Introduction
Tap av dopaminerge nevroner fra substantia nigra pars comp fører til kardinal motoriske symptomer på Parkinsons sykdom (PD), den nest mest utbredte nevrodegenerativ lidelse. Den underliggende årsaken til bortfallet av denne mesencefalisk nevronale befolkningen er ikke kjent. Å studere de biokjemiske mekanismer som er ansvarlige for utvikling og modulerende nevrofysiologiske egenskaper og overlevelse av mesDA nevroner, flere cellekultur og dyremodellsystemer har blitt brukt. Udødeliggjorte cellelinjer, inkludert rotte dopaminerg cellelinje 1RB 3 AN 27 (N27), den humane neuroblastom-cellelinje dopaminerge SH-SY5Y, mus dopaminerge hybridcellelinjen og human MN9D mesencefalisk LUHMES celler har vært benyttet for biokjemiske og begrensede mekanistiske undersøkelser 1 -5. For studiet av den spesifikke tap av mesDA neuroner, flere neurotoxin basert og genetiske modeller er blitt utviklet til 6-8. Primære ventral midthjernen kulturer, Gi et uunnværlig verktøy for å studere de nevronale synaptiske og egenskaper av de dopaminerge neuroner og trasé som er involvert i patogenesen av denne vanlig lidelse.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for isolering av mesencefalisk dopaminerge neuroner, som inneholder modifikasjoner som fører til høyere overlevelsesevne, og øker utbyttet av dekkglass pr embryo. Bruk av pre-moden E12.5 mus mesencephalon (E14.5 i rotte) forbedrer overlevelsesevne. I denne alderen nevroner har ikke utviklet aksoner ennå, noe som etterlater celler intakt under disseksjon og minimerer stress dermed vesentlig øker levedyktighet. I tillegg forsiktig disseksjon av ventral midthjernen, som beskrevet i kapittel 2 i denne protokoll, forbedrer overlevelsesevne ytterligere. Å øke antall Dekk per embryo, er en alternativ plating metode presentert i kapittel 4 i denne protokollen. Dette fører til et utbytte på opp til 10 dekkglass pr embryo i forhold til 4 Dekk henholdvanlige pletteringsforholdene og dermed redusere mengden av dyr per eksperiment.
Nevroner i kultur utstillings utvekst av axoner og dentrites, danner synaptiske forbindelser og avsløre tilstedeværelsen av nevronale og synaptiske markører gjør disse kulturene egnet for levende celle bildebehandling, immunocytokjemisk og elektrofysiologiske studier. Videre, bruk av nevronale kulturer letter genetiske og farmakologiske manipulasjon. Utvekst av neuritter fra dag 2 in vitro åpner for utviklingsstudier. Videre er langtidsoverlevelse av kulturer (opp til seks uker) gjør dem egnet for studium av langsom, progressiv degenerering av disse neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Dyrene ble opprettholdt og håndteres i samsvar med de institusjonelle retningslinjer og alle prosedyrer dyr ble godkjent av Imperial College Animal Welfare og livssyns Brødtekst (AWERB) og Home Office og Harvard University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), i samsvar med føderale og statlige forskrifter.
1. Reagens og utstyr Setup
- Tine, delmengde og lagre 1 mg / ml Laminin løsning ved -80 ºC. Oppløs 2 pl i 1 ml DMEM / F12, hvilket resulterer i et belegg konsentrasjon på 1-2 pg / cm2.
MERK: Thaw Laminin sakte på is og løses opp i kaldt DMEM / F12 og umiddelbart legge den til plater / Dekk. - Fortynn 75 ml 0,01% Poly-L-ornitin i 425 ml PBS og oppbevar ved 4 ºC.
MERK: holdbarheten av arbeidsløsningen er opptil en måned. - Oppløse 25% (vekt / volum) BSA i PBS, pH 7,4, og oppbevar ved 4 ºC i opptil en derear.
- Forbered 50% FBS (i HBSS) deaktivering media.
- Forbered komplett medium ved tilsetning av 50 U / ml penicillin og streptomycin, 1x N2 supplement, 5% (volum / volum) FBS, 0,36% D - (+) - glukose (vekt / volum), 0,25% BSA (vekt / vol) for å DMEM / F12 og oppbevar ved 4 ºC.
