Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nucleocapsid annealing-mediert elektroforese (NAVN) analysen Lar Rapid Identifikasjon av HIV-1 nucleocapsid hemmere

Published: January 19, 2015 doi: 10.3791/52474
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2The RNA Institute, SUNY Albany

Abstract

RNA eller DNA brettes i stabil tridimensional folding er interessante mål for utviklingen av antitumor eller antivirale midler. I tilfellet av HIV-1, virale proteiner som er involvert i reguleringen av virusaktivitet gjenkjenne flere nukleinsyrer. Nukleokapsidet protein NCp7 (NC) er et nøkkelprotein som regulerer flere prosesser i løpet av virusreplikasjon. NC er faktisk en anstand destabilisere de sekundære strukturer av RNA og DNA, og lette deres glødning. Inaktivering av NC er en ny tilnærming og et interessant mål for anti-HIV-behandling. N ucleocapsid A nnealing- M E-mediet lectrophoresis (NAME) assay ble utviklet for å identifisere molekyler i stand til å inhibere smelting og annealing av RNA og DNA brettes i termodynamisk stabile tridimensional konformasjoner, for eksempel hårnålstrukturer av tjære og cTAR elementer av HIV, etter nukleokapsidet proteinet av HIV-1. Den nye analysen benytter enten recombinant eller syntetisk protein, og oligonukleotider uten behov av deres tidligere merking. Analysen av resultatene oppnås ved standard polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) etterfulgt av konvensjonell nukleinsyre farging. Av protokollen angitt i dette arbeidet beskriver hvordan å utføre NAME analysen med full-lengde proteinet eller dets forkortede versjonen som mangler den grunnleggende N-terminale domene, både kompetente som nukleinsyrer anstand, og hvordan man skal vurdere inhibisjon av NC anstand aktivitet ved en threading intercalator. Videre kan NAME utføres i to forskjellige moduser, som er nyttig for å oppnå indikasjoner på den antatte virkningsmekanisme av de identifiserte NC-inhibitorer.

Introduction

Den nukleokapsid protein NCp7 (NC) av humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) er en liten, basisk protein som er tett forbundet med genomisk RNA i den modne infeksiøs virus, som spiller en sentral rolle i virusreplikasjon som en kofaktor i løpet av revers transkripsjon , genom gjenkjennelse og emballasje. 1-3 NC fungerer som en nukleinsyre anstand kata destabilisering av stabile nukleinsyre-konstruksjoner og annealing av komplementære sekvenser. Sin nukleinsyre aggregere aktivitet ligger først og fremst i de 11 aminosyrene N-terminal domene mens duplex destabiliserende virksomhet er kartlagt til sine sink finger strukturer (12-55 peptid). 4 Den positivt ladet protein senker elektro barrieren av annealing reaksjon og øker hastigheten ved hvilken to separate komplementære sekvenser kommer sammen.

Nukleinsyrer brettes i stabil konformasjon krever anstand aktiviteter av NC ytterligere å forenklee deres annealing 5 Dette er spesielt viktig ved revers transkripsjon, der NC er kritisk i trådoverføringsarrangementer.: i minus tråd overføring, minus tråd stopp DNA, bare retrotranscribed, må overføres og hybridisert til en komplementær sekvens i R-regionen ved 3'-enden av RNA-genomet mal. 6. Selv om termodynamisk favorisert, denne reaksjon ikke forekommer i stor utstrekning i fravær av NC på grunn av tilstedeværelsen av stabil struktur av trans aktivering responsive region (TAR) RNA i R regioner som må være knyttet til sin DNA-kopi (cTAR DNA). 7 cTAR og TAR er faktisk svært strukturerte regioner med en karakteristisk stilk-løkke konformasjon. NC protein denatures disse hårnåler, og fremmer minus-strand overføring ved å øke frekvensen av inter annealing mellom de komplementære nukleinsyrekjeder. Mekanismen for NC annealing av TAR og cTAR har blitt grundig undersøkt og derives som TAR annealing analysen i flere forskningsartikler og den foreslåtte ordningen er avbildet i gode anmeldelser. 8-11 oppsummerer, destabiliserer NC den sekundære strukturen stabil RNA som TAR-RNA, destabiliserer den sekundære strukturen i sin komplementære sekvens, cTAR-DNA og fremmer annealing omsetning av RNA / DNA fører til TAR / cTAR heterodupleks dannelse. 10,11 Som et resultat, blir strengen-overføringstrinnet under HIV-replikasjon foretrekkes. 12

NC er et attraktivt mål for utvikling av nye antivirale midler ettersom eventuelle forstyrrelser indusert av små molekyler mot NC ville resultere i en reduksjon av revers transkripsjon av det virale genomet som en konsekvens av en nedsatt NC aktivitet. 2,13 Denne tilnærmingen kunne til slutt føre til utviklingen av vellykkede anti-HIV-midler. I løpet av en screening for NC-hemmere 14 vi utviklet en analyse stole på de kjente egenskaperav nucleocapsid å effektivt destabilisere og annealing utfyllende oligonukleotider. 10,11 Vi kalte det N ucleocapsid En nnealing- M-mediet E lectrophoresis (NAVN) analysen. NAVN analysen benytter NC å mediere gløding mellom stabilt strukturerte kopier av komplementære nukleinsyrer, i vårt tilfelle av oligonukleotidet som svarer til den apikale del av en TAR-RNA-sekvens med dens komplementære DNA-sekvens (cTAR) for å gi den hybride TAR / cTAR heterodupleks . Analysen av TAR / cTAR annealing reaksjonen i nærvær av NC kan undersøkes ved mors polyakrylamid gelelektroforese (PAGE).

