Introduction
A perda de neurónios dopaminérgicos da substância nigra pars compacta conduz aos sintomas motores cardinal de doença de Parkinson (PD), a segunda perturbação neurodegenerativa mais prevalente. A causa básica da morte dessa população neuronal mesencephalic não é conhecido. Para estudar os mecanismos bioquímicos responsáveis pelo desenvolvimento e propriedades moduladoras neurofisiológicos e sobrevivência de neurónios MESDA, várias culturas de células e estudos em modelos animais têm sido utilizados. As linhas celulares imortalizadas, incluindo a linha celular de rato dopaminérgica 1RB 3 AN 27 (N27), o dopaminérgico linha celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, a linha celular híbrida ratinho dopaminérgicos do mesencéfalo e MN9D humano LUHMES células foram utilizadas para estudos bioquímicos e mecanísticos limitados 1 -5. Para o estudo da perda específica de neurónios MESDA, vários neurotoxina baseada em modelos genéticos e foram desenvolvidos 6-8. Culturas do mesencéfalo ventral primárias, Fornecer uma ferramenta indispensável para o estudo das propriedades neuronais e sinápticos dos neurônios dopaminérgicos e os caminhos envolvidos na patogênese desta doença comum.
Aqui apresenta-se um protocolo detalhado para o isolamento de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo, que contém modificações resultando em maior capacidade de sobrevivência e o aumento de rendimento de lamelas por embrião. O uso de pré-madura mesencéfalo E12.5 rato (E14.5 no rato) aumenta a capacidade de sobrevivência. Nesta idade neurônios não desenvolveram axônios ainda, o que deixa as células intactas durante a dissecção e minimiza o estresse aumentando assim significativamente a viabilidade. Além disso, dissecção cuidadosa do mesencéfalo ventral, conforme descrito no capítulo 2 do presente protocolo, aumenta ainda mais a capacidade de sobrevivência. Para aumentar o número de lamelas por embrião, um método de plaqueamento alternativa é apresentada na seção 4 deste protocolo. Isto conduz a um rendimento de até 10 lamelas por embrião em comparação com 4 lamelas sobcondições de chapeamento padrão reduzindo assim a quantidade de animais por experimentação.
Neurônios em cultura apresentam crescimento dos axônios e dendritos, formam conexões sinápticas e revelar a presença de marcadores neuronais e sinápticos fazendo essas culturas adequado para imagens de células vivas, imunocitoquímica e estudos eletrofisiológicos. Além disso, a utilização de culturas neuronais facilita a manipulação genética e farmacológica. Crescimento de neurites de dia 2 in vitro permite estudos de desenvolvimento. Além disso, a sobrevivência a longo prazo de culturas (até seis semanas) torna-os adequados para o estudo do processo de degeneração lenta e progressiva destes neurónios.
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Protocol
NOTA: Os animais foram mantidos e tratados em conformidade com as diretrizes institucionais e de todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Bem-Estar Animal da Faculdade Imperial e Corpo Revisão Ética (AWERB) e do Office Home and Harvard University Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC), em conformidade com os regulamentos federais e estaduais.
1. Reagente e configuração de equipamento
- Thaw, alíquota e armazenar 1 mg / ml solução Laminin a -80 ºC. Dissolve-se 2 ul de 1 ml de DMEM / F12, resultando em uma concentração de revestimento de 1-2 ug / cm 2.
NOTA: Thaw Laminin lentamente no gelo e dissolver em frio DMEM / F12 e imediatamente adicioná-lo às placas / lamelas. - Diluir 75 ml de 0,01% poli-L-ornitina em 425 ml PBS e armazenar a 4 ºC.
NOTA: A vida útil da solução de trabalho é de até um mês. - Dissolve-se 25% (p / v) de BSA em PBS, pH 7,4, e armazenar a 4 ° C durante até uma YEar.
- Preparar 50% de FBS (em HBSS) meios de desactivação.
- Prepare meio completo por adição de 50 U / ml de penicilina e estreptomicina, 1x suplemento N2, 5% (vol / vol) de FBS, 0,36% de D - (+) - Glucose (peso / vol), BSA a 0,25% (p / vol) de DMEM / F12 e armazenar a 4 ºC.