MERK: Holdbarheten er opp til 10 dager. - Dekk sted i kokende 70% (vol / vol) etanol i minst 30 minutter for å fjerne alle spor av fett og autoklav.
- Plasser Dekk i 24-brønners plater og legge 500 mL Poly-L-ornitin løsning til hver brønn. Inkuber 1 time under panseret vevskultur ved RT, og deretter, vaskes tre ganger med 500 mL vann. Tilsett 500 ul laminin løsning til hver plate og inkuberes O / N i den fuktede vevskultur-inkubator ved 37 ° C.
MERK: Selv om ingen vasker er nødvendig etter laminin behandling, vaske poly-L-ornitinsalter mindre enn tre ganger resulterer i døden av cellene 24 timer etter dyrking. - Polere tips av glass pipetter enn naturgass eller lommelykt fhalt.
MERK: Etter dette trinnet diameteren på spissen bør være omtrent halvparten av normal størrelse. - Skjær caps av 1,5 ml mikrosentrifugerør, ved hjelp av en Autoclaved saks og autoklav.
2. Disseksjon av Embryonic Ventral midthjernen
- Narcotize timed-gravide (E12.5) demninger av CO 2 innånding og deretter avlive ved halshugging.
- Spray magen med 70% etanol og gjøre en abdominal snitt til livmor sacs er alle utsatt. Bruk pinsett kutte vaginal feste og fjerne livmoren. Plasser livmor i iskaldt HBSS, i en 100 mm petriskål.
- Fjern embryoer fra livmor og fostervann sac, ved hjelp av tang (figur 1C). Plasser embryoene i frisk iskald HBSS.
MERK: rektangelet i figur 1D indikerer plasseringen av embryonale ventral midthjernen. - Plassere embryoene i henhold til en disseksjon mikroskop (10x forstørrelse) og dissekere mesencefaliskbue ved å kutte hjernen på eidet og mesencefalisk-diencephalic grenseområdet, ved hjelp av bioscissor og tang (figur 1E, se Figur 1A for linjer med innsnitt).
- Etter å ha tatt ut hele midthjernen, lage et kutt i mediodorsal midthjernen (figur 1F).
- Fjern hjernehinnene, ved hjelp av to tang (figur 1E).
MERK: KRITISK STEP: Dette trinnet er viktig for optimal nevronale avkastning og overlevelse. Siden dyrkingsbetingelsene er optimale for hjerneceller, de fleste av cellene fra det omgivende vev dør etter plating og apoptotisk signalet fra dette vevet kan skade integriteten av kulturene. - Flate midthjernen vev på petriskål å observere butterfly form og kuttet omtrent halvparten av hver vinge, ved hjelp av en sterilisert barberbladet (Figur 1 H, I).
MERK: Figur 1J viser den isolerte ventral midthjernen. - Overførestykke ventral midthjernen i iskald HBSS i en 15 ml konisk rør og fortsett med neste embryo.
MERK: Trinnene 2,1-2,8 bør ikke ta mer enn en time. Holde embryoene utover denne tidsrammen på is reduserer celle levedyktighet betydelig.
3. Dissosiasjon av Ventral midthjernen Cells
- Overfør bitene av ventral midthjernen under en laminær hette. Ta av HBSS og legge en ml forvarmes (37 ºC) 0,05% trypsin-EDTA inn i konisk tube (volumer nok for opp til 12 stykker av ventral midthjernen). Inkuber vev ved 37 ° C i 5-10 min.
- Fjern trypsin-EDTA under panseret og tilsett 1 ml de-aktivering medium (serum vil deaktivere trypsin) til vevet.
- Fjern deaktivermediet og vaskes vevet i 1 ml fullstendig medium to ganger.
MERK: Unngå å fjerne alt mediet fra røret og pipettering av vevet, for å hindre forkaster de dissosierte cellene. - Legg 1 ml komplett medium og Triturat vevet med en brann-polert glass pipette. Unngå dannelse av bobler og fortsette triturering til enkeltcellesuspensjon blir oppnådd.
MERK: Vanligvis 8-10 passerer gjennom begrenset tips er nødvendig for fullstendig dissosiasjon. - Sentrifuger cellene ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur og fjern mediet.
- Re-suspendere pellet i en ml komplett medium ved sakte pipettere opp og ned for opp til fire ganger.
4. plating Ventral midthjernen Cells
- Bland 10 ul av cellesuspensjonen med 90 ul Trypan blå løsning, og teller antallet celler med et hemocytometer.
MERK: Livskraftig av cellene kan også sjekkes på dette stadiet. - Plasser steriliserte mikrosentrifugerør caps i 100 mm petriskåler og overføre Poly-L-ornitin / Laminin belagt Dekk, ved hjelp av tang, en om gangen på toppen av caps.
MERK: Ikke vask Dekkglass og unngå å tørke laminin, siden dette kan føre til uneven kulturer og reduksjon av overlevelsesevnen til cellene. - Juster volumet til 1500 celler per 1 mL ved tilsetning av komplett medium og tilsett 100 ul (totalt 150 000 celler) av cellesuspensjonen på toppen av hver dekkglass (volumet er optimal for å dekke overflaten av dekkglasset uten søl). Lukk petriskåler og inkuber dem i 1 time i en fuktet vevskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO2).
MERK: viktig skritt: Dette trinnet er nødvendig for å øke feste og levedyktighet av cellene og for å øke antallet av dekkglass pr embryo. Alternativt kan cellene bli overført direkte inn i brønnene (som inneholder dekkglass), men antall celler som økes til 350.000 per brønn (i stedet for 150 000). Med andre ord, ved hjelp av denne metoden, kan 8-10 Dekk bli kjøpt opp, mens direkte overføring gir ca 3-4 Dekk grunn av cellene, som fester til platene (ved siden av eller under dekkglass). Gjennomsnittlig viability av kulturer, ved hjelp av denne metoden var rundt 90%.
5. Kultur Vekst og vedlikehold
- Etter 1 time med inkubering, nøye overføre dekk inkludert medium i 24-brønners plater inneholdende 400 ul forvarmet (37 ° C) fullstendig medium (totalt volum: 500 ul). Inkuber cellene O / N ved 37 ° C.
- Innen 24 timer etter inkubering av brønnene, tilsett 500 pl komplett medium i hver brønn.
MERK: De første timene er den mest kritiske fasen for overlevelse av dopaminerge nevroner og antall overlevende celler endrer seg ikke vesentlig utover dette punktet. - Ikke legg til ekstra media til kulturer i de to første ukene eller til mediet blir gul. Hvis dyrking for mer enn to uker eller mellom Fargen endres til gul, utveksling halvparten av media (500 mikroliter) med ferske komplett forvarmes media (vanligvis annenhver uke).
MERK: dopaminerge nevroner innenforkulturer ville overleve i mer enn seks uker under disse forholdene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunhistokjemi mot tyrosinhydroksylase (TH) viser at mellom 0,5-1% av cellene i kultur er dopaminerge. Neuronal spring vises innen 2 timer etter utplating, og ved den første dagen, aksoner og dendritter kan skjelnes (figur 2), ved hjelp av tyrosinhydroksylase (TH) og mikrotubuli-assosiert protein 2 (Map2) antistoffer (figur 3). Nevronene overleve i mer enn seks uker, og viser omfattende utvekst. Neuron-glia-forholdet i kulturene er direkte relatert til konsentrasjonen av serum i mediet, som vist tidligere. Mens eliminere FBS fra kulturer kan gi relativt rene nevrale kulturer, har vi og andre fant at tillegg av serum øker overlevelses av dopaminerge nevroner i kultur ni.