Denne protokollen viser hvordan man skal utføre NAME analysen raskt bindes ved romtemperatur oligonukleotider foldet i stabile hårnålstrukturer, å analysere resultatet av reaksjon og feilsøking av forsøket. Radioaktiv merking av nukleinsyren ikke er forespurt, og detectipå over oligonukleotid-bånd kan utføres ved konvensjonelle farvemetoder. Analysen, som anvender enten rekombinant full-lengde proteinet eller en forkortet versjon av syntetisk NC, muliggjør identifisering av gjenge interkalatorer som hemmer NC, en aktivitet som er vist å korrelere med sterk binding til RNA og DNA. 14

Protocol

1. Utarbeidelse av materiell, nukleinsyrer og proteiner

  1. Nukleinsyrer
    1. Autoklavere 1,5 ml rør og lagre dem i en steril beholder. Utfør hvert trinn ved hjelp av sterile filterspisser for å eliminere forurensende stoffer dvs. nukleaser fra laboratorie forbruksvarer.
    2. Forbered Tris-HCl 10 mM fosfatbuffer pH 7,5 i DEPC-behandlet vann og filtrerer oppløsningen med et 0,22 um porestørrelse filter.
    3. MERK: oligonukleotid kalt "tjære" svarer til den korte (29-mer) RNA sekvensen 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 '15 mens cTAR er dens DNA-komplementære sekvens 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3'.
      1. Oppløse både TAR og cTAR i Tris buffer ovenfor nevnt (1.1.2.) For å gjøre 100 mikrometer stamløsninger. Butikk cTAR stamløsning ved -20 ° C (alikvoter kan lagres i flere måneder under disse betingelser). For langtidslagring av RNA, gjør 20 ul porsjoner av TARstamløsning, tørk hver prøve ved hjelp av en vakuumsentrifuge konsentrator og lagre dem ved -80 ° C. Fersk før bruk, suspender hver TAR delmengde i 20 ul DEPC-behandlet vann.
        MERK: Working TAR porsjoner kan lagres ved -20 ° C i to uker.
  2. NC protein og (12-55) NC peptid
    1. Klargjør det full-lengde rekombinante NC protein som rapportert. 16. Oppbevar stamløsning i alikvoter ved -20 ° C. Fastslå den eksakte protein konsentrasjon med et UV-Vis spektrofotometer ved hjelp av en ekstinksjonskoeffisient på 280 nm fra 6410 M -1 cm -1.
    2. Resuspender syntetiske (12-55) NC peptid i Tris-HCl 10 mM pH 7,5 og oppbevares i forrådsoppløsning i alikvoter ved -20 ° C. Bestemme riktig peptidkonsentrasjonen på et UV-Vis spektrofotometer ved hjelp av en ekstinksjonskoeffisient ved 280 nm av 5,700 M -1 cm -1.
      MERK: (12-55) NC peptid ble innhentet HPLC renset og lyophilized ut av en oppløsning inneholdende to ekvivalenter av sink-klorid.
  3. Forbindelse 1
    1. Veie omtrent 1 mg av den frysetørkede forbindelse 1 ved å bruke en analytisk vekt og oppløse den i 100 pl 100% DMSO, opportunely veies, for å oppnå en høy konsentrasjon (≈10 mM) stamløsning. Fastslå den eksakte konsentrasjon av forbindelsen på en UV-Vis spektrofotometer bruker sin ekstinksjonskoeffisient (ved 354 nm: 11387 M -1 cm -1). Oppbevar stamløsning i mørket ved -20 ° C før bruk.