NOTA: O prazo de validade é de até 10 dias. - Coloque as lamelas em ebulição 70% (vol / vol) etanol durante pelo menos 30 minutos para remover quaisquer vestígios de gordura e autoclave.
- Coloque as lamelas em placas de 24 poços e adicionar uma solução de 500 ul de poli-L-ornitina a cada poço. Incubar 1 h, sob o capuz de cultura de tecidos à temperatura ambiente e, em seguida, lavar 3 vezes com 500 ul de água. Adicionar solução de laminina de 500 uL a cada placa e incubar S / N na incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ºC.
NOTA: Enquanto não há lavagens são necessárias após o tratamento laminina, lavando os poli-L-ornitina menos de três vezes resulta em morte das células 24 h após a cultura. - Polonês as pontas de pipetas de vidro sobre o gás natural ou tocha fcoxo.
NOTA: Após este passo, o diâmetro da ponta deve ser de cerca de metade do seu tamanho normal. - Corte as tampas de 1,5 ml microtubos, usando uma tesoura esterilizada e autoclave.
2. Dissecção da Embryonic Ventral Midbrain
- Narcotizar cronometrado-grávidas (E12.5) barragens por inalação de CO 2 e, em seguida, a eutanásia por deslocamento cervical.
- Pulverizar o abdómen com etanol a 70% e fazer uma incisão abdominal até que os sacos uterinas são todos expostos. Utilizando uma pinça cortar o acessório vaginal e retirada do útero. Inserir o útero em gelo-HBSS frio, numa placa de Petri de 100 milímetros.
- Remover os embriões do útero e do saco amniótico, usando uma pinça (Figura 1C). Coloque em embriões frescos HBSS gelada.
NOTA: O retângulo na Figura 1D indica a localização do mesencéfalo ventral embrionário. - Coloque os embriões sob um microscópio de dissecção (10x) e dissecar o mesencephalicarco cortando o cérebro no istmo e região de fronteira mesencephalic-diencephalic, usando o bioscissor e fórceps (Figura 1E, por favor, consulte a Figura 1A para linhas de incisão).
- Depois de tirar todo o mesencéfalo, faça um corte no mesencéfalo mediodorsal (Figura 1F).
- Remover meninges, usando duas pinças (Figura 1H).
NOTA: passo crítico: Este passo é essencial para o rendimento ideal neuronal e sobrevivência. Uma vez que as condições são óptimas para a cultura de células cerebrais, a maioria das células do tecido circundante morrer após o plaqueamento e o sinal apoptótico deste tecido pode prejudicar a integridade das culturas. - Nivelar o tecido do mesencéfalo na placa de Petri para observar a forma de borboleta e cortar aproximadamente metade de cada asa, utilizando uma lâmina de barbear esterilizada (Figura 1H, I).
NOTA: Figura 1J retrata o mesencéfalo ventral isolado. - Transferir opedaço de mesencéfalo ventral em gelada HBSS em um tubo cônico de 15 ml e prosseguir com a próxima embrião.
NOTA: As etapas 2,1-2,8 não deve demorar mais do que 1 hora. Mantendo-se os embriões para além deste período de tempo no gelo diminui significativamente a viabilidade celular.
3. A dissociação de mesencéfalo ventral Cells
- Transferem-se as peças de mesencéfalo ventral sob uma câmara de fluxo laminar. Remover o HBSS e adicionar 1 ml de pré-aquecido (37 ºC) de 0,05% de tripsina-EDTA para o tubo cónico (volumes suficientes para até 12 partes de mesencéfalo ventral). Incubar o tecido a 37 ºC durante 5-10 min.
- Remover tripsina-EDTA sob o capô e adicionar 1 ml de meio de desactivação (o soro vai desactivar tripsina) para o tecido.
- Remover o meio de desactivação e lavar o tecido em 1 ml de meio completo duas vezes.
NOTA: Evitar a remoção de todo o meio a partir do tubo e a pipetagem do tecido, para impedir a descartar as células dissociadas. - Adicionar completa médio e trit 1mlurato o tecido com um vidro polido pipeta-fogo. Evitar a formação de bolhas e continuar triturando até a suspensão de célula única é alcançado.
NOTA: Normalmente, 8-10 passa através da ponta restrito são necessários para a dissociação completa. - Centrifuga-se as células a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o meio.