Figur 1. Fremgangsmåte for isolering avembryonale ventral midthjernen. Den skjematisk oversikt over E12.5 mus hjernen, midthjernen grenser (stiplede linjer), og det omtrentlige posisjon i regionen av interesse, ventral midthjernen, innenfor den røde firkanten (A) og verktøy for disseksjon av ventral midthjernen , en bioscissor, foreceps, og en bladholderen (B) blir vist. Embryoene blir tatt ut fra amnion ved brudd det (C). Regionen av interesse, ventral midthjernen, er vist av rektangelet (D). Hjernen er isolert ved å kutte på eidet (til venstre for avkappede) og midthjernen-brain grense (høyre; E). Den mediodorsal del av midthjernen er kuttet (F), og den er avflatet, for å ligne en sommerfugl form (G, H). Deretter blir dissosiert fra hjernehinnene (H) og ventral midthjernen (rektangel) isoleres fra den dorsale delen ved å kutte av halvparten av vingene, ved hjelp av et skjæreblad
Figur 2. Representative lysfelt bilder av ventral midthjernen kulturer. Bildene ble tatt på DIV1 (til venstre), DIV2 (i midten), og DIV15 (til høyre). Målestokk:. 50 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Langsiktig overlevelse, utvekst av prosesser og synaptogenesis i to ukers old ventral midthjernen kulturer. midthjernen dopaminerge nevroner, identifisert av tyrosinhydroksylase antistoff vokse omfattende axoner og dendritter, identifisert av Map2 antistoff, i ventral midthjernen kulturer to uker etter dissosiasjon fra E12.5 embryoer. Dendritter kan være preget av overlapping av Th og Map2-positive prosesser, hvor bare Th-positive fibre representerer aksoner. Antistoffer ble anvendt ved en fortynning på 1: 200. Målestokk:. 20 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dopaminerge nevroner i midthjernen er den viktigste kilden til dopamin i sentralnervesystemet. De er delt inn i tre grupper, substantia nigra pars comp (SNpc), ventral tegmentale området (VTA) og retrorubral felt (RRF) 10, 11. Nevroner i SNpc og VTA gi opphav til store dopaminerge trasé, mesocortical, mesolimbiske og Nigro-striatale, involvert i funksjoner som for eksempel kontroll av følelser, motivasjon og motor atferd. Avgangen av nevroner i SNpc og funksjonell forstyrrelse av nigrostriatale systemet er hoved patologisk karakteristisk for den nest mest fremtredende nevrodegenerativ forstyrrelse, Parkinsons sykdom (PD) 12,13. Dagens terapeutiske tilnærminger adresse symptomer på sykdommen og ikke stoppe eller forsinke degenerasjon og årsakene til den langsomme, progressive celle tap er fortsatt ukjent 14-16. Derfor er utvikling av in vivo og in vitro metoder for studiet av developmental, biokjemiske og fysiologiske egenskaper ved denne nerve befolkningen er avgjørende for å forstå etiologi av PD og til utvikling av nye terapeutiske tilnærminger.
Her beskriver vi en optimalisert fremgangsmåte for disseksjon, dissosiasjon og dyrking av primære neuroner fra embryonisk mus og rotte-ventral midthjernen, noe som resulterer i langtids in vitro overlevelse av dopaminerge neuroner fra denne region, slik at undersøkelse av de prosesser som differensiering, aksonal utvekst og synapse formasjon. Flere fordeler med denne protokollen omfatter økt antall Dekk per embryo, uavhengighet fra vekstfaktorer og lengden av in vitro overlevelse, maksimerer utvikling av nevroner 4. Denne metoden kan utfylle in vivo studier i slik at for å forstå mekanismene bak normale fysiologiske funksjoner av midthjernen dopaminerge nevroner samt progressiv degenerasjon av denne nervecellenal befolkningen i cytotoksiske og genetiske modeller av Parkinsons sykdom.
En av de viktigste ulempene med denne protokollen er mangelen på skillet mellom SNpc og VTA dopaminerge nevroner. Dette problemet eksisterer fordi ved dyrkning (E12.5 i mus eller rotter E14.5) terminal differensiering av nerveceller og deres regional er ikke fullført og mens bruk av eldre embryoer er mulig, i betydelig grad reduserer det overlevelse nevroner grunn aksotomi. Skille de to populasjoner ville være mulig ved immunocytokjemi, ved hjelp av antistoffer mot spesifikke markører for hver befolkningen som Girk2 (for å identifisere SNpc nevroner) og Calbindin (for å identifisere VTA nevroner) 17.
Den optimaliserte plating beskrevet i punkt 4 reduserer mengden av befruktede egg per eksperiment med mer enn 50%, og derfor bidrar til å redusere bruk av dyr i forskning. De mest kritiske trinn for overlevelsesevnen til kultenasjon tiden mellom euthanization av dammer og fullstendig disseksjon av de embryoniske midbrains (trinn 2.1 til 2.8), samt fullstendig fjerning av hjernehinnene (trinn 2.6, figur 1 H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
