Protocol
REMARQUE: Tous les protocoles d'expérimentation ont été approuvés par le Comité d'éthique de l'expérimentation animale et français et validés par le "Service de Protection et Santé Animales, Environnement" avec le numéro A-75-2065. La taille des échantillons sont choisies pour assurer la reproductibilité des expériences, et selon l'3R éthique de régulation de animal.
1. Préparation de la souris
- Anesthésie
- Pour courte période de formation d'image (moins de 1 h), anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale de 200 ul d'une solution saline contenant de la kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg).
- En variante, pour une longue période de formation d'image (jusqu'à 4 heures), anesthésier les souris avec une inhalation d'isoflurane 2,5% vaporisé dans un mélange 70/30 de O 2 / N 2 O, à travers un masque adapté.
- NOTE: cette façon prévoit l'inconscience plus stable et évite injection intrapéritonéale série de médicaments. Une fois que la souris est anesthésiée, vérifier l'inconscience par la stimulation de la garniture de pied avec des pinces.
- Coloration vasculaire / coloration supplémentaire
- Pour la coloration vasculaire: injecter par voie intraveineuse dans la veine caudale, 200 ul de rhodamine-dextrane (2 MDA, 10 mg / ml dans un tampon salin).
- Pour la coloration des neutrophiles: 2 ug d'injecter Ly6G-PE (clone 1A8) dans 100 ul de solution saline par voie intraveineuse dans la veine caudale.
- Immobilisation
- Pour l'immobilisation, utiliser un support stéréotaxique sur mesure adaptée à la loupe et l'inhalateur de gaz anesthésique.
NOTE: Le titulaire stéréotaxique est un support métallique avec deux supports de plaques de métal, l'un étant fixe et l'autre amovibles et adaptables, pour resserrer la tête de l'animal. - Installez la tête de la souris entre les plaques de retenue pour assurer l'isolation des mouvements respiratoires. Serrer les oreilles entre les plaques de retenue et de la tête pour étirer le sk. Vérifiez la stabilité et le bien-être de respiration de l'animal.
- Pour l'immobilisation, utiliser un support stéréotaxique sur mesure adaptée à la loupe et l'inhalateur de gaz anesthésique.
- Retirer le cuir chevelu
- Soigneusement utiliser l'éthanol à 70% pour mouiller les cheveux du cuir chevelu avec un applicateur stérile, évitant tout contact avec les yeux.
- Couper la peau avec des ciseaux et des pinces stériles pour supprimer complètement le cuir chevelu de l'arrière de l'os pariétal à l'os frontal. Tenir à l'écart jusqu'à 3 mm d'yeux et les oreilles pour éviter un saignement important. Retirer le tissu conjonctif lâche couvrant le crâne (périoste). Laver les cheveux avec chaude restante serviette en papier imbibé PBS.
- système d'immersion mis en place
- Collez un anneau de 18 mm de diamètre avec de la colle chirurgicale en caoutchouc directement sur le crâne à l'aide d'une aiguille de petit calibre de contrôler la distribution. Coller la totalité de la périphérie de l'anneau en caoutchouc pour empêcher la fuite (30 ul devraient être suffisants).
- Nettoyez le crâne sous l'anneau une dernière fois avec PBS-serviette imbibée de papier, puis ajouter 37 ° C PBS pour une immersion complète de lacrâne. Ajouter une goutte de solution de NaCl à 0,9% ou un onguent ophtalmique spécifique sur chaque oeil de la souris afin d'éviter la sécheresse oculaire. Faites glisser le support stéréotaxique titre de l'objectif.
- Environ positionner le terrain en utilisant l'oculaire du microscope par transmission directe.
2. Deux photons Acquisition d'imagerie
- Utilisation d'un microscope multiphoton couplé à un laser Ti: saphir à cristaux, qui fournit des impulsions de lumière 140fs NIR, accordables sélectivement de 680 à 1080 nm, et un modulateur acousto-optique pour le contrôle de la puissance du laser. Utilisez une configuration comprenant trois détecteurs externes non balayée (NDD) (qui permettent l'enregistrement simultané des trois canaux fluorescentes) avec une combinaison de deux miroirs dichroïques (565 nm et 690 nm), 565/610 et 500/550 filtres passe-bande, et un 485 filtre passe courte, avec un apochromat plan × 20 (NA = 1) L'objectif de l'immersion en eau.
