Introduction
La perdita di neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta conduce ai sintomi motori cardinali della malattia di Parkinson (PD), la seconda malattia neurodegenerativa più diffusa. La causa della morte di questa popolazione neuronale mesencefalica non è nota. Per studiare i meccanismi biochimici responsabili dello sviluppo e modulando le proprietà neurofisiologiche e la sopravvivenza dei neuroni mesDA, diverse colture cellulari e sistemi modello animali sono stati utilizzati. Linee cellulari immortalizzate, compreso il ratto dopaminergica linea cellulare 1RB 3 AN 27 (N27), il dopaminergico umano linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y, la linea cellulare di ibridoma del mouse dopaminergica MN9D e mesencefalico umana LUHMES cellule sono state usate per gli studi meccanicistici biochimici e limitate 1 -5. Per lo studio della perdita di neuroni specifica mesDA, vari neurotossina-based e modelli genetici sono stati sviluppati 6-8. Culture mesencefalo ventrale primarie, Fornire uno strumento indispensabile per lo studio delle proprietà neuronali e sinaptiche dei neuroni dopaminergici e i meccanismi coinvolti nella patogenesi di questa malattia comune.
Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei neuroni dopaminergici mesencefalici, che contiene le modifiche con conseguente maggiore sopravvivenza e una maggiore resa di vetrini per dell'embrione. L'uso di pre-maturo mesencefalo del mouse E12.5 (E14.5 nel ratto) migliora la sopravvivenza. A questa età i neuroni non hanno ancora sviluppato assoni, che lascia intatte le cellule durante la dissezione e riduce al minimo lo stress incrementando in modo significativo la redditività. Inoltre, attenta dissezione del mesencefalo ventrale, come descritto nella sezione 2 del presente protocollo, migliora ulteriormente la capacità di sopravvivenza. Per aumentare il numero di vetrini per embrione, un metodo alternativo di placcatura è presentato nella sezione 4 del presente protocollo. Questo porta ad un rendimento di fino a 10 vetrini per dell'embrione rispetto a 4 coprioggetti sottocondizioni standard di placcatura riducendo così la quantità di animali per esperimento.
I neuroni in coltura mostra conseguenza di assoni e dentrites, formano connessioni sinaptiche e rivelano la presenza di marcatori neuronali e sinaptiche rendono queste culture adatto per l'imaging cellulare dal vivo, immunocitochimica e studi elettrofisiologici. Inoltre, l'uso di colture neuronali facilita la manipolazione genetica e farmacologica. Escrescenza dei neuriti dal giorno 2 in vitro consente per gli studi di sviluppo. Inoltre, la sopravvivenza a lungo termine di culture (fino a sei settimane) li rende adatti per lo studio della lenta, progressiva degenerazione dei neuroni questi.
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Protocol
NOTA: Gli animali sono stati mantenuti e gestiti in conformità con le linee guida istituzionali e tutte le procedure di animali sono stati approvati dal benessere degli animali del Imperial College e Ethical Review Body (AWERB) e il Ministero degli Interni e la Harvard University Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC), in conformità alle normative federali e statali.
1. reagente e installazione attrezzature
- Thaw, aliquota e conservare 1 mg / ml soluzione laminina a -80 ° C. Sciogliere 2 microlitri in 1 ml DMEM / F12, ottenendo una concentrazione di rivestimento di 1-2 mg / cm 2.
NOTA: Thaw laminina lentamente sul ghiaccio e si dissolvono in freddo DMEM / F12 e aggiungerlo ai piatti / coprioggetti immediatamente. - Diluire 75 ml di 0,01% Poly-L-ornitina in 425 ml di PBS e conservare a 4 ° C.
NOTA: La durata della soluzione di lavoro è fino a un mese. - Sciogliere 25% (peso / volume) BSA in PBS, pH 7.4, e conservare a 4 ° C per un massimo di un year.
- Preparare 50% FBS (in HBSS) mezzi di disattivazione.
- Preparare terreno completo aggiungendo 50 U / ml di penicillina e streptomicina, 1x N2 supplemento, 5% (vol / vol) FBS, 0,36% D - (+) - Glucosio (peso / volume), 0,25% di BSA (peso / volume) di DMEM / F12 e conservare a 4 ° C.
NOTA: La durata è fino a 10 giorni. - Luogo coprioggetto in ebollizione il 70% (vol / vol) di etanolo per almeno 30 minuti per rimuovere eventuali tracce di grasso e di autoclave.
- Luogo coprioggetto in piastre da 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri soluzione Poli-L-ornitina in ciascun pozzetto. Incubare 1 ora sotto il cofano di coltura tissutale a temperatura ambiente e poi, lavare 3 volte con 500 microlitri acqua. Aggiungere la soluzione laminina 500 microlitri per ogni piatto e incubare O / N in umidificata coltura tissutale incubatore a 37 ° C.
NOTA: Anche se non sono necessari lavaggi dopo il trattamento laminina, lavare i poli-L-ornitina meno di tre volte provoca la morte delle cellule 24 ore dopo coltura. - Lucidare le punte delle pipette di vetro oltre a gas naturale o torcia fzoppo.
NOTA: Dopo questo passo il diametro della punta dovrebbe essere circa la metà della sua dimensione normale. - Tagliare i tappi di provette da 1,5 ml microcentrifuga, utilizzando una forbice autoclave e autoclave.
2. dissezione embrionali ventrale Mesencefalo
- Narcotizzare gravide temporizzato (E12.5) dighe di CO 2 inalazione e quindi eutanasia da dislocazione cervicale.
- Spruzzare l'addome con il 70% di etanolo e fare un'incisione addominale fino a quando le sacche uterine sono tutti esposti. Uso pinze tagliare l'attaccamento vaginale e rimuovere l'utero. Inserire l'utero in ghiacciata HBSS, in una piastra di Petri 100 mm.
- Rimuovere embrioni dall'utero e sacco amniotico, usando pinze (Figura 1C). Luogo embrioni in HBSS ghiacciata fresca.
NOTA: Il rettangolo in figura 1D indica la posizione del mesencefalo ventrale embrionale. - Mettere gli embrioni al microscopio dissezione (10x) e sezionare il mesencefalicaarch tagliando il cervello al istmo e mesencefalica-diencephalic regione di confine, con il bioscissor e pinza (Figura 1E, si prega di fare riferimento alla Figura 1A per le linee di incisione).
- Dopo aver preso l'intera mesencefalo, fare un taglio nel mesencefalo mediodorsale (Figura 1F).
- Rimuovere meningi, utilizzando due pinze (Figura 1H).
NOTA: PUNTO CRITICO: Questo passaggio è fondamentale per la resa ottimale neuronale e la sopravvivenza. Poiché le condizioni di coltura sono ottimali per le cellule cerebrali, la maggior parte delle cellule del tessuto circostante muoiono dopo placcatura e il segnale apoptotico da questo tessuto può danneggiare l'integrità delle culture. - Appiattire il tessuto mesencefalo sul piatto Petri per osservare la forma a farfalla e tagliare circa la metà di ogni ala, utilizzando una lama da barba sterilizzato (Figura 1H, I).
NOTA: Figura 1J descrive isolato mesencefalo ventrale. - Trasferire ilpezzo di mesencefalo ventrale in ghiaccio-freddo HBSS in un tubo da 15 ml e procedere con il successivo dell'embrione.
NOTA: i passaggi 2,1-2,8 non dovrebbe prendere più di 1 ora. Mantenere gli embrioni di là di questo lasso di tempo sul ghiaccio diminuisce vitalità cellulare in modo significativo.
3. La dissociazione delle cellule ventrale Midbrain
- Trasferire i pezzi di mesencefalo ventrale sotto una cappa a flusso laminare. Rimuovere il HBSS e aggiungere 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) 0,05% tripsina-EDTA nel tubo conico (volumi sufficienti per un massimo di 12 pezzi di mesencefalo ventrale). Incubare il tessuto a 37 ° C per 5-10 minuti.
- Rimuovere tripsina-EDTA sotto il cofano e aggiungere 1 ml di mezzo di disattivazione (siero disattiverà tripsina) al tessuto.
- Rimuovere il mezzo disattivazione e lavare il tessuto in 1 ml di mezzo completo due volte.
NOTA: evitare di rimuovere tutto il supporto dal tubo e pipettando il tessuto, per evitare che scartando le cellule dissociate. - Aggiungere 1 ml terreno completo e triturato il tessuto con un bicchiere pipetta fuoco lucido. Evitare la formazione di bolle e continuare triturazione fino al raggiungimento sospensione di cellule singole.
NOTA: Di solito, 8-10 passa attraverso la punta ristretta sono necessari per la completa dissociazione. - Centrifugare le cellule a 400 xg per 5 minuti a RT e rimuovere il supporto.
- Risospendere il pellet in 1 ml di media completo lentamente pipettando su e giù per un massimo di quattro volte.
4. Cellule placcatura ventrale Midbrain
- Miscelare 10 ml di sospensione cellulare con 90 microlitri Trypan blue soluzione e contare il numero di cellule con un emocitometro.
NOTA: la vitalità delle cellule può essere controllato in questa fase. - Mettere tappi provetta sterilizzati in 100 millimetri piastre di Petri e trasferire i coprioggetti Poly-L-ornitina / laminina rivestite, utilizzando pinze, una alla volta sulla parte superiore dei tappi.
NOTA: Non lavare i coprioggetti ed evitare l'essiccazione della laminina, poiché questo può causare uneveculture n e diminuzione sopravvivenza delle cellule. - Regolare il volume a 1500 cellule per 1 ml aggiungendo mezzo completo e aggiungere 100 microlitri (totale di 150.000 cellule) della sospensione cellulare sopra l'coprioggetto (il volume è ottimale per coprire la superficie del vetrino senza perdite). Chiudere le piastre di Petri e incubare per 1 ora in un incubatore umidificato coltura tissutale (37 ° C, 5% CO 2).
NOTA: PUNTO CRITICO: Questo passo è necessario per migliorare il collegamento e la vitalità delle cellule e per aumentare il numero di lamelle per dell'embrione. In alternativa, le cellule possono essere trasferiti direttamente nei pozzetti (contenenti coprioggetto), ma il numero di celle deve essere aumentata a 350.000 per pozzetto (invece di 150.000). In altre parole, con questo metodo, 8-10 coprioggetto possono essere acquisiti, mentre il trasferimento diretto produce circa 3-4 vetrini a causa delle cellule, che si attaccano alle piastre (accanto o sotto i coprioggetti). La viabili mediaty delle culture, con questo metodo è stato di circa il 90%.
5. Cultura crescita e manutenzione
- Dopo 1 ora di incubazione, trasferire accuratamente i coprioggetti compreso il terreno in piastre da 24 pozzetti, contenente 400 ml di pre-riscaldato (a 37 ° C) terreno completo (volume totale: 500 ml). Incubare le cellule O / N a 37 ° C.
- Entro 24 ore dopo incubazione dei pozzetti, aggiungere delicatamente 500 microlitri terreno completo in ogni pozzetto.
NOTA: Le prime ore è la fase più critica per la sopravvivenza dei neuroni dopaminergici e il numero di cellule sopravvissute non cambia significativamente oltre questo punto. - Non aggiungere supporti supplementare alle colture per le prime due settimane o finché il terreno diventa gialla. Se coltura per più di due settimane o cambiamenti di colore medio al giallo, cambio la metà dei mezzi di comunicazione (500 ml) con mezzi freschi completi pre-riscaldato (tipicamente ogni due settimane).
NOTA: i neuroni dopaminergici nelculture sarebbero sopravvissuti per più di 6 settimane in queste condizioni.
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Representative Results
Immunoistochimica contro tirosina idrossilasi (TH) mostra che tra 0,5-1% delle cellule in coltura sono dopaminergica. Proiezioni neuronali sembrano in 2 ore dopo la placcatura e il primo giorno, assoni e dendriti sono distinguibili (figura 2), utilizzando la tirosina idrossilasi (TH) e proteina 2 (Map2) anticorpi associata ai microtubuli (Figura 3). I neuroni sopravvivono per più di sei settimane e mostrano un'ampia conseguenza. Il rapporto neurone-glia nelle colture è direttamente correlata alla concentrazione di siero nel mezzo, come indicato in precedenza. Eliminando FBS dalle culture possono produrre colture neuronali relativamente puri, noi e altri abbiamo trovato che l'aggiunta di siero aumenta sopravvivenza dei neuroni dopaminergici nella cultura 9.
Figura 1. Procedimento per l'isolamento diembrionale mesencefalo ventrale. La vista schematica di cervello di topo E12.5, confini mesencefalo (linee tratteggiate), e la posizione approssimativa della regione di interesse, mesencefalo ventrale, all'interno del rettangolo rosso (A) e gli strumenti per la dissezione del mesencefalo ventrale , un bioscissor, foreceps, e un supporto lama (B) vengono visualizzati. Gli embrioni sono prese dal sacco amniotico per rottura (C). La regione di interesse, mesencefalo ventrale, è indicata dal rettangolo (D). Mesencefalo è isolato tagliando presso l'istmo (a sinistra del pezzo tagliato) e il confine mesencefalo-prosencefalo (a destra, E). La parte mediodorsale del mesencefalo viene tagliato (F) ed è appiattita, per assomigliare ad una forma a farfalla (G, H). Poi, meningi sono dissociate dal cervello (H) e mesencefalo ventrale (rettangolo) è isolato dalla parte dorsale tagliando metà delle ali, utilizzando una lama da barba
Figura 2. Rappresentante immagini brightfield di culture mesencefalo ventrale. Le immagini sono state scattate a DIV1 (a sinistra), DIV2 (al centro), e DIV15 (a destra). Scala bar:. 50 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. La sopravvivenza a lungo termine, conseguenza di processi e sinaptogenesi in due settimane oculture ld ventrali mesencefalo. neuroni dopaminergici Midbrain, identificati da anticorpi tirosina idrossilasi crescono vaste assoni e dendriti, identificati da anticorpi Map2, nelle culture mesencefalo ventrale due settimane dopo dissociazione da embrioni E12.5. Dendriti si distinguono per sovrapposizione di Th e processi Map2-positivi, dove solo Th-positive fibre rappresentano assoni. Anticorpi stati usati ad una diluizione di 1: 200. Scala bar:. 20 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Neuroni dopaminergici nel mesencefalo sono la principale fonte di dopamina nel sistema nervoso centrale. Sono divisi in tre gruppi, pars compacta della sostanza nera (SNPC), area ventrale tegmentale (VTA) e campo retrorubral (RRF) 10, 11. I neuroni in SNPC e VTA danno luogo a grandi vie dopaminergiche, mesocorticali, mesolimbico e nigrostriatale, coinvolte in funzioni come il controllo delle emozioni, la motivazione e il comportamento del motore. Scomparsa dei neuroni in SNPC e disgregazione funzionale del sistema nigrostriatale è la principale caratteristica patologica della seconda malattia neurodegenerativa più importante, il morbo di Parkinson (PD) 12,13. Approcci terapeutici attuali affrontare i sintomi della malattia e non arrestare o rallentare la degenerazione e le cause della lenta, progressiva perdita di cellule sono ancora sconosciute 14-16. Pertanto, lo sviluppo di in vivo e in vitro per lo studio tecniche del DEVELOPMEntale, biochimico, e le caratteristiche fisiologiche di questa popolazione neuronale è indispensabile per comprendere l'eziologia di PD e allo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.
Qui si descrive un metodo ottimizzato per la dissezione, la dissociazione e coltura di neuroni primari di topo e ratto embrionale mesencefalo ventrale, che si traduce in-lungo termine in vitro sopravvivenza dei neuroni dopaminergici di questa regione, consentendo studio dei processi quali la differenziazione, assonale escrescenza e formazione di sinapsi. Diversi vantaggi di questo protocollo includono l'aumento del numero di coprioggetto per dell'embrione, indipendenza da fattori di crescita e la lunghezza della sopravvivenza in vitro, massimizzando sviluppo di neuroni 4. Questo metodo può integrare gli studi in vivo nel permettere per la comprensione dei meccanismi sottostanti normali funzioni fisiologiche dei neuroni dopaminergici mesencefalo e progressiva degenerazione questo neuroneAl popolazione in modelli citotossici e genetici della malattia di Parkinson.
Uno dei principali svantaggi di questo protocollo è la mancanza di distinzione tra SNPC e VTA neuroni dopaminergici. Questo problema esiste perché al momento della coltura (E12.5 in topi o ratti in E14.5) differenziazione terminale dei neuroni e la loro regionalizzazione non è completa e mentre è possibile l'uso di embrioni anziani, riduce significativamente la sopravvivenza neuroni a causa di assotomia. Distinguendo le due popolazioni sarebbe possibile mediante immunocitochimica, utilizzando anticorpi contro marcatori specifici per ogni popolazione come GIRK2 (per identificare neuroni SNPC) e calbindin (per identificare neuroni VTA) 17.
La placcatura ottimizzato descritto al punto 4 diminuisce la quantità di embrioni per esperimento di oltre il 50% e quindi contribuisce a ridurre l'impiego di animali nella ricerca. Le fasi più critiche per la sopravvivenza del cultoUres sono il tempo tra euthanization delle dighe e completa dissezione dei midbrains embrionali (passo 2,1-2,8), nonché la rimozione completa delle meningi (passo 2.6, Figura 1H).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
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