Introduction
多巴胺能神经元从黑质损耗致密部导致帕金森氏病（PD），所述第二最常见的神经变性疾病的基本运动症状。这种脑的神经元群的灭亡的根本原因尚不清楚。研究负责开发和调制神经生理特性和mesDA神经元，几个细胞培养和动物模型系统的生存已使用的生化途径。永生化细胞系，包括大鼠多巴胺能细胞系1RB 3 AN 27（N27），所述的SH-SY5Y人的多巴胺能神经母细胞瘤细 胞系，小鼠的多巴胺能杂交细胞系MN9D和人脑LUHMES细胞已被用于生化和有限的机理研究1 -5。对于mesDA神经元的具体损失的研究，几种神经毒素为基础和遗传模型已开发6-8。原发性脑腹侧文化，提供一个不可缺少的工具用于研究多巴胺能神经元的神经元和突触的属性和参与这一常见的疾病的发病机制中的通路。
这里我们提出了一个详细的协议，用于中脑多巴胺能神经元的分离，它含有导致更高的生存能力和每个胚胎盖玻片的增加的产量的修改。使用预成熟E12.5鼠脑（E14.5大鼠）提高了生存能力。在这个年龄段的神经元还没有开发轴突的是，它在清扫树叶细胞的完整，减少应力，从而提高显著生存能力。此外，小心解剖腹侧中脑，如在该协议的第2节描述的，进一步提高的生存能力。增加每个胚胎盖玻片的数量，另一种电镀方法，提出在该协议的第4条。这导致每个胚胎高达10盖玻片的收率相比，下4盖玻片标准电镀条件从而减少每个实验动物的数量。
在轴突和树突的文化展品生长的神经元，形成突触联系，揭示了神经元和突触的标记使这些文化适合活细胞成像，免疫细胞化学和电生理研究的存在。此外，使用的神经元培养物的促进基因和药理学操纵。 体外 2天的轴突生长允许发育研究。此外，培养物的长期存活（最多6周），使它们适合于这些神经元的速度慢，进行性变性的研究。
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Protocol
注：该动物保持并遵守处理与制度的指导方针，所有动物的程序批准了帝国学院的动物福利和伦理审查机构（AWERB）以及内政部和哈佛大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）符合联邦和州法规。
1，试剂和设备安装
- 解冻，分装和存储1日-80ºC毫克/毫升层粘连蛋白的解决方案。溶解2微升在1ml DMEM / F12，导致在1-2微克/厘米2的涂布的浓度。
注：解冻层粘连慢慢在冰上并溶解在冷的DMEM / F12，并立即将其添加到板/盖玻片。 - 稀释75毫升0.01％聚-L-鸟氨酸425毫升的PBS，并储存于4ºC。
注：工作液的保质期长达一个月。 - 溶解25％（重量/体积）BSA的PBS，pH 7.4中，并储存在4ºC长达一个咋AR。
- 制备50％FBS（在HBSS中）的失活的介质。
- （+） - - 葡萄糖（重量/体积），0.25％的BSA（重量/体积），以通过添加50U / ml的青霉素和链霉素，1×N2添加剂，5％（体积/体积）胎牛血清，0.36％D制备的完全培养基DMEM / F12，并储存在4ºC。
注：保质期是10天。 - 在沸腾的70％（体积/体积）乙醇为至少30分钟的地方盖玻片以除去油脂和高压釜任何痕迹。
- 在24孔板的地方盖玻片并加入500μl聚-L-鸟氨酸溶液到每个孔中。孵育所述组织培养罩下1小时，在室温下，然后，洗3次，用500μl水。加入500μl层粘连蛋白的解决方案，以每块板和孵化O / N在湿润的组织培养孵化器在37ºC。
注意：虽然没有洗涤是必要的层粘连蛋白处理后，洗涤该聚-L-鸟氨酸小于三倍导致细胞的死亡培养后24小时。 - 擦亮玻璃吸管超过天然气或火炬f显示提示跛脚。
注意：在此步骤之后的尖端的直径应为约一半正常大小的。 - 削减1.5 ml离心管的盖子，用剪刀蒸压釜和。
2.解剖胚胎中脑腹侧的
- Narcotize定时怀孕（E12.5）的CO 2吸入水坝，然后由颈椎脱位安乐死。
- 喷用70％乙醇的腹部，使腹部切口，直到子宫囊都暴露出来。使用镊子削减阴道附件，删除子宫。放置在冰冷的HBSS子宫，在100毫米培养皿中。
