Introduction
黒質のドーパミン作動性ニューロンの損失は、緻密は、パーキンソン病（PD）、第二の最も優勢な神経変性疾患の基本的運動症状につながる様部。この中脳ニューロン集団の終焉の根本的な原因は知られていない。開発を担当し、神経生理学的特性およびmesDAニューロンの生存を調節する生化学的経路を研究するために、いくつかの細胞培養と動物モデル系が使用されている。ラットは、ドーパミン作動性細胞株1RB 3 AN 27（N27）、ヒトドーパミン作動性の神経芽細胞腫細胞株SH-SY5Y、MN9Dおよびヒトの脳細胞をLUHMESマウスドーパミン作動性のハイブリッド細胞株を含む、不死化細胞株は、生化学的および限定された機構研究1のために使用されている-5。 mesDAニューロンの特定の損失の研究のために、いくつかの神経毒をベースと遺伝モデルが6-8を開発されてきた。初代腹側中脳の文化、ドーパミン作動性ニューロンの神経細胞とシナプスのプロパティと、この一般的な疾患の病因に関与する経路を研究するための不可欠なツールを提供する。
ここでは、より高い生存性と胚あたりのカバースリップの増加収量、結果の修正が含まれている中脳ドーパミン作動性ニューロンの分離のための詳細なプロトコルを提示する。前成熟したE12.5マウス中脳（ラットにおいてE14.5）の使用は、生存性を向上させます。この年齢でのニューロンは解剖時に無傷の細胞を残している、まだ軸索を開発し、それによって大幅に生存能力を高め、ストレスを最小限にしていない。また、腹側中脳の注意深い解剖は、このプロトコルのセクション2で説明したように、さらに生存性を高めます。胚あたりのカバースリップの数を増加させるために、代替的なメッキ法は、このプロトコルのセクション4に示されている。これは、下の4カバーガラスと比較して胚当たり最大10カバーガラスの収率をもたらす標準めっき条件は、このように、実験あたりの動物の量を減らす。
軸索とdentritesの文化展示成長におけるニューロンは、シナプス結合を形成し、生細胞イメージング、免疫細胞化学的および電気生理学的研究のために、これらの培養物は適して神経細胞とシナプスマーカーの存在を明らかにする。さらに、ニューロン培養の使用は遺伝的および薬理学的操作を容易にします。 in vitroでの 2日目からの神経突起の伸長が発生研究が可能になります。また、（6週間まで）培養物の長期生存は、これらのニューロンの遅い、進行性変性を研究するのに適したものとなる。
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Protocol
注：動物は維持され、施設のガイドラインに準拠して処理され、すべての動物の手順はインペリアルカレッジの動物保護によって承認されたと倫理審査機関（AWERB）とホームオフィス、ハーバード大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）し、連邦および州の規制に準拠した。
1.試薬と機器のセットアップ
- 解凍し、アリコートし、-80ºCで保存し、1mg / mlのラミニンソリューション。 1~2μgの/ cm 2のコーティング濃度で得られた1mlのDMEM / F12中で2μlの溶解する。
注：氷上で解凍ラミニンゆっくりと冷たいDMEM / F12に溶解し、直ちにプレート/カバーガラスに追加します。 - 4ºCで0.01％の425ミリリットルのPBS中のポリ-L-オルニチン、店舗の75ミリリットルに希釈する。
注：作業溶液の貯蔵寿命は1ヶ月までです。 - がたまでために、4℃で25％（wt / vol）のPBS中のBSA、pH7.4で、店舗を溶解AR。
- （HBSS中）は、50％FBS失活メディアを準備します。
- - （+） - グルコース（重量/体積）、0.25％のBSA（重量/体積）の50 U / mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、1×N2サプリメント、5％（容量/容量）FBS、0.36％のDを追加することによって、完全培地を調製4ºCでのDMEM / F12とストア。
注：貯蔵寿命は10日までです。 - グリースとオートクレーブの痕跡を除去するために少なくとも30分間、70％（体積/体積）エタノール沸騰置きカバーガラス。
- 場所の24ウェルプレート中のカバーガラスと、各ウェルに500μlのポリ-L-オルニチン溶液を加える。 RTでの組織培養フードの下で1時間インキュベートし、その後、500μlの水で3回洗浄する。各プレートに500μlのラミニン溶液を添加し、37ºCの加湿組織培養インキュベーターでO / Nインキュベートする。
注記：洗浄は、24時間培養後、細胞の死をポリ-L-オルニチンで3回以上の結果を洗浄し、ラミニン処理後に必要でないが。 - 天然ガスやトーチF上のガラスピペットの先端を磨くラメ。
注：このステップの後、先端の直径は、通常のサイズの約半分である必要があります。 - オートクレーブはさみとオートクレーブを用いて、1.5ミリリットルマイクロチューブのキャップをカット。
胚腹側中脳の2解剖
- 麻酔をかけるには、CO 2吸入によって（E12.5）ダム妊娠タイムアウトした後、頚椎脱臼により安楽死させる。
- 70％エタノールで腹部をスプレーし、子宮嚢がすべて露出するまで腹部切開を作る。鉗子を使用すると、膣の添付ファイルをカットし、子宮を取り除く。 100ミリメートルペトリ皿に、氷冷HBSS中で子宮を置きます。
- 鉗子（ 図1C）を使用して、子宮と羊膜嚢から胚を削除します。新鮮な氷のように冷たいHBSS中で胚を置きます。
メモ： 図1Dに長方形は胚の腹側中脳の位置を示している。 - 解剖顕微鏡（10倍の倍率）の下で胚を置き、中脳を解剖bioscissorと鉗子を（ 図1Eは 、切開のラインに対して図1Aを参照してください）を使用して、地峡と中脳、間脳境界領域で脳を切断することによりアーチ。
- 全体中脳を取り出した後、背内側中脳（ 図1F）でカットをする。
- 2鉗子（ 図1H）を使用して、髄膜を削除します。
注：重要なステップ：このステップは、最適な神経細胞の収量と生存に不可欠である。培養条件は、脳細胞のために最適であるため、周囲の組織からの細胞のほとんどは、めっき後に死亡し、この組織からのアポトーシスシグナルは培養物の完全性に損傷を与えることができる。 - 滅菌シェービングブレード（ 図1H、I）を使用して、蝶形状を観察し、各翼の約半分を切断するためにペトリ皿に脳組織を平らにする。
メモ： 図1Jは、孤立した腹側中脳を示している。 - 転送15ミリリットルコニカルチューブ中の氷冷HBSSに腹側中脳の部分と次の胚を進める。
注：手順2.1から2.8には1時間以上を服用してはいけません。氷上でこの時間枠を越えて胚を維持することが有意に細胞生存率を減少させる。
腹側中脳細胞の3解離
- 層流フードの下で腹側中脳の部分を転送します。 HBSSを削除し、（腹側中脳の最大12個のために十分なボリューム）をコニカルチューブに予め温め1ミリリットル（37℃）0.05％トリプシン-EDTAを追加します。 5〜10分間37ºCでの組織をインキュベートする。
- ボンネットの下にトリプシン-EDTAを削除し、組織に1ミリリットルの脱活性化培地を（血清はトリプシンを非アクティブにします）を追加します。
- 非アクティブ化媒体を除去し、二回完全培地1ミリリットル中の組織を洗う。
NOTE：解離細胞を廃棄防ぐため、チューブから全培地を除去し、組織をピペット避ける。 - 1ミリリットル完全培地とトリットを追加ファイアーポリッシュガラスピペットで組織を尿酸。気泡の形成を回避し、単一細胞懸濁液が得られるまで粉砕する続ける。
注：通常、8-10が完全に解離のために必要とされる制限された先端を通過する。 - 室温で5分間400×gで細胞を遠心し、培地を除去。
- 再懸濁ゆっくりピによって完全培地1ミリリットル中にペレットを上下に4倍のために。
4.メッキ腹側中脳細胞
- 90μlのトリパンブルー溶液を用いて細胞懸濁液10μlを混合し、血球計数器を用いて細胞の数を数える。
注：細胞の生存率も、この段階で確認することができる。 - 100ミリメートルペトリ皿で滅菌マイクロ遠心チューブのキャップを置き、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングしたカバースリップを転送し、鉗子、キャップの上に一度に1を使用した。
注：カバースリップを洗浄しないでください、これはuneve原因となることがありますので、ラミニンを乾燥避けるn個の文化や細胞の生存性の減少。 - （ボリュームが流出せずにカバースリップの表面を覆うように最適である）完全培地を追加することによって、1μLあたり1500細胞に音量を調整し、各カバースリップの上に100μlの細胞懸濁液（150,000細胞の合計）を追加します。ペトリ皿を閉じて、加湿した組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で1時間、それらをインキュベートする。
NOTE：CRITICAL STEP：この手順は、細胞の付着および生存率を高めるために、胚あたりのカバースリップの数を増加させるために必要とされる。あるいは、細胞を（カバーガラスを含む）をウェルに直接転送することができるが、細胞の数は、（代わりに15万）ウェルあたり350,000増加させるべきである。直接転送が原因プレート（横またはカバースリップの下）に付着する細胞の約3-4カバースリップを生じながら、言い換えれば、この方法を使用して、8-10カバースリップを、取得することができる。平均viabiliこの方法を使用して培養物のtyが、約90％であった。
5.文化成長および維持
- インキュベーションの1時間後に、慎重に400μlの予め温めた（37ºCに）完全培地を含む24ウェルプレートに培地を含むカバースリップを転送する（総容量：500μl）を。 37ºCで細胞のO / Nをインキュベートする。
- 井戸のインキュベーション後24時間以内に、静かに各ウェルに500μlの完全培地を追加します。
注：最初の数時間は、ドーパミン作動性ニューロンの生存のための最も重要な段階で、生存細胞の数は、この点を越えて大きく変化しない。 - 最初の2週間、または培地が黄色になるまで培養液に追加のメディアを追加しないでください。以上の2週間または新鮮な完全予め温めメディア（通常は隔週）と黄色、メディアの交換の半分（500μL）中〜色の変化のために培養した場合。
注：内のドーパミン作動性ニューロン培養物は、これらの条件下で6週間以上生存するであろう。
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Representative Results
チロシンヒドロキシラーゼ（TH）に対する免疫組織化学は、培養中の細胞の0.5〜1％の間でドーパミン作動性であることを示しています。チロシンヒドロキシラーゼ（TH）と微小管関連タンパク質2（MAP2）抗体（ 図3）を使用して、神経突起は、めっき後2時間以内に表示され、初日によって、軸索と樹状突起が区別できる（ 図2）である。ニューロンは、以上の6週間生き残るためには、大規模な成長を示している。先に示したように培養物中のニューロン - グリア比率は、培地中の血清の濃度に直接関連している。比較的純粋なニューロン培養物を得ることができる培養物からFBSを排除しながら、我々は、他の血清の添加は、培養9にドーパミン作動性ニューロンの生存を増加させることを見出した。
を単離するための図1の手順胚の腹側中脳。腹側中脳の解剖のためにE12.5マウスの脳、中脳境界（点線）、および関心領域のおおよその位置、腹側中脳、赤い四角形（A）内およびツールの概略図、bioscissor、foreceps、およびブレードホルダー（B）が示されている。胚は、（C）の破裂によって羊膜嚢から取り出される。興味、腹側中脳の領域は、矩形（D）で示されている。脳は、（切断片の左側）峡部と（; E右）中脳、脳の境界で切断することにより単離する。中脳の背内側部分は、蝶形（G、H）に似ているように、（F）に切断され、平坦化される。そして、髄膜、脳（H）から分離され、腹側中脳（矩形）シェービングブレードを用いて、羽の半分を切断することにより、背側部分から分離されている
図腹側中脳の文化の2.代表明の画像。画像はDIV1（左）に撮影された、DIV2（中央）、DIV15（右）。スケールバー：50μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.長期生存、2週間のO内のプロセスの成長およびシナプス形成LD腹側中脳の文化。中脳ドーパミン作動性ニューロン、チロシン水酸化酵素抗体によって識別さは二週間E12.5胚から解離した後に腹側中脳培養物では、Map2の抗体によって識別され大規模な軸索 と樹状突起を、成長する。樹状突起は、Thの陽性線維は軸索を表すThおよびMap2に陽性プロセスの重複によって区別することができる。 200：抗体は、1の希釈で使用した。スケールバー：20μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
中脳ドーパミン作動性ニューロンは、中枢神経系におけるドーパミンの主な供給源である。これら3つのグループに分割され、黒質緻密部（SNpc）、腹側被蓋野（VTA）及びretrorubralフィールド（RRF）10、11。 SNpcとVTAのニューロンは、そのような感情、動機と運動行動の制御などの機能に関与する主要なドーパミン作動性経路に上昇、中間皮質、中脳辺縁系と黒質線条体を与える。 SNpcと黒質線条体系の機能的破壊のニューロンの終焉は、第二の最も顕著な神経変性疾患、パーキンソン病（PD）12,13の主な病理学的特徴である。現在の治療アプローチは疾患の症状に対処し、停止または変性を遅くし、遅い、進行性の細胞の喪失の原因はまだ14-16不明ではありません。したがって、in vivoおよび developmeの研究のためのインビトロ技術の開発このニューロン集団の、NTAL生化学、および生理学的特性PDの病因を理解するために、新たな治療アプローチの開発に不可欠である。
ここでは、そのような分化、軸索のようなプロセスの研究を可能にする、解剖、解離し、この地域からのドーパミン作動性ニューロンのインビトロでの生存に長期的になり、胚マウスおよびラット腹側中脳からの一次ニューロンの培養のための最適化された方法を説明伸長およびシナプス形成。このプロトコルのいくつかの利点は、ニューロン4の発達を最大に増加した胚あたりのカバースリップの数は、増殖因子からの独立性とin vitroでの生存の長さを含む。このメソッドは、このニューロンの進行性変性と同様に、中脳ドーパミン作動性ニューロンの正常な生理機能のメカニズムを理解するための許可でのインビボ研究を補完することがパーキンソン病の細胞毒性および遺伝モデルにおけるら集団。
このプロトコルの主な欠点の1つは、SNpcおよびVTAドーパミン作動性ニューロンの間の区別の欠如である。この問題は、培養（E12.5マウスまたはラットE14.5における）ニューロンの終末分化の際に存在し、それらの地域化は完全ではなく、古い胚の使用が可能であるが、それはかなりの生存を減少させる軸索切断に起因するニューロン。つの集団を区別することは、GIRK2（SNpcニューロンを同定するため）およびカルビンジン（VTAニューロンを識別する）17と、各集団に特異的なマーカーに対する抗体を用いて、免疫細胞化学によって可能である。
セクション4で説明した最適化されためっきは50％以上の実験あたりの胚の量を減少させ、したがって、研究における動物の使用を減らすことに寄与する。カルトの生存のための最も重要なステップだけでなく、髄膜（ステップ2.6、 図1H）を完全に除去する- URESはダムの安楽死および胚中脳（2.8ステップ2.1）の完全な解剖間の時間である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
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