- Re-suspender o sedimento em 1 ml de meio completo por lentamente pipetando para cima e para baixo por até quatro vezes.
4. chapeamento Ventral mesencéfalo Cells
- Misturar 10 ul da suspensão celular com 90 ul solução de azul de tripano e contagem do número de células com um hemocitómetro.
NOTA: A viabilidade das células também pode ser verificado, nesta fase. - Coloque tampas de tubos de microcentrífuga esterilizado em pratos de Petri 100 milímetros e transferir as lamelas / laminina revestidas com poli-L-ornitina, usando uma pinça, um de cada vez em cima das tampas.
NOTA: Não lave as lamelas e evitar a secagem da laminina, uma vez que isso pode causar uneven culturas e diminuição da capacidade de sobrevivência das células. - Ajustar o volume a 1.500 células por 1 ml por adição de meio completo e adicione 100 mL (total de 150.000 células) da suspensão de células no topo de cada lamela (o volume é óptima para cobrir a superfície da lamela sem entornar). Feche os pratos de Petri e incubar durante 1 hora numa incubadora de cultura de tecidos humidificada (37 ° C, 5% CO 2).
NOTA: PASSO CRÍTICO: Este passo é necessário para aumentar a fixação e a viabilidade das células e para aumentar o número de lamelas por embrião. Alternativamente, as células podem ser transferidos directamente para dentro dos poços contendo lamelas (), mas o número de células poderá ser aumentada para 350.000 por poço (em vez de 150.000). Em outras palavras, usando esse método, 8-10 lamelas podem ser adquiridos, enquanto a transferência direta produz cerca de 3-4 lamelas por causa das células, que ligam às placas (ao lado ou embaixo das lamelas). A viabili médiaty das culturas, utilizando este método era de cerca de 90%.
5. Crescimento e Manutenção de Cultura
- Após 1 hora de incubação, transferir cuidadosamente as lamelas incluindo a forma em placas de 24 poços, contendo 400 ul de pré-aquecido (a 37 ° C) de meio completo (volume total: 500 mL). Incubar as células O / N a 37 ºC.
- Dentro de 24 horas após a incubação dos poços, adiciona cuidadosamente 500 ul de meio completo para cada poço.
NOTA: As primeiras horas é a fase mais crítica para a sobrevivência dos neurônios dopaminérgicos eo número de células sobreviventes não muda significativamente para além deste ponto. - Não adicione o meio adicional para as culturas durante as duas primeiras semanas ou até que o meio torna-se amarelo. Se a cultura por mais de duas semanas ou alterações de cor média para amarelo, troca de metade dos meios de comunicação (500 mL), com frescos completos mídia pré-aquecido (normalmente a cada duas semanas).
NOTA: neurónios dopaminérgicos no interior daculturas iria sobreviver por mais de 6 semanas sob estas condições.
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Representative Results
A imuno-histoquímica contra a tirosina hidroxilase (TH) mostra que entre 0,5-1% de células em cultura são dopaminérgica. Projecções neuronais aparecer dentro de 2 horas após o plaqueamento e por o primeiro dia, axónios e dendritos são distinguíveis (Figura 2), utilizando-se para tirosina hidroxilase (TH) e Proteína 2 (Map2) anticorpos associada a microtúbulos (Figura 3). Os neurônios sobreviver por mais de seis semanas e mostrar grande conseqüência. A proporção neurónio-glia nas culturas está directamente relacionada com a concentração de soro no meio, como mostrado anteriormente. Embora a eliminação de FBS a partir das culturas podem produzir culturas neuronais relativamente puros, nós e outros descobriram que a adição de soro aumenta a sobrevivência de neurónios dopaminérgicos em cultura 9.