- 除去从子宫和羊膜囊胚胎，使用镊子（ 图1C）。地方胚胎在新鲜的冰冷的HBSS。
注： 图1D的矩形表示胚胎中脑腹侧的位置。 - 将解剖显微镜（10倍放大倍率）在胚胎和解剖脑拱通过切割大脑在峡部和中脑-间脑边界区域，使用bioscissor和镊子（ 图1E，请参考图1A，用于切口线）。
- 后取出整个脑，做了脑内侧背（ 图1F）削减。
- 除去脑膜，使用两个镊子（ 图1H）。
注：关键步骤：此步骤是为最佳的神经元的产量和存活至关重要。由于培养条件是最佳的脑细胞中，大部分从周围组织中的细胞死电镀后，并从该组织中的细胞凋亡信号可能损坏培养物的完整性。 - 拼合在培养皿中脑组织，观察蝴蝶造型和削减大约各占一半机翼，用消毒的剃须刀片（ 图1H，I）。
注： 图1J描绘了孤立的腹侧中脑。 - 转让一块腹脑入冰冷的HBSS在一个15毫升的锥形管，然后继续下一个胚胎。
注意：步骤2.1-2.8不应超过1小时。保持胚胎超出在冰上这个时间帧显著降低细胞活力。
3.解离腹侧中脑细胞
- 传送下一个层流罩腹侧中脑的部分。移除HBSS和加入1 ml预热（37℃）0.05％胰蛋白酶-EDTA入锥形管（体积足够容纳12个腹侧中脑）。孵育所述组织在37ºC5-10分钟。
- 除去胰蛋白酶-EDTA罩下和加入1毫升去活化介质（血清将停用胰蛋白酶）来组织。
- 取出失活介质和洗涤在1ml完全培养基中的组织的两倍。
注：避免除去从管的所有介质和吸取的组织，以防止废弃离解的细胞。 - 加入1ml完全培养基和三叔尿酸盐用火抛光的玻璃吸管的组织。避免形成气泡，并继续直到捣碎单细胞悬浮液来实现的。
注：通常情况下，8-10通过限制提示所需的完整的解离。 - 离心细胞，在400×g离心5分钟，在室温并取出介质。
- 重新暂停通过缓慢吹吸在1ml完全培养基中的沉淀和向下多达四次。
4.电镀中脑腹侧细胞
- 混合10微升细胞悬浮液与90微升锥虫蓝溶液，并用血细胞计数器计数细胞数。
注：细胞的生存力，也可以在此阶段进行检查。 - 放置无菌微量离心管帽在100mM培养皿转移聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片，使用镊子，一次一个上盖帽的顶部。
注意：不要洗盖玻片，避免干燥的层粘连蛋白，因为这可能会导致uneveñ文化和减少细胞的生存能力。 - 加入完全培养基调节音量，以每1微升1500细胞并在每个盖玻片的顶部添加细胞悬浮液的100微升（总共150,000个细胞的）（体积为最佳，以覆盖盖玻片的表面而不溢出）。关闭培养皿孵育它们1小时，在湿润的组织培养箱（37℃，5％的CO 2）。
注：关键步骤：此步骤是必需的用于增强细胞的附着和生活力并增加每个胚胎盖玻片的数量。或者，所述细胞可以直接转移到孔中（含有盖玻片），但是单元的数目应增加（而不是150000），以350000每孔。换句话说，使用这种方法，8-10盖玻片能够获得，而直接转移产生，因为细胞，其附着到所述板（旁或盖玻片下）为约3-4盖玻片。平均viabiliTY培养物，使用该方法是在90％左右。
5.文化成长和维护
- 1小时温育后，小心地转移盖玻片包括介质到24孔板，含有400微升预热（37℃）的完全培养基（总体积：500微升）。孵育细胞O / N为37ºC。
- 内孔中温育24小时后，轻轻地加入500微升完全培养基到每个孔中。
注：第几个小时为多巴胺能神经元的存活和存活细胞的数目不显著超过该点改变的最关键的阶段。 - 不附加媒体添加到培养的头两个星期或直至介质变为黄色。如果对于超过两周或介质颜色变为黄色，介质的交换一半（500微升）与新鲜的完全预热介质（典型地每两个星期）培养。
注：内多巴胺能神经元培养将生存在这些条件下6周以上。
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Representative Results
