Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Published: February 19, 2015 doi: 10.3791/52475

Introduction

فقدان الخلايا العصبية الدوبامين من المادة السوداء بارس المكتنزة يؤدي إلى أعراض الكاردينال السيارات من مرض باركنسون (PD)، والثاني اضطراب الاعصاب الأكثر انتشارا. السبب الكامن وراء زوال هذه الفئة من السكان الخلايا العصبية الدماغي المتوسط ​​غير معروف. لدراسة المسارات البيوكيميائية المسؤولة عن تطوير وتحوير الخصائص الفسيولوجية العصبية وبقاء الخلايا العصبية mesDA، عدة زراعة الخلايا والنظم نموذج حيواني استخدمت. خطوط الخلايا خلده، بما في ذلك الدوبامين الفئران خط الخلية 1RB 3 AN 27 (N27)، والدوبامين البشري خط الخلية العصبية SH-SY5Y، الماوس الدوبامين خط الخلية المختلطة MN9D والدماغ المتوسط ​​البشري LUHMES خلايا استخدمت لدراسات الآلية البيوكيميائية ومحدودة 1 -5. لدراسة فقدان محددة من الخلايا العصبية mesDA، والعديد عصبي القائم وتم تطوير نماذج وراثية 6-8. ثقافات الدماغ المتوسط ​​البطنية الأولية، وتوفير أداة لا غنى عنها لدراسة خصائص الخلايا العصبية ومتشابك من الخلايا العصبية الدوبامين ومسارات المتورطين في التسبب في هذا الاضطراب شائع.

هنا نقدم بروتوكول مفصلة لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط، والذي يحتوي على تعديلات مما أدى إلى ارتفاع البقاء على قيد الحياة وزيادة العائد من coverslips في الجنين. استخدام ما قبل ناضجة الدماغ المتوسط ​​E12.5 الماوس (E14.5 في الفئران) يعزز البقاء على قيد الحياة. والخلايا العصبية في هذه السن لم تتطور محاور عصبية بعد، الأمر الذي يترك خلايا سليمة أثناء تشريح ويقلل من الإجهاد وبالتالي زيادة كبيرة في قدرتها على البقاء. وبالإضافة إلى ذلك، تشريح دقيق من المخ الأوسط بطني، كما هو موضح في المادة 2 من هذا البروتوكول، وكذلك تعزز البقاء على قيد الحياة. لزيادة أعداد coverslips في الجنين، ويقدم طريقة الطلاء بديل في المادة 4 من هذا البروتوكول. وهذا يؤدي إلى إنتاجية تصل إلى 10 coverslips في الجنين بالمقارنة مع 4 coverslips تحتوبالتالي الظروف الطلاء القياسية تقليل كمية من الحيوانات في التجربة.

الخلايا العصبية في الثقافة المعرض ثمرة من المحاور وdentrites، تشكيل اتصالات متشابك وتكشف عن وجود علامات العصبية ومتشابك مما يجعل هذه الثقافات مناسبة لتصوير الخلايا الحية، immunocytochemical والدراسات الكهربية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الثقافات العصبية يسهل التلاعب الجيني والصيدلانية. ثمرة neurites التي من يوم 2 في المختبر تتيح للدراسات التنموية. وعلاوة على ذلك، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل الثقافات (تصل إلى ستة أسابيع) يجعلها مناسبة لدراسة بطيئة، وانحطاط التدريجي لهذه الخلايا العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم الحفاظ على الحيوانات والتعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وجميع الإجراءات الحيوانية وافق عليها رعاية الحيوان في جامعة Imperial College والجسم المراجعة الأخلاقية (AWERB) وزارة الداخلية وجامعة هارفارد المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)، في الامتثال للوائح الفيدرالية وحكومات الولايات.