- Réglez la chambre de chauffage pour permettre une bonne homéothermie des anessouris thetized.,
REMARQUE: Température pourrait être réglé une heure avant la session d'imagerie pour une meilleure stabilité. Dans notre cas, 32 ° C a été choisi pour obtenir optimale la température du corps de la souris anesthésié (36-37 ° C) et est maintenue jusqu'à 4 h. Cette température peut être adaptée au système utilisé (sonde numérique peut être utilisé pour vérifier ce point). En outre, la chambre de chauffage utilisé est sombre / noir et couvre une partie du système (objectifs et la plaque motorisé) pour éviter la contamination de la lumière extérieure. - Allumez le système
- Allumez le laser Ti: saphir, puis l'ensemble du système de microscope. Lancez le logiciel d'acquisition. Définissez la plage de longueur d'onde laser à 870 nm. Sélectionnez NDD appropriée pour l'enregistrement.
NOTE: Dans notre cas, génération de second harmonique (SHG) 19 et la protéine fluorescente cyan (ECFP) sont détectées par le DDN après le court filtre 485 passe. ECFP est également détectée par le DDN après le filtre passe-bande 500/550 et la rhodamine-dextrane est détectée par til DDN après le filtre passe-bande 565/610.
- Allumez le laser Ti: saphir, puis l'ensemble du système de microscope. Lancez le logiciel d'acquisition. Définissez la plage de longueur d'onde laser à 870 nm. Sélectionnez NDD appropriée pour l'enregistrement.
- Réglez les paramètres d'acquisition
- Utilisez "l'acquisition en direct" commande d'imagerie du logiciel et en utilisant la commande directionnelle de microscope, la mise au point sur une zone avec un signal ECFP et la rhodamine. Régler la puissance du laser au minimum afin d'obtenir le meilleur rapport signal sur bruit avec un minimum de photo-dommages.
NOTE: Le réglage de la puissance utilisée varie en fonction de la profondeur de la région d'intérêt. Généralement, les paramètres AOM sont installés autour de 20%, ce qui représente une puissance de laser au-delà de l'objectif d'environ 15 mW. Il est préférable d'augmenter la puissance de gain sur les PMT pour chaque NDD pour réduire la photo-blanchiment et photo-dommages. Paramètres d'acquisition typiques sont la numérisation simple avec un temps de séjour de pixels de 1,58 ps, et une résolution de 512 x 512 pixels avec un grossissement de 1,5.
- Utilisez "l'acquisition en direct" commande d'imagerie du logiciel et en utilisant la commande directionnelle de microscope, la mise au point sur une zone avec un signal ECFP et la rhodamine. Régler la puissance du laser au minimum afin d'obtenir le meilleur rapport signal sur bruit avec un minimum de photo-dommages.
- Sélectionnez régions d'intérêt
- Une fois les paramètres d'enregistrement sont réglés, utilisez de nouveau la commande d'acquisition «en direct»,et étudier le tissu de choisir un (x, y, z) champ désiré à surveiller en temps réel.
NOTE: En règle générale, nous avons choisi un champ comprenant à la fois vasculaire et zones parenchymateuses. - Créer le domaine avec la commande de logiciel "de position".
REMARQUE: Cette commande mémorise x, y, z de différents champs éloignés. - Sélectionner et enregistrer les champs d'intérêt supplémentaires (jusqu'à 3) en utilisant la même procédure.
- Définir un z-stack 3D avec la commande de logiciel "z-pile" sur la première position mémorisée selon le volume requis avec un grossissement choisi. Mémorisez profond première position, puis la position la plus élevée. Normaliser la puissance du laser avec la profondeur.
