2.5 μl साथ दूसरी पंक्ति के हर ट्यूब जोड़ें।
      9. एक कमजोर पड़ने टीएआर के लिए और cTAR करने के लिए (500 माइक्रोन कमजोर पड़ने के लिए 5 माइक्रोन से एकाग्रता में वृद्धि)। परिसर के अभाव में नेकां के विश्लेषण और (12-55) नेकां के लिए नमूनों में पानी के साथ मिश्रित बदलें। आरटी पर 15 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
    9. 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, संवाददाता टीएआर नमूने (पहली पंक्ति की ट्यूब) के साथ cTAR नमूने (दूसरी पंक्ति की ट्यूब) मिश्रण।
    10. क्रमशः, नेकां या (12-55) नेकां विश्लेषण के लिए नमूने के लिए 80 माइक्रोन नेकां के एक μl या 80 माइक्रोन (12-55) के एक μl नेकां जोड़ें।
    11. 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, GLB एसडीएस के 3 μl जोड़ने के प्रत्येक ट्यूब 3 बार पिपेट और बर्फ पर ट्यूब डाल दिया। नेकां और (12-55) नेकां के विश्लेषण के लिए नमूने का उपयोग कर, क्रमशः, इस चरण को दोहराएँ। लोड हो रहा है चरण तक बर्फ पर स्थिर नमूने रखें।
    12. जेल तंत्र के ढक्कन निकालें। कुओं में प्रत्येक नमूने के 13 μl लोड। छवि में सूचना दी आदेश के बाद नमूने लोडure 3 बी।
    13. जेल तंत्र के ढक्कन बदलें। बिजली की आपूर्ति करने के लिए जेल तंत्र के सुराग संलग्न। इलेक्ट्रोड बिजली की आपूर्ति में सही स्लॉट में खामियों को दूर कर रहे हैं कि जाँच करें।
    14. सत्ता पर बारी और डाई जेल के नीचे से ऊपर 1.5 सेमी करने के लिए चले गए है, जब तक दो घंटा और 200 वी के एक निरंतर वोल्टेज पर 30 मिनट के लिए जेल चला रहे हैं।
  5. नमूना तैयार: नेकां-preincubation मोड बनाम oligo-preincubation मोड
    1. यौगिक पतला एक शेयर समाधान। 500 माइक्रोन के 10 μl, 250 माइक्रोन, 50 माइक्रोन, MilliQ पानी में मिश्रित 1 से 5 माइक्रोन कमजोर पड़ने को तैयार है।
    2. इसके बाद के संस्करण के रूप में रिपोर्ट नियंत्रण के नमूने तैयार (पैरा 3.2।)।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए चार माइक्रोन oligonucleotide समाधान के 2.5 μl का प्रयोग करें। हमेशा pipetting त्रुटियों को रोकने के लिए प्रत्येक समाधान के एक छोटे से अतिरिक्त राशि तैयार करते हैं। उपरोक्त के रूप में TNMg 1x बफर में cTAR की है, अलग से, टार की चार माइक्रोन समाधान की 27.5 μl मोड़ो और (3.2 कदम0.1।)।
    4. पानी में 80 माइक्रोन समाधान के लिए दोनों नेकां प्रोटीन का जायजा समाधान और (12-55) नेकां पेप्टाइड पतला।
    5. राल और cTAR समाधान आरटी ठंडा करने के लिए कर रहे हैं, दोनों ट्यूब की एक छोटी-स्पिन centrifugation के प्रदर्शन और नमूनों की तैयारी शुरू करते हैं।
    6. हमेशा हर बार अभिकर्मकों बदल रहे हैं सुझावों की जगह या प्रतिक्रिया ट्यूब में निहित किसी भी अन्य तरल या समाधान को छुआ है।
    7. पर इस कदम से स्पष्ट रूप से लेबल और दो अलग-पूर्व ऊष्मायन प्रक्रियाओं के लिए नमूनों को अलग करने के लिए सुनिश्चित करें।
      1. Oligo-preincubation मोड
        1. ट्यूब autoclaved 10 खाली 0.5 मिलीलीटर तैयार करें। प्रयोगशाला नमूनों के लिए रैक में 5 ट्यूब की दो पंक्तियों रखें।
        2. मुड़ा हुआ टार की पहली पंक्ति में 2.5 μl के प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें। मुड़ा cTAR की दूसरी पंक्ति 2.5 μl के प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें।
        3. उपयुक्त परिसर के दो μl जोड़ें एक कमजोर पड़ने टीएआर के लिए और cTAR करने के लिए (500 माइक्रोन कमजोर पड़ने के लिए 5 माइक्रोन से एकाग्रता में वृद्धि)।परिसर के अभाव में नेकां के विश्लेषण के लिए नमूनों में पानी के साथ मिश्रित बदलें। आरटी पर 15 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
        4. 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, cTAR नमूने (दूसरी पंक्ति) लेने के लिए और संवाददाता टीएआर नमूने (पहली पंक्ति) के साथ डाल दिया।
        5. प्रत्येक नमूने के लिए 80 माइक्रोन नेकां के एक μl जोड़ें और आरटी पर 15 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
        6. 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, GLB एसडीएस के 3 μl जोड़ने के प्रत्येक ट्यूब 3 बार पिपेट और बर्फ पर ट्यूब डाल दिया। लोड हो रहा है चरण तक बर्फ पर स्थिर नमूने रखें।
      2. नेकां-preincubation मोड
        1. 5 खाली 0.5 मिलीलीटर autoclaved ट्यूबों को तैयार है और प्रयोगशाला नमूनों के लिए रैक में उन्हें जगह है।
        2. उपयुक्त यौगिक एक कमजोर पड़ने से प्रत्येक ट्यूब 4 μl में जोड़ें (500 माइक्रोन कमजोर पड़ने के लिए 5 माइक्रोन से एकाग्रता में वृद्धि)। परिसर के अभाव में नेकां के विश्लेषण के लिए नमूनों में पानी के साथ मिश्रित बदलें।
        3. 80 μ के प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें एक μl; एम नेकां आरटी पर 15 मिनट के लिए नमूने सेते हैं और।
        4. एक ट्यूब में मुड़ा cTAR के 15 μl के साथ जोड़कर टीएआर के 15 μl मिक्स और अगले चरण में इस टीएआर + cTAR समाधान का उपयोग करें।
        5. 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, टीएआर + cTAR मिश्रण समाधान के प्रत्येक नमूना 5 μl को जोड़ने और आरटी पर 15 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
        6. 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, GLB एसडीएस के 3 μl जोड़ने के प्रत्येक ट्यूब 3 बार पिपेट और बर्फ पर ट्यूब डाल दिया। लोड हो रहा है चरण तक बर्फ पर स्थिर नमूने रखें।
          नोट: कदम पर 3.5.8 से, विश्लेषण सभी नमूनों (3.5.7 से फिर से शुरू) के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है।
    8. जेल तंत्र के ढक्कन निकालें। कुओं में प्रत्येक नमूने के 13 μl लोड। चित्रा 4 में रिपोर्ट के आदेश के बाद नमूने लोड।
    9. जेल तंत्र के ढक्कन बदलें। बिजली की आपूर्ति करने के लिए जेल तंत्र के सुराग संलग्न। इलेक्ट्रोड पावर Suppl में सही स्लॉट में खामियों को दूर कर रहे हैं कि जांच करेंवाई।
    10. सत्ता पर बारी और डाई जेल के नीचे से ऊपर 1.5 सेमी करने के लिए चले गए है, जब तक दो घंटा और 200 वी के एक निरंतर वोल्टेज पर 30 मिनट के लिए जेल चला रहे हैं।