1. الكاشف وإعداد المعدات

  1. ذوبان الجليد، قسامة وتخزين 1 ملغ / مل Laminin الحل في -80 درجة مئوية. حل 2 ميكرولتر في 1 مل DMEM / F12، مما أدى إلى تركيز طلاء من 1-2 ميكروغرام / سم 2.
    ملاحظة: ذوبان الجليد Laminin ببطء على الجليد وتذوب في البارد DMEM / F12 وعلى الفور إضافة إلى لوحات / coverslips.
  2. تمييع 75 مل من 0.01٪ بولي-L-الأورنيثين في 425 مل PBS وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: العمر الافتراضي للحل العاملة تصل إلى شهر واحد.
  3. حل 25٪ (وزن / المجلد) BSA في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4، وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل الى أنتمع.
  4. تجهيز 50٪ FBS (في HBSS) وسائل الاعلام التعطيل.
  5. إعداد المتوسطة كاملة من خلال إضافة 50 U / البنسلين مل والستربتومايسين، 1X N2 ملحق، 5٪ (المجلد / المجلد) FBS، 0.36٪ D - (+) - الجلوكوز (وزن / المجلد)، 0.25٪ BSA (وزن / المجلد) ل DMEM / F12 وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: العمر الافتراضي هو ما يصل الى 10 يوما.
  6. مكان coverslips في 70٪ (المجلد / المجلد) الايثانول المغلي لمدة 30 دقيقة على الأقل لإزالة أي آثار للالشحوم والأوتوكلاف.
  7. مكان coverslips في 24 لوحات جيدا وإضافة 500 ميكرولتر حل بولي-L-الأورنيثين إلى كل بئر. احتضان 1 ساعة تحت غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة في RT ومن ثم، وغسل 3 مرات مع 500 ميكرولتر المياه. إضافة 500 ميكرولتر حل laminin إلى كل لوحة واحتضان O / N في ترطيب حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: في حين لا يغسل ضرورية بعد العلاج laminin، وغسل بولي-L-الأورنيثين أقل من ثلاث مرات النتائج في موت الخلايا بعد 24 ساعة زراعة.
  8. تلميع نصائح من الماصات الزجاجية على الغاز الطبيعي أو الشعلة وعرجاء.
    ملاحظة: بعد هذه الخطوة القطر من طرف يجب أن يكون حوالي نصف حجمه الطبيعي.
  9. قطع قبعات من 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، وذلك باستخدام مقص تعقيمها وتعقيم.

2. تشريح المخ الأوسط بطني الجنينية

  1. خدر توقيت الحوامل (E12.5) السدود التي كتبها CO 2 الاستنشاق ومن ثم الموت ببطء خلع عنق الرحم.
  2. رش البطن مع الايثانول 70٪ وإجراء شق في البطن حتى تتعرض الحويصلات الرحم جميع. باستخدام ملقط قطع المرفق المهبل وإزالة الرحم. وضع الرحم في الجليد الباردة HBSS، في 100 مم طبق بتري.
  3. إزالة الأجنة من الرحم والكيس الذي يحيط بالجنين، وذلك باستخدام ملقط (الشكل 1C). مكان الأجنة في HBSS الجليد الباردة العذبة.
    ملاحظة: المستطيل في الشكل 1D يشير موقع المخ الأوسط بطني الجنينية.
  4. وضع الأجنة تحت المجهر تشريح (التكبير 10x) وتشريح الدماغ المتوسطالقوس عن طريق قطع الدماغ في البرزخ والمنطقة الحدودية الدماغ المتوسط-دماغية بينية، وذلك باستخدام bioscissor وملقط (الشكل 1E، يرجى الرجوع إلى الشكل 1A لخطوط شق).
  5. بعد اخراج المخ الأوسط بأكمله، اجراء خفض في المخ الأوسط ظهراني ناصفي (الشكل 1F).
  6. إزالة السحايا، وذلك باستخدام اثنين من ملقط (الشكل 1H).
    ملاحظة: خطوة حاسمة: هذه الخطوة ضرورية لالعائد الخلايا العصبية الأمثل والبقاء على قيد الحياة. منذ الشروط ثقافة هي الأمثل لخلايا الدماغ، فإن معظم الخلايا من الأنسجة المحيطة يموت بعد الطلاء وإشارة أفكارك من هذا النسيج قد يضر سلامة الثقافات.
  7. لشد الأنسجة المخ الأوسط على طبق بيتري لمراقبة شكل فراشة وقطع ما يقرب من نصف كل جناح، وذلك باستخدام شفرة الحلاقة المعقمة (الشكل 1H، I).
    ملاحظة: الشكل 1J يصور المخ الأوسط بطني معزولة.
  8. نقلقطعة من المخ الأوسط بطني في الجليد الباردة HBSS في أنبوب مخروطي 15 مل والمضي قدما في الجنين القادم.
    ملاحظة: خطوات 2،1-2،8 يجب أن لا يستغرق أكثر من 1 ساعة. حفظ الأجنة خارج هذا الإطار الزمني على الجليد يقلل بقاء الخلية بشكل كبير.