NOTE: Pour les multiples imagerie de champ concomitante, nous acquérons cinq tranches séparées par 3 um z-étapes pour chaque champ d'acquérir un volume de 12 um d'épaisseur. Ces paramètres peuvent être adaptés au type de cellules étudiées.
- Une fois les paramètres d'enregistrement sont réglés, utilisez de nouveau la commande d'acquisition «en direct»,et étudier le tissu de choisir un (x, y, z) champ désiré à surveiller en temps réel.
- acquisition de lancement
- Sélectionnez le220; séries chronologiques "de commande du logiciel et choisissez la durée de l'intervalle de temps et le nombre de cycles. Commencez imagerie time-lapse selon le laps de temps et la durée nécessaire en sélectionnant le "Début de l'expérience" commande logicielle.
NOTE: Dans notre cas, nous acquérons un volume chaque 30 secondes pendant 60 cycles représentant 30 min en temps réel. Plus petit laps de temps peut être effectuée à chemin de roulement cellulaire rapide dans le vaisseau sanguin. Dans ce cas, plus mince z-stack et pas plus de deux domaines différents peuvent être enregistrés en même temps. - Un suivi régulier de la mise en place.
- Toujours surveiller l'animal pour se assurer qu'il est inconscient.
REMARQUE: Secouer des moustaches ou des jambes de l'animal sont des indicateurs de reprise. En cas de respiration de l'animal est saccadé, la quantité de l'isoflurane peut être légèrement réduite. Dérive de tissus forte lors de l'acquisition est un indicateur de la renaissance de la souris. - Assurer l'objectif est bien immergé. Renouveler 37 ° C PBS between deux acquisitions (30 min).
REMARQUE: disparition progressive des signaux lors de l'acquisition est l'indicateur de fuite PBS.
- Toujours surveiller l'animal pour se assurer qu'il est inconscient.
- Sélectionnez le220; séries chronologiques "de commande du logiciel et choisissez la durée de l'intervalle de temps et le nombre de cycles. Commencez imagerie time-lapse selon le laps de temps et la durée nécessaire en sélectionnant le "Début de l'expérience" commande logicielle.
- Fin de la procédure
- Une fois les vidéos enregistrées sont nécessaires, euthanasier l'animal par dislocation cervicale rapidement devant la réanimation.
REMARQUE: la cicatrisation conduit à la formation d'une croûte en 24-48 h, ce qui limite la possibilité d'effectuer une imagerie longitudinal.
- Une fois les vidéos enregistrées sont nécessaires, euthanasier l'animal par dislocation cervicale rapidement devant la réanimation.
3. Analyse des données
- correction de la dérive
- Utilisez un logiciel Imaris Bitplane pour le suivi automatique 3D.
- Ouvrez l'image 3D sur Imaris séquence. Sélectionnez "spot" de commande, et de générer suivi manuel (clic de souris + shift) pour tous les points de temps pour un minimum de 4 points d'ancrage différents, si possible répartis de manière homogène dans le domaine.
- Appliquer la correction de la dérive en utilisant la commande "de dérive correcte" dans l'onglet "édition de piste".
- Vérifiez til la qualité de la correction en x, y et z en particulier dans flottement pour éviter artefact.
NOTE: Si la correction ne est pas satisfaisante, essayez d'autres points d'ancrage ou d'exclure la vidéo à partir de l'analyse.
- suivi cellulaire
- Utilisez "ajouter de nouveaux spots" commande et sélectionnez "taches de suivre dans le temps" de réglage de l'algorithme. Aller à l'étape suivante.
- Appliquer la procédure de suivi automatique de la cellule, soit sur l'ensemble du canal d'intérêt en utilisant "canal source" commande. Set objets (ie, cellules) de diamètre à 10 um. Aller à l'étape suivante.
NOTE: Le choix dépendra de la distinction entre les objets et la spécificité du signal mesuré. En bref, l'alignement automatique sur l'ensemble du canal ne est possible que si le signal détecté est spécifique à l'objet d'intérêt. Parce que les deux SHG ECFP et sont détectées par le DDN après le filtre 485 passe-court, suivi sera plus précise et plus efficace en utilisant le signal enregistré par l'ECFP NDD après le 500/550 filtres passe-bande. Groupées ou des objets emballés denses nécessiteront sélection manuelle des objets individuels similaires à l'étape 3.1.2. - Sélectionnez le type de filtre "de qualité", définir le seuil d'exclure le suivi d'objets non spécifiques. Aller à l'étape suivante.