2. Sette opp av Gel Apparatus og Støping av Gel

  1. Slik setter du opp gel, skyll to plater (en lang og en kortere) med 70% etanol, la dem tørke, og deretter plassere to 1 mm mellomlegg langs de lange kantene på lengre plate; dekke den med kort plate, og sørg for å justere de to platene nederst.
  2. Å kaste gel, følg instruksjonene fra supplier (forskjellige leverandører bruker litt forskjellig apparater; sandwich-klemmer og stabler er gitt av hver støpeapparat). I alle tilfeller, være sikker på at klemmer, stabler og pakninger er rene, og fjerne spor av akrylamid forlatt av tidligere brukere.
  3. Plasser den monterte gel sandwich i støpe stå og følge spesifikke instruksjoner fra leverandøren.
    MERK: Normalt en ren silikonpakning på bunnen av støpesporet sikrer en god tetning, og bidrar til å unngå lekkasje når helle gelen.
  4. Å se etter lekkasjer, hell destillert vann ved hjelp av en pipette mellom glassplatene. Tilsett vann for å fylle opp sandwich og vente noen minutter for å være sikker på at ingen lekkasjer oppstår. Hvis sandwich er korrekt montert, fjerne vannet og sett et filter papir mellom de to briller for å tørke brillene. Fjern papiret og nå sandwich er klar for gel avstøpning.
  5. Hell gelen ved romtemperatur (RT, 25 ° C). Siden polyakrylamid er svært nevrotoksisk, bruk hansker. Osse kontinuerlige 12% polyakrylamidgeler i ikke-denaturerende (native) forhold til å utføre NAVN analysen.
    1. Klargjør 12% gel-løsning: bland 12 ml av 40% akrylamid / bisakrylamid (19/1) oppløsning, 4 ml TBE-buffer 10 x (10 x: Tris-HCl-890 mM, 890 mM borat, EDTA 20 mM) og 24 ml MilliQ vann . Legg 400 mL APS og 50 III TEMED umiddelbart før bruk. Blande løsningen og raskt å bruke en pipette for å helle løsningen ned mellom glassplatene. Introdusere kammen mellom glassplatene, unngå bobler. Legg gel-løsning for å fylle fullstendig sandwich.
  6. La gelen polymerisere i 45 minutter til 1 time. Umiddelbart før prøven lasting, fjern kammen sakte og skyll brønnene grundig med destillert vann.
  7. Etter polymerisasjonsforsøkene og brønner skylling skritt, følge de spesifikke instruksjoner av leverandøren for å plassere gel sandwich i apparatet for vertikal gel elektroforese. Hvis et kjølesystem er til stede, sørg for å plassere gel system i correkt stilling av kjølekjernen.
  8. Dersom systemet er konstruert for å håndtere mer enn en gel, men bare en gel må løpe, feste en gel-sandwich som buffer dam til kjølekjernen på den annen side for å danne den komplette øvre bufferkammeret.
    MERK: Hvis dammen ikke er plassert riktig, vil den øvre buffer lekke muligens stoppe gel løp.
  9. Forbered 2,5 L TBE buffer (1 x: Tris-HCl 89 mM, 89 mM borat, EDTA 2 mM) i avionisert vann. Beskikket omtrent 500 ml TBE-buffer for den øvre bufferkammeret og helle resten i den nedre bufferkammeret. Hell den resterende 500 ml TBE-buffer inn i den øvre bufferkammeret.
  10. Plassere lokket på toppen av den nedre bufferkammeret, slik at anoden og katoden er i riktig stilling.
  11. Koble kjøle kjerne, hvis de finnes, til en vannkran ved hjelp av slanger. Fyll kjernen med vann fra springen, som vil fungere som en kjøleribbe under elektroforese, og la vann fra springen sirkulere gjennom kjernen under utvalgterophoresis.

3. nucleocapsid Utglødning-mediert Elektroforese (NAVN) Assay

  1. Utarbeidelse av buffere
    1. Forbered TNMg buffer (1 x: Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, Mg (ClO 4) 2 1 mM, pH 7,5) i DEPC-behandlet vann og filtrerer oppløsningen med et 0,22 um porestørrelse filter.
      MERK: TNMg buffer kan bli lagret ved 4 ° C opp til 7 dager. For beste folding og annealing resultat anbefaler vi bruk av nystekte buffere.
    2. Klargjør Gel ladningsbuffer inneholdende SDS (SDS GLB: Tris-HCl-100 mM, 4 mM EDTA, 50% w / v glycerol, 2% vekt / volum SDS, 0,05% w / v bromfenolblått) i DEPC-behandlet vann.
      MERK: GLB bidrar til å spore hvor langt Oligonukleotidene prøvene kjører inn i gelen systemet og gjør det mulig å synke prøvene inn i gelen. Tilsetting av SDS til GLB er et kritisk punkt for optimal suksess for NAME analysen. Hvis dette ikke følges, er det ikke mulig å skille nukleinsyrer band i gel system (figur 2).
  2. Styrer forberedelse
    1. Fortynne serielt Oligonukleotidene stamløsninger og bruke ferske 10 mikrometer løsninger for å forberede 10 mL av en 1fiM løsning av TAR. Forbered på samme måte, hver for seg, 10 ul av en 1 pM cTAR i TNMg 1x buffer. Varm hvert rør til 95 ° C i 5 min og deretter la avkjøles til romtemperatur for at TAR og cTAR til å overta deres stilk-bule-loop-strukturene.
    2. Forbered 1fiM løsning av hybrid TAR / cTAR som kontroll. Bland 1 pl 10 pM TAR med 1 pl av 10 pM cTAR i TNMg 1x, i et totalt volum på 10 pl. Denaturere oligonukleotider ved oppvarming av røret til 95 ° C i 5 minutter, og la det langsomt avkjøles til romtemperatur for at TAR å binde til dens komplementære sekvens cTAR og for å danne dobbelt-trådede hybrid TAR / cTAR.
    3. Ved de løsninger som er avkjølt til romtemperatur, utføre en kort sentrifugesentrifugering. Tilsett 3 mL av GLB SDS, pipette each løsning inne i røret 3 ganger og sette røret på is. Hold kontrollprøvene stødig på is inntil laste trinn.
  3. Prøver forberedelse til å analysere NC protein og (12-55) NC peptid aktivitet
    1. Bruke 2,5 mL av nystekte 4 mikrometer oligonukleotid løsning for hver prøve. Alltid forberede en liten overskytende mengde av hver løsning for å hindre pipettering feil. Brett 32,5 mL av 4 mikrometer løsning av TAR og separat, av cTAR i TNMg 1x buffer som rapportert for kontrollene forberedelse ovennevnte (trinn 3.2.1.).
    2. Fortynne stamløsning av både protein og NC (12-55) NC peptid til 80 uM løsning med MilliQ vann.
    3. Når TAR og cTAR løsninger er avkjølt til romtemperatur, utføre en kort sentrifugesentrifugering av begge rørene og begynne fremstillingen av prøvene rør.
    4. Forbered 12 tomme 0,5 ml autoklaveres rør. Plasser tre rader med fire rør i rack for lab prøver. Hver rad indikerer henholdsvis prøvene for å analysere the full-lengde NC protein, til prøvene uten protein og prøvene analysere (12-55) NC peptid aktivitet.
    5. Erstatte alltid tips når en annen reagens brukes.
    6. Legg i hvert rør 2,5 mL av brettet TAR og 2,5 mL av brettet cTAR. Tilsett 4 ul DEPC-behandlet vann til prøvene for analyse av NC og på (12-55) NC. Tilsett 5 ul DEPC-behandlet vann til de andre prøvene.
    7. Tilsett 1 pl av 80 pM NC eller 1 pl av 80 pM (12-55) NC til prøvene for henholdsvis NC eller (12-55) NC-analyse.
    8. Legg straks 3 mL av GLB SDS til tid 0 min prøver (rapportert som 0 "i figur 1), pipettering løsningen inne hver tube tre ganger, og til slutt sette røret på is. Gjenta dette trinnet for alle prøver og kontroller. Hold prøvene stødig på is inntil laste trinn.
    9. Etter 15 min, 30 min og 1 time med inkubering ved RT, tilsett 3 mL av GLB SDS, pipettere løsningen inne i each tube tre ganger og sette røret på is. Gjenta dette trinnet for alle prøver og kontroller, henholdsvis, og holde på is inntil laste trinn.
    10. Fjerne lokket av gelen apparat. Lasten 13 ul av hver prøve i brønner som er dannet som tidligere beskrevet ved støping av gelen med en godt dannende kam. Laste prøvene følgende rekkefølgen rapportert i figur 1.
    11. Sett på lokket av gelen apparat. Fest ledningene til gelapparatur til strømforsyningen. Kontroller at elektrodene er koblet til de riktige sporene i kraftforsyningen.
    12. Slå på strømmen og kjøre gelen i 2 timer og 30 minutter ved en konstant spenning på 200 V, inntil fargestoffet har migrert til 1,5 cm over bunnen av gelen.
  4. Prøveopparbeidelse for å analysere antraquinon aktivitet på NC og (12-55) NC
    1. Fortynn forbindelsen en stamløsning. Forbered 10 mL av 500 mikrometer, 250 mikrometer, 50 mikrometer, fem mikrometer fortynning av sammensatte <strong> 1 i MilliQ vann.
    2. Forbered kontrollprøver som rapportert ovenfor (avsnitt 3.2.).
    3. Bruke 2,5 mL av nystekte 4 mikrometer oligonukleotid løsning for hver prøve. Alltid forberede en liten overskytende mengde av hver løsning for å hindre pipettering feil. Brett 27,5 mL av 4 mikrometer løsning av TAR og separat, av cTAR i TNMg 1x buffer som nevnt ovenfor (trinn 3.2.1.).
    4. Fortynne stamløsning av både protein og NC (12-55) NC peptid til 80 uM oppløsning i vann.
    5. Når TAR og cTAR løsninger er avkjølt til romtemperatur, utføre en kort-spin sentrifugering av både rør og starte utarbeidelse av prøvene.
    6. Forbered 20 tomme 0,5 ml autoklaveres rør. Plasser to rader med 10 rør hver i rack for lab prøver.
    7. Erstatte alltid tips når en annen reagens brukes.
    8. Legg hver tube av den første raden med 2,5 mL av brettet TAR. Legg hver tube av den andre raden med 2,5 mL av brettet cTAR.
      9. En fortynning (økende konsentrasjon fra de fem mikrometer til 500 mikrometer fortynning) til TAR og til cTAR. Erstatte forbindelse med vann i prøvene for analyse av NC og (12-55) NC i fravær av forbindelsen. Inkuber prøvene i 15 min ved RT.
    9. Etter 15 min inkubasjon, blande cTAR prøver (rør av andre rad) med korrespondent TAR prøver (rør av første rad).
    10. Tilsett 1 pl av 80 pM NC eller 1 pl av 80 pM (12-55) NC til prøvene for NC eller (12-55) NC-analyse, respektivt.
    11. Etter 15 min inkubasjon, tilsett 3 mL av GLB SDS, pipetter hvert rør tre ganger og sette røret på is. Gjenta dette trinnet, respektivt, ved hjelp av prøver for NC og (12-55) NC-analyse. Hold prøvene stødig på is inntil laste trinn.
    12. Fjerne lokket av gelen apparat. Last 13 ul av hver prøve inn i brønnene. Laste prøvene følgende rekkefølgen rapportert i figurure 3B.
    13. Sett på lokket av gelen apparat. Fest ledningene til gelapparatur til strømforsyningen. Kontroller at elektrodene er koblet til de riktige sporene i kraftforsyningen.
    14. Slå på strømmen og kjøre gelen i 2 timer og 30 minutter ved en konstant spenning på 200 V, inntil fargestoffet har migrert til 1,5 cm over bunnen av gelen.
  5. Prøveopparbeidelse: Oligo-preinkubasjon modus vs NC-preinkubasjon modus
    1. Fortynne det sammensatte En stamløsning. Forbered 10 ul av 500 uM, 250 uM, 50 uM, uM 5 fortynning av forbindelse 1 i MilliQ vann.
    2. Forbered kontrollprøver som rapportert ovenfor (avsnitt 3.2.).
    3. Bruk 2,5 ul av 4 pM oligonukleotid løsning for hver prøve. Alltid forberede en liten overskytende mengde av hver løsning for å hindre pipettering feil. Brett 27,5 mL av 4 mikrometer løsning av TAR og separat, av cTAR i TNMg 1x buffer som ovenfor nevnt (trinn 3.20,1.).
    4. Fortynne stamløsning av både protein og NC (12-55) NC peptid til 80 uM oppløsning i vann.
    5. Når TAR og cTAR løsninger er avkjølt til romtemperatur, utføre en kort-spin sentrifugering av både rør og starte utarbeidelse av prøvene.
    6. Erstatte alltid tips hver gang reagenser er endret eller hvis noen annen væske eller løsning som finnes i reaksjonsrøret er berørt.
    7. Fra dette trinnet på sørg for å tydelig merke og skille prøvene for de to forskjellige preinkubasjon prosedyrer.
      1. Oligo-preinkubering modus
        1. Forbered 10 tomme 0,5 ml autoklaveres rør. Plasser to rader med fem rør i rack for lab prøver.
        2. Legg i hvert rør av den første raden 2,5 mL av brettet TAR. Legg i hvert rør i den andre raden 2,5 ul av brettet cTAR.
        3. Tilsett 2 ul av den passende forbindelse En fortynning (økende konsentrasjon fra de fem mikrometer til 500 mikrometer fortynning) til TAR og til cTAR.Erstatte forbindelse med vann i prøvene for analyse av NC i fravær av forbindelsen. Inkuber prøvene i 15 min ved RT.
        4. Etter 15 min inkubasjon, ta cTAR prøver (andre rad) og legg dem med de korrespondent TAR prøver (første rad).
        5. Tilsett 1 pl av 80 pM NC til hver prøve og prøvene inkuberes i 15 min ved RT.
        6. Etter 15 min inkubasjon, tilsett 3 mL av GLB SDS, pipetter hvert rør tre ganger og sette røret på is. Hold prøvene stødig på is inntil laste trinn.
      2. NC-preinkubering modus
        1. Forbered 5 tomme 0,5 ml autoklaveres rør og plassere dem i rack for lab prøver.
        2. Legg på hvert rør 4 pl av den passende forbindelse 1 fortynning (økende konsentrasjon fra 5 uM til 500 uM fortynning). Erstatte forbindelse med vann i prøvene for analyse av NC i fravær av forbindelsen.
        3. Legg i hvert rør 1 mL av 80 μ; M NC og prøvene inkuberes i 15 min ved RT.
        4. Bland 15 ul foldet TAR med 15 ul foldet cTAR i et rør, og bruke denne TAR + cTAR løsning i neste trinn.
        5. Etter 15 min inkubering, legge til hver prøve 5 pl av TAR + cTAR blanding oppløsning og prøvene inkuberes i 15 min ved RT.
        6. Etter 15 min inkubasjon, tilsett 3 mL av GLB SDS, pipetter hvert rør tre ganger og sette røret på is. Hold prøvene stødig på is inntil laste trinn.
          MERK: Fra trinn 3.5.8 på, kan analyse utføres med alle prøvene (gjenoppta fra 3.5.7).
    8. Fjerne lokket av gelen apparat. Last 13 ul av hver prøve inn i brønnene. Laste prøvene følgende rekkefølgen rapportert i figur 4.
    9. Sett på lokket av gelen apparat. Fest ledningene til gelapparatur til strømforsyningen. Kontroller at elektrodene er koblet til de riktige sporene i kraft supply.
    10. Slå på strømmen og kjøre gelen i 2 timer og 30 minutter ved en konstant spenning på 200 V, inntil fargestoffet har migrert til 1,5 cm over bunnen av gelen.