3. التفكك لخلايا المخ الأوسط بطني

  1. نقل قطع من المخ الأوسط بطني تحت غطاء تدفق الصفحي. إزالة HBSS وإضافة 1 مل قبل حرارة (37 درجة مئوية) 0.05٪ التربسين EDTA-في أنبوب مخروطي (كميات كافية لمدة تصل إلى 12 قطعة من المخ الأوسط بطني). احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
  2. إزالة التربسين-EDTA تحت غطاء محرك السيارة وإضافة 1 مل المتوسطة دي تفعيل (لن المصل إلغاء تنشيط التربسين) إلى الأنسجة.
  3. إزالة المتوسطة التعطيل وغسل الأنسجة في 1 مل المتوسطة كاملة مرتين.
    ملاحظة: تجنب إزالة جميع متوسطة من الأنبوب وpipetting لالأنسجة، لمنع التخلص من خلايا فصلها.
  4. إضافة المتوسطة كاملة 1ML ويسحقراتي الأنسجة مع كوب ماصة مصقول النار. تجنب تشكيل فقاعات ومواصلة الطحن حتى يتحقق تعليق خلية واحدة.
    ملاحظة: عادة، 8-10 يمر عبر طرف مقيدة مطلوبة لتفارق كاملة.
  5. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT وإزالة المتوسطة.
  6. اعادة تعليق بيليه في 1 مل المتوسطة كاملة من قبل pipetting ببطء صعودا وهبوطا لمدة تصل إلى أربع مرات.

4. خلايا المخ الأوسط بطني تصفيح

  1. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 90 ميكرولتر التريبان حل الأزرق وحساب عدد الخلايا مع عدادة الكريات.
    ملاحظة: يمكن أيضا فحص قابلية الخلايا في هذه المرحلة.
  2. وضع تعقيمها ميكروسنتريفوج قبعات أنبوب في 100 ملم أطباق بتري ونقل بولي-L-الأورنيثين / coverslips Laminin المغلفة، وذلك باستخدام ملقط، في وقت واحد على رأس مباراة دولية.
    ملاحظة: لا يغسل لل coverslips وتجنب تجفيف laminin، لأن هذا قد يسبب uneveن الثقافات وانخفاض في البقاء على قيد الحياة من الخلايا.
  3. ضبط مستوى الصوت إلى 1،500 خلية لكل ميكرولتر 1 بإضافة المتوسطة كاملة وإضافة 100 ميكرولتر (ما مجموعه 150،000 خلايا) من تعليق خلية على رأس كل ساترة (وحدة التخزين الأمثل لتغطية سطح ساترة دون انسكاب). إغلاق أطباق بتري واحتضان لهم لمدة 1 ساعة في ترطيب حاضنة زراعة الأنسجة (37 ° C، 5٪ CO 2).
    ملاحظة: خطوة حاسمة: مطلوب هذه الخطوة لتعزيز المرفق وقابلية الخلايا وزيادة عدد coverslips في الجنين. بدلا من ذلك، فإن الخلايا يمكن نقلها مباشرة إلى آبار (coverslips تحتوي على) ولكن ينبغي زيادة عدد الخلايا إلى 350،000 لكل بئر (بدلا من 150،000). وبعبارة أخرى، باستخدام هذه الطريقة، 8-10 coverslips يمكن الحصول عليها، في حين نقل مباشر ينتج حوالي 3-4 coverslips بسبب الخلايا، والتي نعلق على لوحات (بجانب أو تحت لل coverslips). متوسط ​​viabiliكان تاي من الثقافات، وذلك باستخدام هذه الطريقة حوالي 90٪.

5. النمو والصيانة الثقافة

  1. بعد 1 ساعة من الحضانة، ونقل بعناية لل coverslips بما في المتوسط ​​إلى 24 لوحات جيدا، والتي تحتوي على 400 ميكرولتر قبل تحسنت (إلى 37 درجة مئوية) المتوسطة كاملة (إجمالي حجم: 500 ميكرولتر). احتضان الخلايا O / N في 37 درجة مئوية.
  2. في غضون 24 ساعة بعد الحضانة من الآبار، إضافة بلطف 500 ميكرولتر المتوسطة الكامل في كل بئر.
    ملاحظة: الساعات القليلة الأولى هي المرحلة الأكثر أهمية لبقاء الخلايا العصبية الدوبامين وعدد من الخلايا على قيد الحياة لا يغير بشكل كبير بعد هذه النقطة.
  3. لا تقم بإضافة وسائل الإعلام إضافي للثقافات لأول أسبوعين أو حتى المتوسطة يصبح أصفر. إذا زرع لأكثر من أسبوعين أو يتغير لونها إلى اللون الأصفر المتوسطة، وتبادل نصف وسائل الإعلام (500 ميكرولتر) مع وسائل الاعلام قبل تحسنت كاملة جديدة (عادة كل أسبوعين).
    ملاحظة: الخلايا العصبية الدوبامين داخلأن الثقافات البقاء على قيد الحياة لأكثر من 6 أسابيع في ظل هذه الظروف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المناعية ضد التيروسين هيدروكسيلاز (ث) تبين أن بين 0.5-1٪ من الخلايا في الثقافة هي الدوبامين. ويبدو أن التوقعات العصبية في غضون 2 ساعة بعد الطلاء وقبل اليوم الأول، ومحاور عصبية والتشعبات هي تمييزها (الشكل 2)، وذلك باستخدام هيدروكسيلاز التيروزين (TH) والبروتين (2 MAP2) الأجسام المضادة المرتبطة أنيبيب (الشكل 3). الخلايا العصبية البقاء على قيد الحياة لأكثر من ستة أسابيع وتظهر ثمرة واسعة النطاق. نسبة الخلايا العصبية، الدبقية في الثقافات ويرتبط مباشرة إلى تركيز مصل الدم في المتوسط، كما هو موضح سابقا. حين القضاء على FBS من الثقافات قد تسفر الثقافات العصبية نقية نسبيا، وقد وجدت نحن وغيرنا أن إضافة مصل يزيد بقاء الخلايا العصبية الدوبامين في الثقافة 9.