4. जेल और जेल धुंधला निकाल रहा है

  1. वैद्युतकणसंचलन के बाद, बिजली की आपूर्ति बंद कर देते हैं, और बिजली के सुराग काट। शीतलन प्रणाली के पानी के नल को बंद करें और कोर से नली काट।
  2. प्रणाली ठंडा किया गया था, तो ठंडा कोर को हटाने और दोनों कक्षों से बफर टपकना, ढक्कन निकालें, और।
  3. धीरे तंत्र से जेल सैंडविच अलग करना और कांच की प्लेटों से सभी clamps हटा दें। , प्लेटों से जेल को हटाने प्लेटों की ओर करने के लिए बाहर spacers के एक धक्का और ऊपर खींचने के लिए और दूर ऊपरी गिलास प्लेट को धीरे यह मोड़ करने के लिए। जेल के दो कोनों समझ और ग्लास से इसे हटाने के लिए धीरे यह लिफ्ट बंद।
  4. के लिए वांछित न्यूक्लिक एसिड धुंधला समाधान के साथ एक उपयुक्त कंटेनर में जेल रखेंसरगर्मी के साथ 30-45 मिनट।
  5. धुंधला करने के बाद जेल प्रणाली में न्यूक्लिक एसिड प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के लिए एक transilluminator इमेजिंग सिस्टम पर जेल में डाल दिया।

Representative Results

चित्रा 1 पूर्ण लंबाई पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ) मैं प्रदर्शन किया, nucleocapsid एनीलिंग मध्यस्थता वैद्युतकणसंचलन (नाम) परख के एक प्रतिनिधि के परिणाम से पता चलता है, द्वितीय) cTAR + टीएआर मिश्रण और आरटी पर 1 घंटे के लिए ऊपर incubating यानी प्रोटीन, और III के बिना ) (12-55) नेकां, एन टर्मिनल डोमेन के 11 एमिनो एसिड की कमी एक सिंथेटिक पेप्टाइड के साथ प्रदर्शन किया वही परख। चित्रा 1 में पूर्व मुड़ा राल और cTAR मिश्रित थे और annealed heteroduplex टीएआर के गठन / cTAR प्रोटीन के अभाव में, (चित्रा 1 की बाईं गलियों) पूर्ण लंबाई पुनः संयोजक नेकां की उपस्थिति में नजर रखी थी (सेंट्रल गलियों ), और चित्रा 1 में छोटा (12-55) नेकां पेप्टाइड (सही गलियों की उपस्थिति में)। नियंत्रण कर रहे हैं: उनकी धीमी annealin द्वारा पीछा cTAR के लिए टार की है stably मुड़ा संरचनाओं के थर्मल विकृतीकरण के माध्यम से प्राप्त की, cTAR मुड़ा टीएआर मुड़ा, और संकर (टीएआर / cTAR) annealedजी। 14

विस्तारित heteroduplex हेलिक्स में दो स्थिर न्यूक्लिक एसिड दृश्यों denature नेकां की क्षमता स्पष्ट रूप से स्पष्ट है: पूर्ण लंबाई नेकां प्रोटीन टीएआर / cTAR संकर के गठन के लिए तुरंत ओर जाता है: 0 'नेकां के अलावा के बीच गुजर रहा है कम से कम समय इंगित करता है नमूने और प्रतिक्रिया बंद हो जाता है, जो जेल लोड हो रहा बफर, के अलावा; पूर्ण गठन के पहले से ही 15 'ऊष्मायन समय के बाद हासिल की है। annealed heteroduplex की तीव्रता में वृद्धि मुड़ा cTAR और टार oligonucleotides की तीव्रता में कमी समानताएं। heteroduplex गठन, छोटा फार्म की उपस्थिति में भी हासिल सिंथेटिक पेप्टाइड की जैविक गतिविधि की पुष्टि, (12-55) नेकां अर्थात् है। प्रोटीन या heteroduplex गठन नहीं मनाया जाता है पेप्टाइड की, और राल और cTAR oligonucleotides के अभाव में heteroduplex में कमरे के तापमान (चित्रा 1) में पानी रखना नहीं होगा। मेंसभी प्रयोगों, अस्थिर मध्यवर्ती समय के साथ कम होती है कि (चित्रा 1 में "मध्यवर्ती परिसरों") के तेजी से गठन लगातार सही न्यूक्लिक एसिड तह तक cTAR की hairpins और टीएआर के माध्यम से कतरा विनिमय के प्रस्तावित तंत्र के साथ मनाया जाता है। 17

प्रयोग के एक संभव समस्या निवारण जेल लोड हो रहा बफर में एसडीएस की कमी है। GLB में एसडीएस के अभाव में प्रतिक्रिया का परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है और GLB + एसडीएस के साथ परिणाम की तुलना में है। पूर्व मुड़ा राल और cTAR मिश्रित और आरटी पर तीन घंटे के लिए incubated रहे थे की पुनः संयोजक पूर्ण लंबाई नेकां प्रोटीन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए। एसडीएस (GLB) के बिना एक आधा जेल लोड हो रहा बफर करने के लिए अन्य आधा करने के लिए GLB एसडीएस (GLB एसडीएस) के साथ था, जबकि जोड़ा गया है: ऊष्मायन के बाद नमूनों दो में विभाजित किया गया। नमूने जेल पर लोड किया गया है, और न्यूक्लिक एसिड बैंड की स्थिति से चलाने के जेल जाने के बाद कल्पना की गई थीडाई धुंधला। यह उम्मीद की जाती है और प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के बीच एक मजबूत बंधन इंगित करता है: नेकां मौजूद था लेकिन नमूने GLB साथ भरी हुई थी, जब सभी न्यूक्लिक एसिड बैंड ऊपर स्थानांतरित कर दिया गया। GLB एसडीएस के साथ परिणाम जेल के चरम सही में दिखाया जाता है: एसडीएस के अलावा नियंत्रण के साथ तुलना की अनुमति, प्रोटीन denatures और प्रोटीन के साथ स्थायी परिसर से न्यूक्लिक एसिड विज्ञप्ति।

नाम परख गतिशील न्यूक्लिक एसिड संरचनाओं को स्थिर करने और नेकां निगरानी गतिविधि को बाधित करने के लिए intercalators सूत्रण की क्षमता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। 14 सूत्रण intercalators ऐसे Anthraquinone के रूप में अंगूठी प्रणाली के विपरीत साइटों पर स्थित भारी पक्ष चेन, द्वारा प्रतिस्थापित तलीय खुशबूदार अणु होते हैं चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। 18 ये intercalators न्यूक्लिक एसिड की डबल हेलिक्स के माध्यम से धागा करने में सक्षम हैं, अंत में डबल से प्रत्येक नाली में उनके पक्ष श्रृंखला लगानेहेलिक्स। 19,20

3B चित्रा पूर्ण लंबाई नेकां की उपस्थिति में या छोटा पेप्टाइड का यौगिक 1, एक ज्ञात सूत्रण intercalator, 18 की उपस्थिति में नाम परख के परिणाम से पता चलता है। दोनों ही मामलों में, नेकां द्वारा टीएआर / cTAR संकर के गठन, जबकि एक ही समय में, मुक्त, टार और cTAR बढ़ जाती है की राशि intercalator की एकाग्रता में वृद्धि से कम है। एन टर्मिनल पूंछ (12-55NC) की कमी प्रोटीन का छोटा फार्म अपनी गतिविधि का निषेध करने के लिए और अधिक संवेदनशील है: इस अंतर को अब तक सभी परीक्षण यौगिकों के साथ सत्यापित किया गया था।

नाम परख, या मुड़ा न्यूक्लिक एसिड substrates के साथ 15 मिनट के लिए परीक्षण परिसर preincubating द्वारा दो मायनों में, या तो मुड़ा oligonucleotides (नेकां-preincubation मोड) के अलावा द्वारा पीछा नेकां के साथ परीक्षण यौगिक, पूर्व incubating द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है , नेकां के अलावा और 15 मिनट (oligo-जनसंपर्क के लिए एक और ऊष्मायन द्वारा पीछाeincubation मोड)। समग्र ऊष्मायन समय दो अलग मोड में एक ही है, नेकां के अलावा पहले मुड़ा oligonucleotides के साथ preincubation मुड़ा न्यूक्लिक एसिड में intercalators के सूत्रण के लिए और अधिक समय की अनुमति देता है। यह उनके गतिशील संरचनाओं के एक मजबूत स्थिरीकरण में और नेकां निगरानी गतिविधियों का एक आसान निषेध में यह परिणाम है। चित्रा 4 में दिखाया गया के रूप में दो मोड में NAME परख का विश्लेषण इसलिए, नेकां अवरोधकों की कार्रवाई के तंत्र में मतभेद को बढ़ाता है: यौगिक एक oligo-preincubation मोड में नाम से विश्लेषण किया गया था जब (चित्रा 4, बाएँ पर गलियों) बहुत कम निषेध नेकां-preincubation मोड में मनाया जाता है, जबकि यह, नेकां की मध्यस्थता annealing के प्रबल निषेध से पता चलता है (चित्रा 4, सही में गलियों)। इस परख के साथ और इन शर्तों, प्रत्येक अनुभव में संबंधित यौगिकों के सेट स्क्रीनिंग जबकि निरोधात्मक सांद्रता के निर्धारण के लिए कृपया ध्यान दें किजाहिर तीन प्रतियों (विशेष रूप से आईसी 50 मूल्य के आसपास) निकट दूरी सांद्रता का उपयोग करने में कम से कम किया जाना चाहिए। 14

चित्रा 1
चित्रा 1:। पूर्ण लंबाई नेकां के साथ और छोटा कर दिया (12-55) नेकां तह राल और cTAR, प्रत्येक 1 माइक्रोन के साथ नाम परख, पुनः संयोजक नेकां के साथ या के साथ incubated रहे थे (12-55) नेकां (oligos / नेकां = 1 / 8) 0 मिनट, 15 मिनट, 30 मिनट और 1 घंटे के लिए। प्रोटीन (0 मिनट, 15 मिनट, 30 मिनट और एक घंटा) की अनुपस्थिति में incubated राल और cTAR नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। तह टार, मुड़ा cTAR और संकर टीएआर / cTAR इन विट्रो annealing के नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया द्वारा पीछा थर्मल विकृतीकरण के बाद प्राप्त की। प्रतिक्रियाओं तो GLB एसडीएस उपयोग बंद कर दिया गया। नमूने TBE 1x में एक 12% polyacrylamide जेल पर सुलझाया गया; जेल पर वैद्युतकणसंचलन न्यूक्लिक एसिड के बाद दाग रहे थे और एक transilluminator पर पता लगाया है।

चित्रा 2
चित्रा 2:। टीएआर विश्लेषण करते समय जेल लोड हो रहा बफर में एसडीएस का प्रभाव (GLB) / TNMg 1x में prefolded नेकां राल और cTAR, द्वारा cTAR annealing के पूर्ण लंबाई पुनः संयोजक नेकां (oligos / नेकां = 1/8) 3 के लिए साथ incubated रहे थे कमरे के तापमान पर या 37 डिग्री सेल्सियस पर घंटा। GLB या GLB एसडीएस तो नेकां के साथ incubated नमूने के लिए जोड़ा गया था। नियंत्रण: टार, cTAR और annealed संकर टीएआर / cTAR (प्रत्येक 1 माइक्रोन)। वैद्युतकणसंचलन TBE 1x में एक 12% polyacrylamide जेल का उपयोग किया गया था; जेल पर वैद्युतकणसंचलन न्यूक्लिक एसिड के बाद दाग रहे थे और एक transilluminator पर पता लगाया है। यह आंकड़ा चित्रा S4 से संशोधित किया गया है। Sosic, ए एट अल डिजाइन, संश्लेषण और एचआईवी -1 nucleocapsid inhibitors के रूप में राल और cTAR बाँधने की जैविक मूल्यांकन MedChemComm 4, 1388-1393, Doi:। / C3md00212h (2013) 10.1039 ।

"> चित्रा 3
चित्रा 3: नाम परख द्वारा मूल्यांकन intercalator एक सूत्रण के सूत्रण intercalator 1. (बी) (ए) रासायनिक संरचना प्रभाव। राल और cTAR, प्रत्येक 1 माइक्रोन मुड़ा, प्रत्येक 8 माइक्रोन पूर्ण लंबाई नेकां के साथ या (12-55) नेकां के साथ मिश्रित एक का संकेत दिया सांद्रता की उपस्थिति में incubated रहे थे। CTAR और बढ़ाया heteroduplex टीएआर मुड़ा मुड़ा टार, / cTAR नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। प्रतिक्रियाओं तो GLB एसडीएस उपयोग बंद कर दिया गया। नमूने TBE 1x में एक 12% polyacrylamide जेल पर सुलझाया गया; जेल पर वैद्युतकणसंचलन न्यूक्लिक एसिड के बाद दाग रहे थे और एक transilluminator पर पता लगाया है।

चित्रा 4
चित्रा 4: नेकां-preincubation मोड बनाम oligo-preincubation: नाम परख पर प्रभाव oligo-preincubation आधुनिक।ई। मुड़ा राल और cTAR मुड़ा, प्रत्येक 1 माइक्रोन, पूर्ण लंबाई नेकां (8 माइक्रोन) नेकां-preincubation की उपस्थिति में अतिरिक्त 15 मिनट के लिए और फिर 15 मिनट के लिए सूत्रण intercalator एक का संकेत दिया सांद्रता के साथ preincubated थे, और विधि: सूत्रण intercalator एक के संकेत सांद्रता 15 मिनट के लिए पूर्ण लंबाई नेकां (8 माइक्रोन) के साथ preincubated, और फिर अतिरिक्त 15 मिनट के लिए मुड़ा टीएआर की उपस्थिति में और cTAR, प्रत्येक 1 माइक्रोन तह थे। CTAR और बढ़ाया heteroduplex टीएआर मुड़ा मुड़ा टार, / cTAR नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। सभी प्रतिक्रियाओं अंत में GLB एसडीएस उपयोग बंद कर दिया गया। नमूने TBE 1x में एक 12% polyacrylamide जेल पर सुलझाया गया; जेल पर वैद्युतकणसंचलन न्यूक्लिक एसिड के बाद दाग रहे थे और एक transilluminator पर पता लगाया है।

Discussion

नाम तेजी से एचआईवी -1, उपन्यास विरोधी एचआईवी दवाओं की खोज में एक दिलचस्प लक्ष्य की nucleocapsid प्रोटीन की निगरानी गतिविधि के निषेध का आकलन करने की अनुमति देता है कि एक परख है। नेकां तेजी से और जिसका स्थिर तह अन्यथा सावधान annealing द्वारा पीछा उच्च तापमान पर थर्मल विकृतीकरण की आवश्यकता होगी कमरे के तापमान न्यूक्लिक एसिड पर anneals। परख या तो पूर्ण लंबाई नेकां के साथ या छोटा (12-55) नेकां के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है: दोनों ही मामलों में दो न्यूक्लिक एसिड (आरएनए और उसके पूरक डीएनए प्रतिलिपि) तेजी से annealed रहे हैं। यह छोटा नेकां पेप्टाइड के साथ साहित्य अवलोकन के साथ संगत है: annealing के टीएआर शिखर लूप के पूरक अनुक्रम के साथ, एक कमजोर नेकां बाध्यकारी साइट है जो इसकी पूरक शिखर पाश, की बातचीत के द्वारा पीछा cTAR के स्टेम के कुशल पिघलने द्वारा शुरू की है, विस्तारित annealed संकर करने के लिए कई अस्थिर मध्यवर्ती के माध्यम से समाप्त। 21

नेकां एक बहुत ही स्थिर prot हैEin और कुछ समस्याओं का प्रदर्शन कर नाम हो सकता है, जबकि। यह लक्ष्य प्राप्त नहीं है, तो जेल सही स्थिति में न्यूक्लिक एसिड बैंड दिखाई नहीं देंगे: यह हालांकि बफर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए किया जाता जेल लोड हो रहा में ताजा बना एसडीएस जोड़ने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। कि सही ढंग से प्रोटीन denature और न्यूक्लिक एसिड के साथ अपने तंग जटिल से इसे जारी करने के लिए जेल लोड हो रहा बफर में मौजूद होना चाहिए जेल वैद्युतकणसंचलन एसडीएस से टीएआर / cTAR heteroduplex कल्पना करने के लिए तो वास्तव में, नेकां, एक न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी प्रोटीन होता है। यह भी जेल चलाने के दौरान स्थानांतरित कर दिया बैंड के गठन यानी प्रयोग की संभावित समस्या निवारण है। इस आशय की पूरी लंबाई नेकां चित्रा 2, के रूप में नियुक्त किया गया था जब विशेष रूप से स्पष्ट है, और न्यूक्लिक एसिड पर एक मजबूत कुल प्रभाव रहा, अत्यधिक बुनियादी एन टर्मिनल पूंछ की उपस्थिति से जुड़ा हुआ है।

टर्मिनल बुनियादी पूंछ की उपस्थिति दिखाने के रूप में, annealing के प्रतिक्रिया और अधिक कठिन हिचकते जा करने के लिए बनाता हैएन चित्रा 3 का उपयोग यौगिक एक, एक प्रतिनिधि सूत्रण intercalator, टार की और cTAR की स्टेम पाश संरचनाओं को स्थिर करने में विशेष रूप से कुशल यानी एक intercalator में। वास्तव में, न्यूक्लिक एसिड के साथ बातचीत के इस प्रकार के bulges और छोरों आधार जोड़े में भारी substituents का एक आसान सूत्रण के लिए अनुमति देता है, डबल हेलिक्स निरंतरता को बाधित जब इष्ट है। इन न्यूक्लिक एसिड बाँधने से राल और cTAR का स्थिरीकरण पहले से दो oligonucleotides के पिघलने के तापमान में वृद्धि का दृढ़ संकल्प से विश्लेषण किया गया था। 14 इसके अलावा, तापमान के पिघलने में वृद्धि एचआईवी -1 नेकां द्वारा उत्प्रेरित annealing के निषेध के साथ संबद्ध, heteroduplex टीएआर / cTAR का कम गठन के लिए अग्रणी और सूत्रण intercalators ऐसे टीएआर तत्व के रूप में शाही सेना के गतिशील संरचनाओं के लिए बाँधने का एक दिलचस्प वर्ग के हैं यह दर्शाता है कि। 14

कार्रवाई के तंत्र इन कम्पो के लिए लागूचित्रा 4 में दिखाया गया है unds इसके अलावा, विभिन्न वैकल्पिक स्वरूपों में नाम परख प्रदर्शन द्वारा मान्य किया जा सकता है: intercalators के मामले में annealed heteroduplex के निषेध बढ़ाया है दवा दो मुड़ा oligos के साथ incubated है। ऐसे नेकां प्रोटीन के प्रत्यक्ष बाँधने के रूप में कार्रवाई की अलग व्यवस्था है, के साथ अभिनय यौगिकों, अलग preincubation मोड से कम प्रभावित होगा। नाम परख इसलिए नेकां अवरोधकों की पहचान के लिए यौगिकों के पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दो तरीकों में प्रदर्शन किया है, और नेकां पर लक्षित विरोधी एचआईवी दवाओं के लिए खोज करते हुए भी सकारात्मक हिट की कार्रवाई की ख्यात तंत्र का आकलन करने के लिए। जाहिर है, पहचान नेकां अवरोधकों की कार्रवाई का एक विशिष्ट तंत्र के लिए दावा करने के लिए जब अकेले इन तकनीकों के उपयोग के लिए पर्याप्त नहीं है, और अन्य उपयुक्त जैव रासायनिक assays काम कर परिकल्पना को बनाए रखने की जरूरत है। 14

अंत में, यह नाम है अत्यधिक उपयोग करता है कि बल दिया जाना चाहिएपरीक्षण किया यौगिकों द्वारा नेकां के "इन विट्रो में" निषेध पर कीमती जानकारी देने के संयोजक या सिंथेटिक या तो शुद्ध एंजाइमों,। यह "ताकत और कमजोरी" परख की है: नाम अच्छी तरह से आभासी स्क्रीनिंग पूरक कर सकते हैं और आणविक मॉडलिंग तेजी संरचना गतिविधि संबंध बनाने और विश्लेषण करने के लिए सक्षम करने के लिए और अंततः संश्लेषण और नशीली दवाओं के डिजाइन पुनः निर्देशित दवाओं की खोज कार्यक्रमों के प्रारंभिक चरणों में दृष्टिकोण। अन्य जैव रासायनिक assays एचआईवी में नशीली दवाओं के विकास परियोजनाओं में इस्तेमाल किया लेकिन, जैसा कि नाम से वायरस से संक्रमित कोशिकाओं में ख्यात अवरोधकों के प्रभावों के बारे में जानकारी देने के लिए नहीं होगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. Metabion International AG Store the stock  solution at -20 °C 
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.   Metabion International AG Store the stock aliquot at -80 °C 
(12-55)NC peptide EspiKem srl Store the stock solution at -20 °C
1.5 ml tubes Eppendorf 0030 120 086 Autoclave before use
0.5 ml tubes Eppendorf 0030 121 023 Autoclave before use
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µl Sarstedt 701,130,210
Biosphere Filter Tips 2-20 µl Sarstedt 70,760,213
Biosphere Filter Tips 200 µl Sarstedt 70,760,213
Syringe Filter 0.22 µm Biosigma srl 51,798
Ethanol Carlo Erba 414631
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich 71725-50G
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-1L
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 71376-1KG
Boric Acid Sigma-Aldrich B0252-2.5KG
Ethylenediaminetetraacetic Acid Sigma-Aldrich E5134-500G
Magnesium Perchlorate Sigma-Aldrich 222283-100G Store the 1 M solution at -20 °C
Glycerol Sigma-Aldrich 49770-1L
Bromophenol Blue GE Healthcare Life Sciences 17-1329-01
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-100ML
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A7460-500G Prepare the 10% solution freshly before use
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) Merck Millipore 1006401000 Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting
Tris ultrapure Applichem A1086,1000
DEPC-treated water Ambion AM9922
Centrifuge 5415R Eppendorf 22,621,408
NanoDrop 1000 spectrometer Thermo Scientific
UV-VIS spectrometer Lambda 20 Perkin Elmer
Protean II xi Cell Bio-Rad 165-1803
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
SybrGreen II RNA Gel Staining Lonza 50523 Make the 1/10,000 dilution in TBE 1x. Store it in the dark at 4 °C for two weeks.
Geliance 600 Imaging System Perkin Elmer

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 95 एचआईवी -1 nucleocapsid प्रोटीन NCp7 टीएआर-शाही सेना डीएनए oligonucleotides annealing जेल वैद्युतकणसंचलन नाम
Nucleocapsid एनीलिंग की मध्यस्थता वैद्युतकणसंचलन (नाम) परख एचआईवी -1 nucleocapsid inhibitors का तेजी से पहचान की अनुमति देता है
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Sosic, A., Cappellini, M.,… More

Sosic, A., Cappellini, M., Scalabrin, M., Gatto, B. Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors. J. Vis. Exp. (95), e52474, doi:10.3791/52474 (2015).

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