4. Fjerne Gel og Gel Farging

  1. Etter elektroforese, slå av strømforsyningen, og koble de elektriske ledningene. Slå av vannkranen på kjølesystemet og koble slanger fra kjernen.
  2. Fjerne lokket, og hvis systemet ble avkjølt, fjerner kjøle kjernen og helle av buffer fra begge kamre.
  3. Forsiktig demontere gel-sandwich fra apparatet og fjerne alle klemmene fra glassplatene. For å fjerne gelen fra platene ved å skyve en av avstandsholderne ut til siden av platene, og vri den forsiktig for å trekke opp og bort den øvre glassplate. Ta tak to hjørner av gel og løft det av forsiktig for å fjerne den fra glasset.
  4. Plassere gelen i en egnet beholder med den ønskede nukleinsyrer fargeløsning for30 til 45 minutter under omrøring.
  5. Etter farging, sette gelen på en transilluminator imaging system for å oppdage nukleinsyrer fluorescenssignal i gel system.

Representative Results

Figur 1 viser et representativt resultat av nukleokapsidet Utglødning Mediated Elektroforese (NAME) analyse utført i) med full-lengde rekombinant protein, ii) uten protein, dvs. blande cTAR + TAR og inkubering opp til 1 time ved romtemperatur, og iii ) den samme analysen utføres med (12-55) NC, et syntetisk peptid som mangler de 11 aminosyrer av N-terminale domenet. Den pre-brettet TAR og cTAR var blandet og dannelsen av herdet heterodupleks TAR / cTAR ble overvåket i nærvær av full-lengde rekombinant NC (venstre baner av figur 1), i fravær av protein (sentrale kjørefelt i figur 1 ), og i nærvær av det avkortede (12-55) NC peptid (rette baner i figur 1). Kontrollene er: foldet cTAR, brettet TAR, og glødet hybrid (TAR / cTAR), innhentet gjennom termisk denaturering av stabilt foldede strukturer av TAR til cTAR fulgt av deres sakte annealing. 14

Evnen til NC å denaturere to stabile nukleinsyresekvenser inn i den utvidede heterodupleks heliks er tydelig: full-lengde protein NC umiddelbart fører til dannelsen av TAR / cTAR hybrid: 0 'angir den minimale tid som går mellom tilsetning av NC til prøvene og tilsetning av gel lastebuffer, som stopper reaksjonen; komplett formasjonen er allerede oppnådd etter 15 'inkubasjonstid. Den økning i intensiteten av det glødede heterodupleks paralleller reduksjon i intensiteten av de brettede cTAR og TAR-oligonukleotider. Den heterodupleks dannelse oppnås også i nærvær av den avkortede form, det vil si den (12-55) NC, noe som bekrefter den biologiske aktivitet av det syntetiske peptid. I fravær av proteinet eller peptidet til heterodupleks formasjonen er ikke observert, og tjære og cTAR oligonukleotider vil ikke varmebehandlet ved romtemperatur inn i heterodupleks (figur 1). Ialle forsøkene, rask dannelse av ustabile mellom ("intermediate komplekser" i figur 1) som reduserer over tid er observert, konsekvent med mekanismen foreslått av strand utveksling gjennom hårnåler av cTAR og TAR till de riktige nukleinsyrer folding. 17

En eventuell feilsøking av forsøket er mangelen på SDS i gelen ladningsbuffer. I fravær av SDS i GLB resultatet av reaksjonen er vist i figur 2, og sammenlignet med resultatet med GLB + SDS. Den forhåndsbrettet TAR og cTAR ble blandet og inkubert i 3 timer ved RT over i 3 timer ved 37 ° C med rekombinant full-lengde NC protein. Etter inkubering ble prøvene delt i to: en halvdel gel lastebuffer uten SDS (GLB) ble tilsatt, mens den andre halvparten GLB var med SDS (GLB SDS). Prøvene ble applisert på gelen og posisjonen av nukleinsyrer bånd ble visualisert etter at gelen drives avfargestoff flekker. Når NC var tilstede, men prøvene ble lastet med GLB ble alle nukleinsyrer bånd forskjøvet oppover: dette er forventet, og indikerer en sterk binding mellom protein og nukleinsyrer. Resultatene med GLB SDS er vist i den ytterste høyre side av gelen: tilsetning av SDS denaturerer proteinet og frigjør nukleinsyrene fra den stabilt kompleks med proteiner, slik at det sammenlignet med kontrollene.

Den NAME assay brukes for å vurdere evnen til å tre interkalatorer å stabilisere dynamiske nukleinsyre strukturer og hemme NC anstand aktivitet. 14 Threading- interkalatorer er plane aromatiske molekyler substituert med store sidekjeder er plassert på de motstående områder av ringsystemet, som for eksempel antrakinon vist i figur 3A. 18 Disse interkalatorer er i stand til å træ gjennom dobbeltspiralen av nukleinsyrer, til slutt å finne sine sidekjeder i hvert spor i den doblehelix. 19,20

Figur 3B viser resultatet av NAME assay i nærvær av en forbindelse, et kjent gjenging intercalator, 18 i nærvær av full-lengde NC eller til den avkortede peptid. I begge tilfeller er dannelsen av TAR / cTAR hybrid av NC reduseres ved å øke konsentrasjonen av intercalator, mens, på samme tid, mengden av fri TAR og cTAR øker. Den avkortede form av proteinet som mangler den N-terminale halen (12-55NC) er mer følsomme for hemming av aktiviteten: denne forskjell ble verifisert med alle de testede forbindelser så langt.

Den NAME analysen kan utføres på to måter, enten ved pre-inkubering av testforbindelsen med NC, etterfulgt av tilsetning av de brettede oligonukleotider (NC-preinkubering modus), eller ved å preincubating testforbindelsen i 15 minutter med de brettede nukleinsyresubstrater , etterfulgt av tilsetning av NC og en ytterligere inkubasjon i 15 minutter (oligo-Preincubation modus). Selv om den samlede inkubasjonstid er den samme i de to forskjellige modi, lar preinkubering med de brettede oligonukleotider før tilsetning av NC mer tid for gjenging av interkalatorer til den brettede nukleinsyre. Dette resulterer i en sterkere stabilisering av deres dynamiske strukturer og inn i en enklere inhibering av NC anstand aktiviteter. Analysen av NAME analyse i de to modusene forbedrer derfor forskjeller i virkningsmekanismen til NC-inhibitorer, slik som vist i figur 4: når forbindelsen 1 ble analysert ved NAME i oligo-preinkubering modus (figur 4, baner på venstre) den viser sterk inhibering av NC-mediert gløding, mens mye lavere hemming er observert i NC-preinkubering modus (figur 4, baner til høyre). Vær oppmerksom på at for bestemmelse av hemmende konsentrasjoner mens screening sett med relaterte forbindelser med denne analysen, og i disse forholdene, hver experiling må utføres minst tre ganger ved hjelp av tett adskilte konsentrasjoner (spesielt rundt IC50-verdi). 14

Figur 1
Figur 1:. NAVN analysen med full-lengde NC og med avkuttet (12-55) NC Folded TAR og cTAR, hver 1fiM, ble inkubert med rekombinant NC eller med (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) for 0 min, 15 min, 30 min og 1 time. TAR og cTAR inkubert i fravær av protein (0 min, 15 min, 30 min og 1 time) ble anvendt som negativ kontroll. TAR foldet, brettet cTAR og hybrid TAR / cTAR oppnådd etter termisk denaturering, etterfulgt av in vitro gløding ble anvendt som kontroller. Reaksjonene ble deretter sluttet å bruke GLB SDS. Prøvene ble løst i en 12% polyakrylamid gel i TBE 1 x; etter elektroforese nukleinsyrer på gelen ble farget og oppdaget på en transilluminator.

Figur 2
Figur 2:. Effekt av SDS i gel lasting buffer (GLB) når analysere TAR / cTAR annealing av NC TAR og cTAR, ut doble i TNMg 1x, ble inkubert med full lengde rekombinante NC (oligos / NC = 1/8) for tre time ved værelsestemperatur eller ved 37 ° C. GLB eller GLB SDS ble deretter tilsatt til prøvene inkubert med NC. Kontroller: TAR, cTAR og herdet hybrid TAR / cTAR (hver 1fiM). Elektroforese ble utført ved anvendelse av en 12% polyakrylamid gel i TBE 1x; etter elektroforese nukleinsyrer på gelen ble farget og oppdaget på en transilluminator. Dette tallet har blitt forandret fra Figur S4 av:. Sosic, A. et al Design, syntese og biologisk evaluering av TAR og cTAR bindemidler som HIV-1 nukleo hemmere MedChemComm 4, 1388-1393, doi:. 10,1039 / c3md00212h (2013) .

"> Figur 3
Figur 3: (A) Kjemisk struktur av gjenge intercalator 1. (B) Virkning av træ intercalator en vurdert ved NAME assay. Brettede TAR og cTAR, hver 1 uM, ble inkubert i nærvær av de angitte konsentrasjoner av forbindelsen med en full-lengde NC, eller med (12-55) NC, hver 8 uM. Foldet TAR, foldet cTAR og utvidet heterodupleks TAR / cTAR ble brukt som kontroller. Reaksjonene ble deretter sluttet å bruke GLB SDS. Prøvene ble løst i en 12% polyakrylamid gel i TBE 1 x; etter elektroforese nukleinsyrer på gelen ble farget og oppdaget på en transilluminator.

Figur 4
Figur 4: Oligo-preinkubering versus NC-preinkubasjon moduser: effekter på NAVN analysen Oligo-preinkubasjon mod.e: TAR foldet og brettet cTAR, hver 1 uM, ble preinkubert med de angitte konsentrasjoner av gjengene intercalator 1 til 15 min, og deretter i ytterligere 15 minutter i nærvær av full-lengde NC (8 pM) NC-preinkubasjon. modus: de angitte konsentrasjoner av gjengene intercalator 1 ble preinkubert med full-lengde NC (8 pM) i 15 min, og deretter i ytterligere 15 minutter i nærvær av TAR foldet og foldet cTAR, hver 1 pM. Foldet TAR, foldet cTAR og utvidet heterodupleks TAR / cTAR ble brukt som kontroller. Alle reaksjonene ble endelig sluttet å bruke GLB SDS. Prøvene ble løst i en 12% polyakrylamid gel i TBE 1 x; etter elektroforese nukleinsyrer på gelen ble farget og oppdaget på en transilluminator.

Discussion

NAME er en metode som gjør det mulig raskt å vurdere inhibisjon av anstand aktivitet av nukleokapsid protein av HIV-1, en interessant mål i leting etter nye anti-HIV-medikamenter. NC hybridiserer raskt og ved romtemperatur nukleinsyrer som har stabil folding ellers ville kreve termiske denaturering ved høy temperatur etterfulgt av forsiktig gløding. Analysen kan utføres med enten full-lengde NC eller med trunkert (12-55) NC: i begge tilfeller de to nukleinsyrer (RNA og dens komplementære DNA-kopi) er glødet hurtig. Dette er i overensstemmelse med litteraturen observasjon med det avkortede NC peptid: annealing initieres ved effektiv smelting av stammen av cTAR fulgt av interaksjon av dens komplementære apikal løkke, som er en svak NC-bindingssete, sammen med den komplementære sekvens av TAR apikal sløyfe, havne gjennom flere ustabile mellomprodukter til den utvidede glødet hybrid. 21

NC er et meget stabilt protein og få problemer mens du utfører NAVN kunne forekomme. Det er veldig viktig, men å legge ferske SDS i Gel Loading Buffer brukt til å stoppe reaksjonen: Hvis dette ikke oppnås, vil geleen ikke vise nukleinsyresekvensene band på de riktige posisjonene. Faktisk, NC er en nukleinsyre-bindende protein, slik at for å visualisere fullstendig TAR / cTAR heterodupleks ved gelelektroforese SDS må være tilstede i gelen ladningsbuffer for å denaturere protein og frigjøre den fra sitt tette anlegg med nukleinsyrene. Dette er også en mulig feilsøking av forsøket, det vil si dannelsen av forskjøvne bånd i gelen løp. Denne effekten er spesielt tydelig når full-lengde NC ble anvendt, som i figur 2, og er knyttet til tilstedeværelsen av den meget basisk N-terminal hale, som har en sterk aggregerende effekt på nukleinsyrer.