الشكل (1)
الشكل 1. إجراء لعزلالمخ الأوسط بطني الجنينية. وتخطيطيا من E12.5 مخ الفأر، والحدود الدماغ المتوسط ​​(الخطوط المتقطعة)، وموقف التقريبي للمنطقة من الفائدة، والمخ الأوسط بطني، داخل المستطيل الأحمر (A)، وأدوات لتشريح المخ الأوسط بطني ، وترد على bioscissor، foreceps، وحامل شفرة (B). تؤخذ الأجنة الخروج من الكيس الذي يحيط بالجنين عن طريق تمزيق عليه (C). المنطقة من الفائدة، والمخ الأوسط بطني، يظهر من المستطيل (D). يتم عزل الدماغ المتوسط ​​عن طريق قطع عند البرزخ (من اليسار للقطع قطعة) والحدود-المخ الأوسط الدماغ الأمامي (اليمنى. E). يتم قطع الجزء ظهراني ناصفي من المخ الأوسط (F) وسوت عليه، لتشبه شكل فراشة (G، H). ثم يتم فصل السحايا من الدماغ (H) والمخ الأوسط بطني (المستطيل) معزولة عن الجزء الظهري بقطع نصف الأجنحة، باستخدام شفرة الحلاقة (J) إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وأبقى على الجليد، حتى التفكك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الصور brightfield التمثيلية للثقافات الدماغ المتوسط ​​البطنية. وقد أخذت صور على DIV1 (يسار)، DIV2 (وسط)، وDIV15 (يمين). شريط مقياس: 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل، ثمرة من العمليات وsynaptogenesis في أسبوعين سدينار بطني ثقافات الدماغ المتوسط. الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط، التي حددها التيروزين هيدروكسيلاز الأجسام المضادة تنمو محاور عصبية والتشعبات الواسعة، التي حددها MAP2 الأجسام المضادة، في ثقافات الدماغ المتوسط ​​بطني بعد أسبوعين من التفكك من أجنة E12.5. التشعبات يمكن تمييزها عن طريق تداخل ث والعمليات MAP2 إيجابية، حيث الألياف لا تمثل سوى ث إيجابية محاور عصبية. كانت تستخدم الأجسام المضادة في التخفيف من 1: 200. شريط مقياس: 20 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخلايا العصبية الدوبامين في المخ الأوسط هي المصدر الرئيسي الدوبامين في الجهاز العصبي المركزي. وهي تنقسم إلى ثلاث مجموعات، بارس المادة السوداء المكتنزة (SNpc)، المنطقة البطنية السقيفية (VTA) والميدان retrorubral (قوة الرد السريع) 10، 11. الخلايا العصبية في SNpc وVTA تؤدي إلى مسارات الدوبامين الرئيسية، mesocortical، mesolimbic وnigro-مخططي، والمشاركة في وظائف مثل السيطرة على المشاعر والدوافع والسلوك الحركي. زوال الخلايا العصبية في SNpc واضطراب وظيفي للنظام السوداوي المخططي هو السمة المرضية الرئيسية للالثاني اضطراب الاعصاب الأبرز، ومرض باركنسون (PD) 12،13. النهج العلاجية الحالية تعالج أعراض المرض وليس لوقف أو إبطاء الضمور وأسباب بطء، وفقدان الخلايا التقدمية لا تزال غير معروفة 14-16. لذلك، وتطوير في الجسم الحي وتقنيات المختبر لدراسة الإنمائية للntal، والكيمياء الحيوية، والخصائص الفسيولوجية هذه الفئة من السكان الخلايا العصبية لا بد من فهم مسببات PD وتطوير مناهج علاجية جديدة.

نحن هنا وصف طريقة الأمثل لتشريح، التفكك وزراعة الخلايا العصبية الأولية من الفأر الجنينية والفئران المخ الأوسط بطني، مما يؤدي في المدى الطويل في البقاء على قيد الحياة في المختبر من الخلايا العصبية الدوبامين من هذه المنطقة، مما يتيح دراسة العمليات مثل التمايز، محواري ثمرة وتشكيل المشبك. وتشمل العديد من المزايا من هذا البروتوكول زيادة عدد coverslips في جنين والاستقلال من عوامل النمو وطول البقاء على قيد الحياة في المختبر، وتعظيم تطوير الخلايا العصبية 4. هذه الطريقة قد تكمل الدراسات المجراة في السماح لفهم الآليات الكامنة وظائف فسيولوجية طبيعية من الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط ​​وكذلك الضمور التدريجي من هذه الخلايا العصبيةالسكان القاعدة في نماذج السامة للخلايا وراثية لمرض الشلل الرعاش.

واحدة من أهم عيوب هذا البروتوكول هو عدم التمييز بين SNpc وVTA الخلايا العصبية الدوبامين. وجود هذه المشكلة لأن في ذلك الوقت من زراعة (E12.5 في الفئران أو الجرذان في E14.5) التمايز النهائي من الخلايا العصبية والجهوية التي ليست كاملة وفي حين أن استخدام الأجنة القديمة هو ممكن، فإنه يقلل بشكل كبير من بقاء الخلايا العصبية بسبب axotomy. ان التمييز بين الشعبين يكون من الممكن من قبل مناعية، وذلك باستخدام أجسام مضادة ضد علامات محددة لكل السكان مثل Girk2 (لتحديد الخلايا العصبية SNpc) وCalbindin (لتحديد الخلايا العصبية VTA) 17.

الطلاء الأمثل هو موضح في القسم 4 يقلل من كمية الأجنة في التجربة بأكثر من 50٪ ويساهم في الحد من استخدام الحيوانات في البحوث بالتالي. الخطوات الأكثر أهمية لبقاء عبادةures هي الوقت بين euthanization من السدود وتشريح كامل للmidbrains الجنينية (الخطوة 2،1-2،8)، فضلا عن الاستئصال الكامل للالسحايا (الخطوة 2.6، الشكل 1H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 Invitrogen 11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid Invitrogen 24020-117
Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) Invitrogen 16140
N2 Supplement (100X), liquid Invitrogen 17502-048
D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water Sigma G8769
Bovine serum albumin BSA Sigma A9430
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma L2020
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15070
Trypsin (0.05% (wt/vol) Invitrogen 25300
Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested Sigma  A9418
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma P3813
Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody Pel-Freez Biologicals P60101-0 
Poly-L-ornithine, 0.01% solution Sigma P4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody Millipore MAB3418
Anti-Synapsin-1 antibody Millipore AB1543P
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG   antibody Molecular Probes A-21206
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG   antibody Molecular Probes A-21207
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG   antibody Molecular Probes A-11015
Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG   antibody Molecular Probes A-11016
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG   antibody Molecular Probes A-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) Biowhittaker 17-942E
Stereo Microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
Inverted phase contrast microscope Carl Zeiss Axiovert 40 C
Dumont Forceps Fine Scientific Tools May-45
Cover Slip Forceps – Dumoxel Fine Scientific Tools 11251-33
Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel Fine Scientific Tools 11245-30
Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm Fine Scientific Tools 10052-11
Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm Fine Scientific Tools 91460-11
Fiber optic halogen illuminator Nikon MKII
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes Fisherbrand 13-678-20C
Hemocytometer Proscitech SVZ2NIOU
0.2 µm sterile filter units Nalgene NL-CE-156-4020
100x20 mm Petri dishes BD Biosciences 351005
Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm Bellco Glass 1943-10012 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
  2. Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
  3. Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
  4. Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
  5. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
  6. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
  7. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
  8. Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
  9. Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
  10. Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
  11. Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
  12. Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
  13. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
  16. Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
  17. Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).

Tags

علم الأعصاب، العدد 96، المخ الأوسط بطني، ومرض باركنسون، والدوبامين، والثقافة الخلايا العصبية الأولية، وتطوير الخلايا العصبية، تنكس عصبي
العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weinert, M., Selvakumar, T.,More

Weinert, M., Selvakumar, T., Tierney, T. S., Alavian, K. N. Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains. J. Vis. Exp. (96), e52475, doi:10.3791/52475 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter