Introduction
Tab af dopaminerge neuroner fra substantia nigra pars compacta fører til kardinal motoriske symptomer på Parkinsons sygdom (PD), den anden mest udbredte neurodegenerative lidelse. Den underliggende årsag til lukningen af denne mesencephale neuronal population er ikke kendt. For at undersøge de biokemiske veje, der er ansvarlige for udviklingen og modulerende neurofysiologiske egenskaber og overlevelse mesDA neuroner, adskillige cellekultur og dyremodelsystemer er blevet anvendt. Immortaliserede cellelinjer, herunder rotte dopaminerge cellelinie 1RB 3 AN 27 (N27), den humane dopaminerge neuroblastom-cellelinje SH-SY5Y, muse dopaminerge hybrid cellelinie MN9D og human mesencephale LUHMES celler er blevet anvendt til biokemiske og begrænsede mekanistiske undersøgelser 1 -5. Til undersøgelse af den specifikke tab af mesDA neuroner, adskillige neurotoksin-baserede og genetiske modeller er blevet udviklet 6-8. Primære ventrale midthjernen kulturerGive et uundværligt redskab til at studere de neuronale og synaptiske egenskaber af dopaminerge neuroner og involveret i patogenesen af denne fælles lidelse veje.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til isolering af mesencephaliske dopaminerge neuroner, der indeholder ændringer resulterer i højere overlevelsesevne og øget udbytte af dækglas pr embryo. Anvendelse af præ-modne E12.5 mus mesencephalon (E14.5 i rotte) øger overlevelsesevne. I denne alder neuroner har ikke udviklet axoner endnu, hvilket efterlader cellerne intakte under dissektion og minimerer stress derved signifikant stigende rentabilitet. Desuden omhyggelig dissektion af den ventrale midthjernen, som beskrevet i afsnit 2 i denne protokol, forbedrer overlevelsesevne yderligere. For at øge antallet af dækglas pr embryo, er en alternativ plating metode præsenteres i afsnit 4 i denne protokol. Dette fører til et udbytte på op til 10 dækglas pr embryo sammenlignet med 4 dækglas understandard plating betingelser således at reducere mængden af dyr pr eksperiment.
Neuroner i kultur udviser udvækst af axoner og dentrites, danner synaptiske forbindelser og afsløre tilstedeværelsen af neuronale og synaptiske markører gør disse kulturer er egnet til levende celler, immuncytokemiske og elektrofysiologiske studier. Desuden er brugen af neuronale kulturer letter genetiske og farmakologiske manipulation. Udvækst af neuritter fra dag 2 in vitro muliggør udviklingsmæssige undersøgelser. Endvidere langsigtede overlevelse af kulturer (op til seks uger) gør dem egnede til undersøgelse af langsom, progressiv degeneration af disse neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Dyrene blev opretholdt og håndteres i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og alle dyreforsøg blev godkendt af Imperial College Animal Welfare og etisk organ (AWERB) og indenrigsministeriet og Harvard University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i overensstemmelse med føderale og statslige regler.
1. Reagens og udstyr Setup
- Thaw, portion og opbevare 1 mg / ml laminin opløsning ved -80 ºC. Opløs 2 pi i 1 ml DMEM / F12, hvilket resulterer i en coating-koncentration på 1-2 ug / cm2.
BEMÆRK: Thaw Laminin langsomt på is og opløses i koldt DMEM / F12 og straks tilføje det til plader / dækglas. - Fortyndes 75 ml af 0,01% poly-L-ornithin i 425 ml PBS og opbevares ved 4 ºC.
BEMÆRK: Holdbarheden af den arbejdende løsning er op til en måned. - Opløs 25% (vægt / vol) BSA i PBS, pH 7,4, og opbevares ved 4 ° C i op til et Iar.
- Forbered 50% FBS (i HBSS) deaktivering medier.
- Forbered komplet medium ved tilsætning af 50 U / ml penicillin og streptomycin, 1x N2 supplement, 5% (vol / vol) FBS, 0,36% D - (+) - glucose (vægt / vol), 0,25% BSA (vægt / vol) til DMEM / F12 og opbevares ved 4 ºC.
BEMÆRK: Holdbarheden er op til 10 dage. - Place dækglas i kogende 70% (vol / vol) ethanol i mindst 30 min for at fjerne eventuelle spor af fedt og autoklav.
- Place dækglas i 24-brønds plader og tilsæt 500 pi poly-L-ornithin opløsning til hver brønd. Inkuber 1 time under vævskultur hætte ved stuetemperatur, og derefter vaskes 3 gange med 500 pi vand. Tilføj 500 pi laminin opløsning til hver plade og inkuberes O / N i befugtet vævskultur inkubator ved 37 ºC.
BEMÆRK: Selv om der ikke vasker er nødvendigt efter laminin behandling, vask af poly-L-ornithin mindre end tre gange resulterer i død af cellerne 24 timer efter dyrkning. - Polsk spidsen af glas pipetter end naturgas eller brænder fhalt.
BEMÆRK: Efter dette trin diameter af spidsen bør være omkring halvdelen af den normale størrelse. - Skær hætter af 1,5 ml mikrocentrifugerør ved anvendelse af en autoklaveret saks og autoklav.
2. Dissektion af embryonale Ventral Midbrain
- Narcotize timed-gravide (E12.5) dæmninger af CO 2 indånding og derefter aflive ved cervikal dislokation.
- Spray maven med 70% ethanol og foretage en abdominal incision, indtil uterine sacs alle udsættes for. Ved hjælp af pincet sender vaginal fastgørelse og fjerne livmoderen. Placer uterus i iskold HBSS, i en 100 mm petriskål.
- Fjern embryoner fra livmoderen og fosterhinden, ved hjælp af en pincet (figur 1C). Placer embryoner i frisk iskold HBSS.
BEMÆRK: rektangel i figur 1D viser placeringen af embryonale ventral midthjernen. - Placer embryoner under en dissektion mikroskop (10x forstørrelse) og dissekere mesencephalebue ved at skære hjernen på landtangen og mesencephale-diencephalic grænse region, ved hjælp af bioscissor og pincet (figur 1E, henvises til figur 1A for linjer af indsnit).
- Efter at have taget ud af hele midthjernen, lave et snit i mediodorsal midthjernen (figur 1F).
- Fjern meninges, ved hjælp af to tænger (figur 1 H).
BEMÆRK: afgørende skridt: Dette trin er afgørende for optimal neuronal udbytte og overlevelse. Da dyrkningsbetingelser er optimale for hjerneceller, de fleste af cellerne fra det omgivende væv dø efter udpladning og apoptotiske signal fra dette væv kan beskadige integritet kulturerne. - Glat midthjernen væv på petriskålen at observere sommerfugl form og skære omkring halvdelen af hver vinge, ved hjælp af en steriliseret barbering klinge (Figur 1 H, I).
BEMÆRK: Figur 1J viser den isolerede ventrale midthjernen. - Overførstykke ventrale midthjernen i iskold HBSS i en 15 ml konisk rør og gå videre med den næste foster.
BEMÆRK: Trin 2,1-2,8 bør ikke tage mere end 1 time. Holde embryoner ud over denne tidsramme på is nedsætter celleviabilitet betydeligt.
3. Dissociation af ventrale midthjernen Cells
- Overfør stykker af ventrale midthjernen under en laminar flow hætte. Fjern HBSS og der tilsættes 1 ml foropvarmet (37 ºC) 0,05% trypsin-EDTA i den koniske rør (mængder nok til op til 12 stykker af ventrale midthjernen). Inkubér væv ved 37 ºC i 5-10 minutter.
- Fjern trypsin-EDTA under kølerhjelmen og tilsæt 1 ml de-aktivering medium (serum vil deaktivere trypsin) til vævet.
- Fjern deaktivering medium og vask væv i 1 ml komplet medium to gange.
BEMÆRK: undgå at fjerne alle mediet fra røret og pipettering af væv, for at forhindre at kassere de dissocierede celler. - Tilføj 1 ml komplet medium og triturat vævet med en brand-poleret glas pipette. Undgå dannelse af bobler og fortsætte triturering indtil enkelt celle suspension er opnået.
BEMÆRK: Normalt 8-10 passerer gennem den begrænsede tip er nødvendige for fuldstændig dissociation. - Centrifugeres cellerne ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og fjerne mediet.
- Resuspender pellet i 1 ml komplet medium ved langsomt at pipettere op og ned for op til fire gange.
4. Plating Ventral midthjernen Cells
- Bland 10 pi af cellesuspensionen med 90 pi Trypan blå opløsning og tælle antallet af celler med en hæmocytometer.
BEMÆRK: cellernes levedygtighed kan også kontrolleres på dette tidspunkt. - Placer steriliseret mikrocentrifugerør hætter i 100 mm petriskåle og overføre de poly-L-ornithin / Laminin overtrukne dækglas, med pincet, en ad gangen på toppen af hætter.
BEMÆRK: Vask ikke dækglas og undgå tørring af laminin, da dette kan medføre uneven kulturer og fald i overlevelsesevne af cellerne. - Indstil volumen til 1.500 celler pr 1 pi ved tilsætning komplet medium og tilsættes 100 pi (total på 150.000 celler) af cellesuspensionen oven på hver dækglas (mængden er optimalt at dække overfladen af dækglasset uden spild). Luk petriskåle og inkuberes dem i 1 time i en befugtet vævskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
BEMÆRK: afgørende skridt: Der kræves dette trin for at øge udlæg og levedygtigheden af cellerne, og for at øge antallet af dækglas pr embryo. Alternativt kan cellerne overføres direkte i brøndene (indeholdende dækglas), men antallet af celler bør øges til 350.000 per brønd (i stedet for 150.000). Med andre ord, ved hjælp af denne metode, kan 8-10 dækglas erhverves, mens direkte overførsel giver omkring 3-4 dækglas på grund af de celler, der knytter sig til pladerne (ved siden af eller under dækglas). Den gennemsnitlige viability af kulturerne, ved hjælp af denne metode var omkring 90%.
5. Kultur Vækst og vedligeholdelse
- Efter 1 time inkubation omhyggeligt overføre dækglassene herunder mediet i 24-brønds plader indeholdende 400 pi forvarmet (til 37 ºC) komplet medium (total volume: 500 pi). Inkubér cellerne O / N ved 37 ºC.
- Inden 24 timer efter inkubation af brøndene forsigtigt tilsættes 500 pi komplet medium i hver brønd.
BEMÆRK: De første par timer er den mest kritiske fase for overlevelsen af de dopaminerge neuroner, og antallet af overlevende celler ændrer sig ikke væsentligt ud over dette punkt. - Tilsæt ikke ekstra medier til kulturerne i de første to uger eller indtil mediet bliver gult. Hvis dyrkning i mere end to uger eller mellemstore farveændringer til gul, udveksling halvdelen af medierne (500 pi) med friske komplette foropvarmet medier (typisk hver anden uge).
BEMÆRK: dopaminerge neuroner ikulturer ville overleve i mere end 6 uger under disse betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunhistokemi mod tyrosin hydroxylase (Th) viser, at mellem 0,5-1% af cellerne i kultur er dopaminerge. Neuronale fremskrivninger forekommer inden 2 timer efter udpladning og ved den første dag, axoner og dendritter kan skelnes (figur 2), ved hjælp af tyrosin hydroxylase (TH) og mikrotubulus-associeret protein 2 (Map2) antistoffer (figur 3). De neuroner overlever i mere end seks uger, og viser omfattende udvækst. Den neuron-glia-forhold i kulturerne er direkte relateret til koncentrationen af serum i mediet, som vist tidligere. Samtidig fjerne FBS fra kulturerne kan give relativt rene neuronale kulturer, har vi og andre fundet, at tilsætning af serum øger overlevelsesevne dopaminerge neuroner i kultur 9.
Figur 1. Procedure til isolering afembryonale ventral midthjernen. Den skematisk billede af E12.5 mus hjerne, midthjernen grænser (stiplede linier), og den omtrentlige position af området af interesse, ventral midthjernen, inden for den røde rektangel (A) og værktøjerne til dissektion af den ventrale midthjernen en bioscissor, foreceps og en bladholder (B) er vist. Embryonerne tages ud fra fosterhinden ved at bryde den (C). Regionen af interesse, ventral midthjernen, er vist ved rektanglet (D). Midthjernen isoleres ved at skære i isthmus (til venstre for det afskårne stykke) og midthjernen-forhjerne grænse (højre; E). Den mediodorsal del af midthjernen skæres (F), og det er fladtrykt, at ligne en sommerfugl form (G, H). Derefter meninges adskilles fra hjernen (H) og ventrale midthjernen (rektangel) isoleres fra den dorsale del ved at afskære halvdelen af vingerne ved hjælp af en barbering klinge
Figur 2. Repræsentative lysfelt billeder af ventrale midthjernen kulturer. Billeder blev taget på DIV1 (til venstre), DIV2 (i midten), og DIV15 (til højre). Scale bar:. 50 um Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Langsigtet overlevelse, udvækst af processer og synaptogenese i to uger old ventrale midthjernen kulturer. midthjernen dopaminerge neuroner, identificeret ved tyrosinhydroxylase antistof vokse omfattende axoner og dendritter, identificeret ved Map2 antistof, i de ventrale midthjernen kulturer to uger efter, dissociation fra E12.5 embryoer. Dendritter kan skelnes ved overlap af Th og Map2-positive processer, hvor kun Th-positive fibre repræsenterer axoner. Antistoffer blev anvendt i en fortynding på 1: 200. Scale bar:. 20 pm Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dopaminerge neuroner i midthjernen er den vigtigste kilde til dopamin i centralnervesystemet. De er inddelt i tre grupper, substantia nigra pars compacta (SNpc), ventrale tegmentalområde (VTA) og retrorubral felt (RRF) 10, 11. De neuroner i SNpc og VTA medføre store dopaminerge baner, mesokortikale, mesolimbiske og nigro-striatale, der er involveret i funktioner som kontrol af følelser, motivation og motorisk adfærd. Lukningen af de neuroner i SNpc og funktionelle forstyrrelser af den nigrostriatale system er det vigtigste patologiske kendetegn ved den anden mest fremtrædende neurodegenerativ lidelse, Parkinsons sygdom (PD) 12,13. Nuværende behandlingsformer behandle symptomer på sygdommen og ikke standse eller bremse degeneration og årsagerne til den langsomme, progressive tab celle er stadig ukendt 14-16. Derfor udvikling af in vivo og in vitro-teknikker til undersøgelse af developmental, biokemiske og fysiologiske egenskaber ved denne neuronale population er bydende nødvendigt at forstå ætiologien af PD og til udvikling af nye terapeutiske strategier.
Her beskriver vi en optimeret fremgangsmåde til dissektion, dissociation og dyrkning af primære neuroner fra embryonale mus og rotter ventrale midthjernen, hvilket resulterer i langsigtede in vitro overlevelse af dopaminerge neuroner fra denne region, hvilket tillader undersøgelse af processer, såsom differentiering, axonal udvækst og synapse formation. Flere fordele ved denne protokol omfatter det øgede antal dækglas pr embryo, uafhængighed af vækstfaktorer og længden af in vitro-overlevelse, maksimere udviklingen af neuroner 4. Denne metode kan supplere in vivo studier giver mulighed for at forstå mekanismerne bag normale fysiologiske funktioner på midthjernen dopaminerge neuroner samt progressiv degeneration af denne neuronal befolkning cytotoksiske og genetiske modeller af Parkinsons sygdom.
En af de vigtigste ulemper ved denne protokol er den manglende skelnen mellem SNpc og VTA dopaminerge neuroner. Dette problem eksisterer, fordi på det tidspunkt, dyrkning (E12.5 i mus eller E14.5 i rotter) terminal differentiering af neuroner og deres regionalisering er ikke komplet, og mens brugen af ældre embryoer er muligt, er det reducerer overlevelse neuroner på grund axotomi. At skelne de to populationer ville være muligt med immuncytokemi, anvendelse af antistoffer mod specifikke markører for hver population såsom Girk2 (til identifikation SNpc neuroner) og calbindin (til identifikation VTA neuroner) 17.
Den optimerede plettering er beskrevet i afsnit 4 nedsætter mængden af embryoner pr eksperiment med mere end 50%, og derfor bidrager til at mindske anvendelsen af dyr til forskning. De mest kritiske trin for overlevelsesevne kultenninger er tiden mellem aflivning af dæmninger og fuldstændig dissektion af embryonale midbrains (trin 2,1-2,8), samt fuldstændig fjernelse af meninges (trin 2.6, figur 1 H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