Figura 1. Processo para o isolamento demesencéfalo ventral embrionário. A vista esquemática de E12.5 de cérebro de ratinho, as fronteiras do mesencéfalo (linhas tracejadas) e a posição aproximada da região de interesse, do mesencéfalo ventral, no interior do rectângulo vermelho (A) e as ferramentas de dissecação do mesencéfalo ventral , um bioscissor, foreceps, e um suporte de lâmina (B) são mostrados. Os embriões são retirados do saco amniótico pela ruptura lo (C). A região de interesse, do mesencéfalo ventral, é mostrada pelo rectângulo (D). Midbrain é isolado pelo corte no istmo (à esquerda da peça cortada) eo limite mesencéfalo-forebrain (direita; E). A parte mediodorsal do mesencéfalo é cortada (F) e que é achatada, à semelhança de uma forma de borboleta (G, H). Em seguida, as meninges são dissociados de cérebro (H) e mesencéfalo ventral (rectângulo) é isolado a partir da parte dorsal cortando metade das asas, usando uma lâmina de barbear
Figura 2. Imagens brightfield representativos de culturas do mesencéfalo ventral. As imagens foram tiradas em div1 (à esquerda), DIV2 (centro), e DIV15 (à direita). Barra de escala:. 50 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A sobrevivência a longo prazo, conseqüência de processos e synaptogenesis em duas semanas old ventrais culturas do mesencéfalo. neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo, identificados por anticorpo tirosina hidroxilase crescer axônios e dendritos extensas, identificados por anticorpo Map2, nas culturas do mesencéfalo ventral de duas semanas após a dissociação a partir de embriões E12.5. Dendritos podem ser distinguidos pela sobreposição de Th e processos Map2-positivos, onde apenas Th-positivo fibras representam axônios. Os anticorpos foram utilizados a uma diluição de 1: 200. Barra de escala:. 20 um por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neurónios dopaminérgicos no mesencéfalo são a principal fonte de dopamina no sistema nervoso central. Eles são divididos em três grupos, substância negra compacta (SNPC), área tegmental ventral (VTA) eo campo retrorubral (RRF) 10, 11. Os neurônios no SNPC e VTA dar origem a grandes vias dopaminérgicas, mesocorticais, mesolímbica e Nigro-estriato, envolvidos em funções, como controle de emoção, motivação e comportamento motor. A decadência dos neurônios no SNPC e perturbação funcional do sistema nigrostriatal é a principal característica patológica da segunda doença neurodegenerativa mais proeminente, a doença de Parkinson (DP) 12,13. Abordagens terapêuticas actuais tratar os sintomas da doença e não parar ou retardar a degeneração e as causas de a, perda progressiva lenta celular são ainda desconhecidos 14-16. Portanto, o desenvolvimento de in vivo e in vitro para técnicas de estudo do Developmental, bioquímicos e características fisiológicas dessa população neuronal é imprescindível para a compreensão da etiologia da PD e para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.
Aqui, descrevemos um método optimizado para a dissecção, dissociação e cultura de neurónios primários de rato embrionário e mesencéfalo ventral de rato, o que resulta no longo prazo na sobrevivência in vitro dos neurónios dopaminérgicos a partir desta região, permitindo estudo dos processos, tais como a diferenciação, axonal excrescência e formação de sinapses. Várias vantagens deste protocolo incluem o aumento do número de lamelas por embrião, a independência de factores de crescimento e o comprimento de sobrevivência in vitro, maximizar o desenvolvimento de neurónios 4. Este método pode complementar os estudos in vivo em permitindo a compreensão dos mecanismos subjacentes às funções fisiológicas normais dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo, bem como a degeneração progressiva deste neurôniopopulação ai em modelos genéticos e citotóxicos da doença de Parkinson.
Uma das principais desvantagens deste protocolo é a falta de distinção entre SNPC e VTA neurônios dopaminérgicos. Este problema existe porque, no momento da cultura (E12.5 E14.5 em ratinhos ou em ratos) diferenciação terminal dos neurónios e sua regionalização não é completo e ao mesmo tempo a utilização de embriões mais velhos é possível, que reduz significativamente a sobrevivência do neurônios devido a axotomia. Distinguir as duas populações seria possível, por imunocitoquímica, usando anticorpos contra marcadores específicos para cada população como Girk2 (para identificar neurónios SNPC) e Calbindina (para identificar neurónios VTA) 17.
O chapeamento otimizado descrito na seção 4 diminui a quantidade de embriões por experiência por mais de 50% e, portanto, contribui para a redução do uso de animais em pesquisa. Os passos mais críticos para a sobrevivência do cultomentos são o tempo entre a eutanásia dos açudes e esvaziamento completo dos embrionárias cérebro intermediário (passo 2,1-2,8), bem como a remoção completa das meninges (passo 2.6, Figura 1H).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
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