免疫组织化学对酪氨酸羟化酶（TH）表明，该细胞在培养中的0.5-1％之间的多巴胺。电镀后的2小时的神经元突起出现并通过第一天，轴突和树突是可区分（ 图2），使用酪氨酸羟化酶（TH）和微管相关蛋白2（MAP2）抗体（ 图3）。神经元存活超过六个星期，并显示大量的产物。在培养的神经元 - 神经胶质细胞比直接相关的血清的培养基中的浓度，如前所示。同时消除FBS从培养可以产生相对纯净的神经元培养物中，我们和其他人已发现，添加血清的增加多巴胺能神经元的生存力在培养9。
图1.程序隔离胚胎中脑腹侧。E12.5小鼠大脑的示意图，中脑边界（虚线），和感兴趣的区域的近似位置，腹侧中脑，红色矩形（A）和所述工具为腹侧中脑的解剖内，一个bioscissor，foreceps，和一个刀片保持件（B）中被示出。将胚从羊膜囊取出破裂它（℃）。的利益，腹侧中脑区域中，示出由矩形（D）。脑是通过切割在峡部（切一块左）和中脑，前脑边界（，E右）隔离。中脑的内侧背部被切断（F）和它是扁平的，类似于一个蝴蝶形状（G，H）。然后，脑膜从脑（H）和腹侧中脑（矩形）从背侧部分分离切断一半的翅膀，使用剃须刀片解离
图腹侧中脑培养物的2代表明的图像。拍摄图像上DIV1（左），DIV2（中心），和DIV15（右）。比例尺：50微米请点击此处查看该图的放大版本。
图3.长期生存，过程产物和突触的2周ØLD中脑腹侧文化。中脑多巴胺能神经元，确定了酪氨酸羟化酶抗体从E12.5胚胎分离两周后长出大量的轴突和树突，确定了微管相关蛋白的抗体，在中脑腹侧文化。树突可以通过钍和MAP2阳性的过程，只有TH阳性纤维的轴突代表重叠区分开来。抗体的稀释度使用的1：200。比例尺：20微米请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在中脑多巴胺能神经元是多巴胺在中枢神经系统中的主要来源。它们被分成三组，黑质致密部（黑质致密部），腹侧被盖区（VTA）和retrorubral字段（RRF）10，11。在黑质致密部和VTA的神经元产生重大多巴胺能通路，mesocortical，脑边缘和黑质纹状体，涉及的功能，如情感，动机和运动行为的控制。在黑质致密部和黑质纹状体系统的功能性破坏的神经元死亡是第二个最显着的神经变性疾病，帕金森氏病（PD）12,13的主要病理特征。当前的治疗方法解决该疾病的症状，并且不停止或减缓变性和缓慢，进行细胞丧失的原因仍未知14-16。因此， 在体内和体外技术用于开发包的研究开发ntal，生化和这个神经元种群的生理特性是必须理解PD的并以新的治疗方法的发展的病因。
在这里，我们描述了解剖，解离和从胚胎小鼠和大鼠腹侧中脑，这会导致长期在这个区域中的多巴胺能神经元的体外存活初级神经元培养的优化方法，使该方法如分化，轴突的研究生长和突触的形成。这个协议的几个优点包括每个胚胎盖玻片数量的增加，独立于生长因子和体外存活的长度，从而最大限度地神经元4的发展。这种方法可以补充体内研究中，允许对理解底层中脑多巴胺能神经元的正常生理功能的机制，以及该神经元的进行性变性人种群中帕金森病的细胞毒性和遗传模型。
其中该协议的主要缺点是缺乏黑质致密部和腹侧被盖区多巴胺能神经元之间的区别。这个问题的存在，因为在（大鼠小鼠E12.5或E14.5）培养神经元的终末分化的时间和它们的区域化是不完整的，并同时利用旧的胚胎是可能的，它显著降低的生存由于神经干切断来。区分这两个群体有可能通过免疫组化，使用抗每个群体，如GIRK2特异性标志物（以确定黑质致密部神经元）和钙结合蛋白（识别VTA神经元）17。
在部分4中描述的优化电镀超过50％降低每个实验胚胎的量，因此，有助于减少在研究中使用的动物。为邪教的生存最关键的步骤URES是水坝安乐死和胚胎midbrains（步骤2.1 - 2.8）的完整解剖之间的时间，以及在完全除去脑膜（步骤2.6， 图1H）。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
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