- Choisissez "brownien algorithme Motion" avec des paramètres précis de "Max la distance» et «taille de Gap" entre deux points. Valider la génération de piste.
- Une fois les pistes sont calculés automatiquement, sélectionnez "la durée de la piste" type de filtre, fixer le seuil d'éliminer pistes plus courtes que 120 secondes (soit 4 points de temps).
- Obligatoire: Après un suivi automatique, vérifier la qualité des pistes.
- Déroulez la barre de temps pour vérifier que les objets suivent les chemins de piste. Sinon, utilisez les options de correction de point de trace disponibles dans l'onglet "modifier": Supprimer les pistes fausses ou inappropriées avec commande "Supprimer" (supprimer ne importe quelle piste point individuellement en utilisant la commande "Déconnecter"). Si le chemin de la piste est discontinue, ajouter les données manquantes (clic de souris + décalage), sélectionner tous les points sur une piste donnée, et d'utiliser "connecter" commande dans l'onglet "édition de piste".
- paramètres de quantification
- Sélectionnez l'onglet "statistique" dans la commande «Préférences», choisissez les paramètres dynamiques d'intérêt dans la liste. Sélectionnez "Exporter toutes les statistiques de déposer" commandement et enregistrez le fichier excel généré.
NOTE: Plusieurs paramètres dynamiques sont obtenues directement à partir du logiciel tels que longueurs de piste, vitesse instantanée, vitesse moyenne, et de suivre la rectitude. coefficient de motilité 6, 20 peut être déterminé mais ne est pas directement disponible par le logiciel. - Pour chaque cellule, calculer la moyenne des déplacements pour chaque période de temps (At) (pour un film laps de temps de 30 sec, AT aura 30, 60, 90 secondes, etc).Tracer la moyenne du déplacement quadratique en fonction de l'intervalle de temps. Obtenir coefficient de motilité en calculant la pente de la partie linéaire de la courbe.
- Sélectionnez l'onglet "statistique" dans la commande «Préférences», choisissez les paramètres dynamiques d'intérêt dans la liste. Sélectionnez "Exporter toutes les statistiques de déposer" commandement et enregistrez le fichier excel généré.
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Representative Results
La structure du crâne de souris offre une bonne occasion pour étudier la physiologie de la moelle osseuse par imagerie intravitale. L'os étant mince autour de la zone avant-pariétale, il est possible d'avoir accès à des niches médullaires sans abrasion de l'os. La figure 1 représente un champ 2D large du crâne d'une souris transgénique MacBlue. La matrice d'os est composée principalement de collagène de type I facilement détectable par 19 SHG. L'injection de rhodamine-dextrane colore le réseau vasculaire de la moelle osseuse et permet l'identification de créneaux parenchyme de moelle d'os entre la matrice osseuse et les navires 14. ECFP cellules sont répartis dans les deux compartiments de la moelle osseuse, mais sont absents de la matrice osseuse. Les monocytes sont classées manuellement en fonction de leur emplacement dans le tissu. Monocytes vasculaire est définie lorsque la cellule entière est dans le système vasculaire, sans tenir compte de la taille du navire. Seules les grandes veinules de collecte sont exclues de notre unenalyse. Parenchyme monocytes est défini lorsque la cellule se trouve entre le système vasculaire et la matrice osseuse.
Imagerie time-lapse de la région d'intérêt (vidéo supplémentaire 1 et 2) permet de calculer la trajectoire d'un cellule individuelle dans le temps pour soit vasculaire (figure 2A) ou parenchyme (figure 2B) monocytes. La longueur de piste indique que l'affichage des monocytes parenchymateuses déplacement réduite par rapport aux monocytes vasculaires. L'analyse du déplacement au cours du temps compare la vitesse moyenne des monocytes dans les deux compartiments (figure 2C). Le déplacement quadratique moyenne en fonction du temps est une mesure de l'étendue spatiale du mouvement aléatoire. coefficient de motilité est déterminée par la pente de la partie linéaire de la courbe et fournit une meilleure idée du déplacement de la cellule (voir la section de discussion). Le coefficient de la motilité des monocytes vasculaires (MC = 71μm² / s) est supérieure à la coefficie de motilitént de monocytes parenchymateuses (MC = 4.4μm² / s).
La résolution temporelle de l'acquisition doit être adaptée à la vitesse moyenne de cellule. Monocytes vasculaires roulants peuvent faire important déplacement dans un court délai. Pour un suivi plus précis de la cellule, ce qui réduit l'intervalle de temps d'acquisition est préférable. La figure 3 montre une illustration de suivi de monocytes avec deux résolutions différentes de temps. A 30 secondes de temps d'intervalle réduit la précision ainsi que la longueur des voies (ligne en tirets en vert) par rapport à 10 sec d'intervalle de temps.
Enfin, la figure 4 illustre la possibilité d'analyser un autre sous-ensemble de cellules de façon concomitante aux monocytes. Ly6G est un marqueur spécifique des neutrophiles matures de souris. L'injection d'anti-Ly6G combiné avec un fluorochrome (dans ce cas-Phyco erythrin) 5 min avant la séquence d'imagerie neutrophiles tache directement in vivo. Cette approche fournit une faible supplémentairesension d'analyse et de la possibilité de comparer le comportement des différents sous-ensembles de cellules. Cette approche pourrait être utilisée pour définir des sous-ensembles dans les compartiments de monocytes.
Figure 1. large domaine de l'organisation de la moelle osseuse du crâne. In vivo d'image de microscopie à balayage laser à deux photons du crâne l'état d'équilibre de la moelle osseuse de souris MacBlue. Vasculaire (en rouge) est souillé par la queue injection vain 2MDa Rhodamin-Dextran 5 min avant la séance d'imagerie. L'os est visualisé par génération de second harmonique (bleu). ECFP + monocytes (Cyan) sont situés dans des niches du parenchyme (zones sombres entre vasculaire et osseuse) et dans les vaisseaux. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. suivi en temps réel de la cellule. Chemins de piste représentatives long moment de monocytes dans (A) le système vasculaire et (B) le parenchyme. Tracks (ligne verte) pour chaque cellule sont générés automatiquement par le logiciel. Taches rouges représentent le centre de masse de cellules à chenilles. (C) comparaison de la vitesse moyenne entre vasculaires et parenchymateuses monocytes. Analyse statistique de Mann-Whitney a été effectuée, *** représente p <0,001. (D) Moyenne déplacement carré (msd) en fonction du temps est représenté vasculaires et parenchymateuses monocytes. Courbe asymptotique indique le déplacement contraint des cellules au cours du temps, tandis que la courbe linéaire indique marche aléatoire dans un environnement non contraint. coefficient de motilité indique l'étendue de déplacement de la cellule et est déterminé par la pente de la c Urve calculé par régression linéaire. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Résolution Intervalle de temps dans l'étude des monocytes de roulement. Des séquences d'images représentatives montrent que l'augmentation résolution temporelle améliore la précision de la trajectoire de la cellule de roulement. (Up) séquence d'images avec des intervalles de temps de 10 sec. (Vers le bas) séquence d'images avec des intervalles de temps de 30 sec. La qualité de la voie de piste est améliorée et le risque de considérer deux cellules différentes pour le même ou l'inverse est réduite. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Dans vivo co-localisation des neutrophiles et des monocytes médullaires. Cette figure illustre la possibilité de détecter un autre sous-ensemble de cellules in vivo en association avec les monocytes, par injection d'anticorps monoclonal spécifique combiné à un fluorochrome. 2 pg d'anticorps Ly6G-PE a été injecté par voie intraveineuse 5 minutes avant l'imagerie de la moelle osseuse du crâne de la MacBlue souris. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
1. Comportement migratoire vidéo supplémentaire des monocytes du parenchyme. In vivo 3D-imagerie de l'activité migratoire état d'équilibre des monocytes dans le parenchyme de la moelle osseuse du crâne de souris MacBlue. Le signal + ECFP est en cyan. Voies de migration pour chaque cellule (point rouge) apparaissent en vert.
Comportement migratoire supplémentaire vidéo 2. des monocytes vasculaires. En vivo 3D-imagerie de l'activité migratoire état d'équilibre des monocytes dans le système vasculaire de la moelle osseuse du crâne de souris MacBlue. Le signal + ECFP est en cyan. (2M Da) rhodamine-dextrane a été injecté avant la session de formation d'image pour distinguer le système vasculaire de la moelle osseuse (rouge). Voies de migration pour chaque cellule (point rouge) apparaissent en vert.
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Discussion
Les points critiques de la méthode in vivo d'imagerie sont en assurer la stabilité de la mise au point afin de maximiser la durée de formation d'image et de réduire au minimum le risque de contamination bactérienne et l'inflammation, ce qui pourrait avoir un impact de la dynamique des cellules inflammatoires. L'imagerie du crâne moelle osseuse suite à ces objectifs comme la chirurgie effectuée pour obtenir l'accès à la moelle osseuse est minime. L'utilisation de matériel stérile et antiseptiques est essentiel de limiter le risque d'infection qui pourrait induire une perturbation de l'homéostasie cellulaire.
Le développement du titulaire stéréotaxique peut être difficile et nécessite la personnalisation spécifique pour chaque système (distance entre la scène et l'objectif motorisé du microscope, l'utilisation de l'inhalateur de gaz pour l'anesthésie). Il est important d'obtenir la tête de la souris aussi horizontale que possible pour un accès plus large surface d'imagerie. Une fois que l'animal est positionnée, il est probable que plusieurs minutes peuvent être required d'obtenir une bonne stabilité du plan focal. Par conséquent, il est recommandé de vérifier la dérive de tissu avant de lancer l'enregistrement d'acquisition. Parce que ce processus avec la sélection des régions d'intérêt peut durer un certain temps, il est également recommandé de vérifier régulièrement que l'animal est inconscient si kétamine / xylazine ont été utilisés, et de vérifier le bon immersion de l'objectif que les fuites et l'évaporation peut se produire.
Le bon positionnement de l'anneau en caoutchouc sur le crâne représente une autre étape cruciale dans le processus. Colle cyanoacrylate donne de bons résultats en termes de stabilité et d'étanchéité, mais il faut pour éviter une charge excessive de colle, qui pourrait couvrir le crâne et le bloc l'accès à la région d'intérêt du tissu. L'avantage de l'immersion directe du crâne sans une lamelle de verre est d'obtenir l'accès aux régions les plus profondes de l'os. En outre, depuis le crâne ne est pas une surface plane, ce ne sera pas limiter la zone d'imagerie à la consurface tact entre le crâne et la lamelle, permettant à un large domaine de l'imagerie, tel qu'il apparaît dans la figure 1.
Pour toutes les technologies d'imagerie, le choix entre la vitesse d'acquisition et de la qualité de la résolution est un compromis. Ainsi, le nombre et la qualité des images par unité de temps sont limités, et le choix dépend de la question scientifique adressée. Typiquement, les monocytes vasculaires sont très roulant cellules, tandis que les monocytes parenchyme sont mobiles lente ou sessiles. Un suivi précis des cellules de roulement nécessite de plus haute résolution d'acquisition de temps, comme le montre la figure 2. Le taux élevé d'imagerie pour les cellules sessiles est x inutiles et secondaires, y, z résolution peut être préférable pour analyser l'activité propulsion de dendrites par exemple. Cellules rapides exigeraient le volume épais pour obtenir un suivi plus de leur déplacement en z.
Le déplacement quadratique moyenne en fonction du temps ne est pas fourni par la Imaris logiciel. Le principle de cette représentation basée sur le fait que, pour un objet se déplaçant de façon balistique sans constriction rencontre ou structurelle, la distance parcourue, il serait proportionnelle à l'intervalle de temps (figure 2D). Ainsi linéarité de la pente indique une marche aléatoire dans un environnement non contraint. En revanche, la forme asymptotique de la courbe refléterait un déplacement limité dans le temps de la population de cellules. Le deuxième avantage de ce calcul est que la vitesse est parfois surestimée par le déplacement artéfactuelle du centre de masse. Ceci est particulièrement important pour les cellules lente mobiles à l'activité propulsion. Ainsi, le calcul du coefficient de motilité par la pente de la courbe calculée par régression linéaire indique un déplacement réel du temps de cellover 21.
Ly6G coloration in vivo illustre la possibilité d'ajouter un nouveau paramètre d'analyse pendant le processus d'imagerie (Figure 3 et al sous presse). Bien que plus de 98% de neutrophiles vasculaires sont correctement étiquetés, la coloration des neutrophiles de la moelle osseuse est moins efficace, et l'intensité de fluorescence moyenne est fortement réduite, ce qui suggère un accès réduit de l'anticorps vers le parenchyme de moelle osseuse (données non présentées). Rhodamine dextrane, les points quantiques, ou d'autres colorants spécifiques de cellules apoptotiques ou nécrotiques tels que Dapi, l'iodure de propidium, Sytox 22 ou rapporteur fluorescent pour les fonctions cellulaires telles que la production d'espèces réactives de l'oxygène 23 peuvent être ajoutés par voie intraveineuse par la veine de la queue lors de l'imagerie processus et offrent une bonne occasion de quantifier les propriétés fonctionnelles telles que la mort cellulaire, la phagocytose et de piéger extracellulaire neutrophiles. Mazo et al 12 joliment utilisé deux colorants différents vasculairesavec de bas poids moléculaire et de haute afin de mieux parenchyme contraste et le système vasculaire. Le choix du colorant fluorescent est essentielle pour permettre l'acquisition simultanée des différents rapporteurs fluorescents. En effet, la longueur d'onde d'excitation sera choisi en conséquence pour obtenir le meilleur compromis entre tous les colorants fluorescents utilisés.
Le protocole utilisé ici permet d'analyser in vivo l'activité biologique d'un compartiment de cellule, l'étude de ce qui a été difficile jusqu'à présent. L'analyse histologique du tissu de moelle osseuse nécessite habituellement une longue préparation de décalcification osseuse pour permettre section mince, et il ne fournit une vue statique du tissu. La vue dynamique met en évidence le taux de change de cellule entre le parenchyme et les sinusoïdes de la moelle osseuse. Ce processus rapide est une étape cruciale de déchiffrer afin d'avoir une meilleure compréhension du mécanisme de mobilisation des cellules sur le signal inflammatoire 5 ou préconditionnement chimiothérapie myeloaplasiveschéma 6. Nous avons signalé cas de intravasation cellulaire 6 mais ce processus est à peine détectable en raison de la faible fréquence à l'état stationnaire. Cependant, il est susceptible d'être améliorée sur la signalisation inflammatoire. Récepteurs de chimiokines telles que CCR2, CX3CR1 ou CXCR4 sont fortement impliqués dans le processus de intravasation, d'où l'utilisation d'invalidation génétique de ces récepteurs devrait fournir de nouvelles connaissances fondamentales dans les voies de la migration cellulaire
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Anne et Pierre Daron Louis Loyher d'assistance éditoriale, la Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) pour l'assistance avec le microscope à deux photons et le Fonds des animaux "CNA" et Camille Baudesson pour les souris assistance élevage. Les recherches menant aux présents résultats ont reçu un financement de septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7 / 2007-2013) sous convention de subvention n ° 304810 - RAID, et n ° 241440-EndoStem, de l'Inserm, de l'Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", de la" Ligue contre le cancer », de« Association pour la Recherche sur le Cancer »et de« Agence nationale de la recherche "Programme Emergence 2012 (ANR-EMMA-050). PH a été soutenue par la "Ligue contre le cancer».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
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