Tilstedeværelsen av terminalen grunn halen gjør annealing reaksjonen vanskeligere å bli inhibert, som vistn i figur 3 ved hjelp av sammensatte en, en representant threading intercalator, dvs. en intercalator spesielt effektiv på å stabilisere Scammeløkke-strukturer av TAR og av cTAR. Faktisk er denne type samhandling med nukleinsyrer favorisert når buler og looper avbryte dobbeltspiralen kontinuitet, noe som åpner for en enklere threading av voluminøse substituenter i basepar. Stabilisering av tjære og cTAR av disse nukleinsyre-bindemidler ble tidligere analysert ved bestemmelse av økningen i smeltetemperaturen for de to oligonukleotider. 14 Dessuten korrelerer økningen i smeltetemperatur med inhibering av annealing katalysert av HIV-1 NC, fører til redusert dannelse av heterodupleks TAR / cTAR og indikerer at gjenge interkalatorer er en interessant klasse av bindemidler for dynamiske strukturer av RNA som TAR-elementet. 14

Virkningsmekanismen påberopes for disse compounds kan videre bekreftet ved å utføre NAME analyse i forskjellige alternative formater, slik som vist i figur 4: i tilfellet med interkalatorer inhiberingen av glødet heterodupleks forsterkes når medikamentet blir inkubert med de to brettede oligoer. Forbindelser som virker med annen virkningsmekanisme, for eksempel direkte bindemidler for NC protein, ville være mindre påvirket av de ulike preinkubasjon modus. NAME assay utføres i de to fremgangsmåter kan derfor brukes til å screene bibliotekene av forbindelser for identifisering av NC-inhibitorer, og også for å vurdere den antatte virkningsmekanismen til de positive treff under søking etter anti-HIV-legemidler rettet mot NC. Åpenbart er bruken av disse teknikkene alene ved krav om for en spesifikk virkningsmekanisme av identifiserte NC-inhibitorer ikke er tilstrekkelig, og andre egnede biokjemiske analyser er nødvendig for å opprettholde arbeidshypotese. 14

Til slutt må det understrekes at NAME bruker sværtrensede enzymer, enten rekombinante eller syntetiske, som gir verdifull informasjon om den "in vitro" hemning av NC av de testede forbindelser. Dette er "styrke og svakhet" av analysen: NAVN kan godt utfylle virtuelle screening og molekylær modellering tilnærminger i de innledende skritt for narkotikaforskning programmer, slik at for raskt å bygge og analysere struktur-aktivitetsforhold og til slutt omdirigere syntese og drug design. Men som andre biokjemiske analyser som brukes i narkotika utviklingsprosjekter i HIV, NAME vil ikke gi informasjon om virkningene av mulige hemmere i virusinfiserte celler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. Metabion International AG Store the stock  solution at -20 °C 
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.   Metabion International AG Store the stock aliquot at -80 °C 
(12-55)NC peptide EspiKem srl Store the stock solution at -20 °C
1.5 ml tubes Eppendorf 0030 120 086 Autoclave before use
0.5 ml tubes Eppendorf 0030 121 023 Autoclave before use
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µl Sarstedt 701,130,210
Biosphere Filter Tips 2-20 µl Sarstedt 70,760,213
Biosphere Filter Tips 200 µl Sarstedt 70,760,213
Syringe Filter 0.22 µm Biosigma srl 51,798
Ethanol Carlo Erba 414631
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich 71725-50G
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-1L
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 71376-1KG
Boric Acid Sigma-Aldrich B0252-2.5KG
Ethylenediaminetetraacetic Acid Sigma-Aldrich E5134-500G
Magnesium Perchlorate Sigma-Aldrich 222283-100G Store the 1 M solution at -20 °C
Glycerol Sigma-Aldrich 49770-1L
Bromophenol Blue GE Healthcare Life Sciences 17-1329-01
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-100ML
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A7460-500G Prepare the 10% solution freshly before use
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) Merck Millipore 1006401000 Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting
Tris ultrapure Applichem A1086,1000
DEPC-treated water Ambion AM9922
Centrifuge 5415R Eppendorf 22,621,408
NanoDrop 1000 spectrometer Thermo Scientific
UV-VIS spectrometer Lambda 20 Perkin Elmer
Protean II xi Cell Bio-Rad 165-1803
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
SybrGreen II RNA Gel Staining Lonza 50523 Make the 1/10,000 dilution in TBE 1x. Store it in the dark at 4 °C for two weeks.
Geliance 600 Imaging System Perkin Elmer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Druillennec, S., et al. A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).
  2. Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus. Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).
  3. Thomas, J. A., Gorelick, R. J. Nucleocapsid protein function in early infection processes. Virus Res. 134, 39-63 (2008).
  4. Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function. RNA Biol. 7, 724-734 (2010).
  5. Zeng, Y., et al. Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).
  6. Basu, V. P., et al. Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription. Virus Res. 134, 19-38 (2008).
  7. Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA. J Virol. 71, 5178-5188 (1997).
  8. Godet, J., Mely, Y. Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein. RNA Biol. 7, 687-699 (2010).
  9. Darlix, J. L., et al. Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).
  10. Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1. Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).
  11. Vo, M. -N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).
  12. Beltz, H., et al. Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis. J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).
  13. Mori, M., et al. Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1. Curr Top Microbiol Immunol. , Forthcoming Forthcoming.
  14. Sosic, A., et al. Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors. MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).
  15. Tabarrini, O., et al. Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives. Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).
  16. Hagan, N., Fabris, D. Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element. Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).
  17. Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease. Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).
  18. Zagotto, G., et al. Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates. Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).
  19. Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution. Chem Biol. 10, 663-672 (2003).
  20. Gooch, B. D., Beal, P. A. Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides. J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).
  21. Kanevsky, I., et al. Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).

Tags

Immunologi HIV-1 nucleocapsid protein NCp7 TAR-RNA DNA oligonukleotider avspenning Gel elektroforese NAVN
Nucleocapsid annealing-mediert elektroforese (NAVN) analysen Lar Rapid Identifikasjon av HIV-1 nucleocapsid hemmere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sosic, A., Cappellini, M.,… More

Sosic, A., Cappellini, M., Scalabrin, M., Gatto, B. Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors. J. Vis. Exp. (95), e52474, doi:10.3791/52474 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter