מדידות דיוק אבץ איזוטופי גבוהות יישומים לאיברי עכבר

Abstract

אנו מציגים הליך למדידה עם יחס איזוטופ אבץ דיוק גבוה באיברי עכבר. האבץ מורכב 5 איזוטופים יציבים ⁽⁶⁴ Zn, ⁶⁶ Zn, ⁶⁷ Zn, ⁶⁸ Zn ו ^-70 Zn) אשר מופרדים בין איברי עכבר באופן טבעי. אנחנו מראים תחילה כיצד לפזר את האיברים השונים כדי לשחרר את אטומי Zn; צעד זה מתממש על ידי תערובת של HNO ₃ ו- H ₂ O _2. לאחר מכן, אנו מטהרים את אטומי אבץ מכל הגורמים האחרים, בפרט מהפרעות isobaric (למשל, Ni), על ידי כרומטוגרפיה אניון-חליפין בHBr לדלל / HNO בינוני _3. שני שלבים הראשונים אלה מבוצעים במעבדה נקייה באמצעות כימיקלים טוהר גבוהים. לבסוף, יחסי איזוטופ נמדדים באמצעות רב-אספן ההמוני ספקטרומטר אינדוקטיבי מצמידים-פלזמה, ברזולוציה נמוכה. הדגימות מוזרקות באמצעות תא תרסיס וחלוקת איזוטופים הנגרמת על ידי ההמוני ספקטרומטר הוא correcטד על ידי השוואת היחס של הדגימות ליחס של סטנדרטי (טכניקה מדורגת סטנדרטית). הליך טיפוסי מלא זה מייצר יחס איזוטופ עם שחזור 50 עמודים לדקה (2 SD).

Introduction

המדידה של דיוק גבוה הרכב איזוטופ היציב (טוב יותר מ -100 עמודים לדקה / יחידת מסה אטומית) אבץ הייתה אפשרית רק לכ -15 שנים הודות לפיתוח של מסה-ספקטרומטרים פלזמה מקור רב-אספן ומאז בעיקר מיושמת בכדור הארץ ומדעים פלנטריים. היישומים בתחום הרפואי הם רומן ויש לו פוטנציאל חזק כסמנים ביולוגיים למחלות שמשנות את חילוף החומרים של אבץ (למשל, מחלת אלצהיימר). מאמר זה מדווח שיטה למדוד עם דיוק גבוה יחסי איזוטופ יציבים הטבעיים של אבץ באיברים שונים בעכבר. אותו יהיה ישים לדגימות אנושיות. השיטה מורכבת מהפירוק של האיברים, הטיהור הכימית של אבץ משאר האטומים, ולאחר מכן הניתוח של יחס איזוטופ במסה-ספקטרומטר.

האיכות של מדידות איזוטופים Zn תלויה באיכות של הטיהור הכימית (טוהר Zn, comp הריק הנמוךהנגר לסכום של Zn הווה במדגם, תשואה גבוהה כימית לנוהל) ועל השליטה בהטית אינסטרומנטלי. יש צורך בטוהר הגבוה של חלק Zn הסופי להסרת שני הפרעות isobaric והפרעות שאינן isobaric שיוצרות אפקט מטריקס. nuclides Isobaric ליצור הפרעות ישירות (לדוגמא, ⁶⁴ ניקל). הפרעות ללא isobaric ליצור אפקט "מטריקס" שנקרא ולשנות את הדיוק אנליטי של המדידות על ידי שינוי מצבו של היינון בהשוואה לסטנדרטי אבץ הטהור שהדגימות לעומת ^1. ריק (<10 ng) נמוך מצביע על כך שאין זיהום של הדגימות על ידי Zn החיצוני שהיית הטיה ההרכב האיזוטופי נמדד. כפי שניתן מופרדים איזוטופים Zn במהלך חילופי יונים כרומטוגרפיה ^2, האוסף של כל אטומי Zn מבטיח כי אין חלוקה איזוטופים מתרחשת, מה שמרמז כי ההליך הכימי צריך להיות תשואה מלאה. לבסוף, התיקון של חלוקה איזוטופים סייעה במהלך מדידת ספקטרומטר המסה נעשה באמצעות השיטה "מדורגת סטנדרטי".

מדידות מדויקות לכן, הקשיים העיקריים להשגה שולטים בזיהום החיצוני (כלומר, נמוכות ריק), הפקת טיהור כימית תשואה מלאה שהיא נקי מכל אטומים או מולקולות אחרים, ותיקון חלוקה איזוטופים סייעה במסה-ספקטרומטר. במאמר זה נתאר פרוטוקול האנליטיות שלנו להפריד בין Zn מאיברי העכבר, כמו גם מדידות ספקטרומטר המסה.

החילוץ נעשה באמצעות כמות נמוכה של חומצות מדוללים (HBr / HNO ₃ תקשורת) על מיקרו-טורים (0.5 μl 0.1 μl) של שרף אניון-חליפין. יש לה תשואה מלאה ויש לי מדידות שחזור חיצוני טוב יותר מאשר 50 עמודים לדקה על יחס Zn ⁶⁶ Zn / ^64. יתרון נוסף של ספידOD הוא שזה מאוד מהר. השיטה לכן מותאמת היטב למדעי רפואה, שבו יש צורך לנתח מספר גדול של דגימות בהשוואה למדעי כדור ארץ, שבו שיטות אנליטיות אלה פותחו.

Protocol

הערה: נהלים כרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטה של ​​פאריס דידרו.

1. הכנת חומרים

1. תת-רתיחה לזקק 1 ליטר של החומצות ₍₃ HNO, HBr) כדי לטהר אותם מטומאה.
2. נקה את הכוסות ומתאם קצה ב( ~ 100 מעלות צלזיוס) חמה מרוכז HNO ₃ אמבטיה חומצה לפחות יומיים.
3. שטוף את הטיפים פיפטה בN 3 HNO אמבטיה ₃ קרה במשך כמה ימים ולשטוף בנפרד שלוש פעמים במי דה מיונן.

הכנת 2. דוגמא

1. להרדים את העכברים בזריקת intraperitoneal של קטמין ו xylazine. להעריך הרדמה בשיטת צביטת הבוהן.
2. לאסוף את הדם על ידי לנקב לב בנוכחות של הפרין בצינורות 1.5 מיליליטר.
3. הפרד את הפלזמה מתאי דם על ידי צנטריפוגה (10 דקות, 1500 XG) ולהעביר את הפלזמה לפוליפרופילן גבקבוקוני ryogenic באמצעות טיפים פוליפרופילן.
4. הסר את הדם שנותר מאיברים על ידי חיתוך ורידי הכבד והזרקת DPBS דרך הלב. להעריך מותו של העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
5. לקצור את האיברים עם מכשירי נירוסטה סטרילי, לשחרר אותם מסביב שומן אם בכלל, וצמד-להקפיא אותם בצלוחיות קריוגני פוליפרופילן.

3. כימי טיהור

1. ראשית, לפזר את הדגימות בתערובת של ~ 1 מיליליטר של (30%) מרוכזים H ₂ O ₂ ו~ 1 מיליליטר של HNO המרוכז (~ 15 M) _3. האם כל הצעדים הללו בתוך מנדף.
   1. מניחים את כל האיבר של עניין לתוך כוס טפלון 15 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף H ₂ O ₂ / HNO ₃ לכוס ^5. שמור את הכוס פתוחה לכמה דקות על מנת למנוע כתמים בשל תגובת חמצון של החומר האורגני והשחרור של CO _2.
   2. לבסוף, לשים את הכוס על צלחת חמה בABOC ° 100 ut לכמה שעות או עד הפתרון הוא ברור לחלוטין.
2. פתח את הכוס ולייבש את הפתרון על צלחת חמה בכ -100 מעלות צלזיוס.
3. לאחר המדגם הוא יבש, להוסיף 1 מיליליטר של 1.5 N HBr לדגימות; לסגור את הכוס ולתת לו לפזר על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות.
4. בינתיים מכין את 500 העמודים μl.
   1. הוסף 500 μl של שרף רשת AG1X8 200-400 לעמודה ולשים אותו על מדף הטור עם כוס אשפה מתחתיו. לשטוף את השרף על ידי לסירוגין: 5 מיליליטר של 18.2 MΩ ⋅ מים סנטימטר, 5 מיליליטר של 0.5 N HNO _3, 5 מיליליטר של מים, 5 מיליליטר של 0.5 N HNO _3, ולאחר מכן 5 מיליליטר של מים. להתנות את השרף עם 5 מיליליטר של 1.5 N HBr.
5. הסר את הכוסות מהצלחת החמה ולשים אותם באמבטיה קולית לכ -30 דקות, ולאחר מכן לתת לכוסות להתקרר RT.
6. ברגע שהכוס היא מקוררת והשרף הוא שטף, לפתוח את הכוס. שים את מתאם הקצה לtהוא המזרק, להוסיף טיפ פיפטה; פיפטה 1 מיליליטר של מדגם ולטעון אותו על השרף (מאוד לאט כדי לא להתסיס את השרף).
7. לאחר שכל הנוזל עובר דרך הטור, להוסיף 5 מיליליטר של 1.5 N HBr.
8. ברגע 5 מיליליטר של 1.5 N HBr לעבור הטור, להחליף את כוס האשפה עם כוס 15 מיליליטר נקי.
9. הוסף 5 מיליליטר של 0.5 N HNO ₃ 2.5 מיליליטר בכל פעם. בשלב זה Zn הוא eluted מהשרף.
10. ברגע 5 מיליליטר של HNO ₃ עובר דרך הטור, להסיר את הכוס ומניח אותו על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס עד יבשה.
11. הסר את העמודה מבעל הטור; האשפה השרף (להשתמש שרף חדש עבור כל דגימה).
12. לאחר המדגם הוא יבש, לחזור על הפרוטוקול עם אותו הנפח של חומצות על עמודה קטנה יותר (100 μl) ולאחר מכן הנח אותו על צלחת חמה עד יבשה. המדגם מוכן כעת לספקטרומטר מסה.

4. ספקטרומטר מסת מדידה

1. לנתח compo איזוטופים Znsition בספקטרומטר פלזמה המונית בשילוב אספן-אינדוקטיבי רב (MC-ICP-MS).
   1. השתמש בפרמטרי המכונה מסוכמים בטבלה 1.
2. מקם את כוסות פאראדיי לאסוף במסה (m / z) של ⁶² Ni, ⁶³ Cu, Zn ^{64, 65} Cu, Zn ^{66, 67} ו ^-68 Zn Zn.
3. הכן תמיסה המכילה Zn 500 ppb 0.1 M HNO ₃ לניתוח איזוטופי.
4. נתח את פתרון 500 ppb של Zn באמצעות תא תרסיס בשילוב עם 100 μl / nebulizer טפלון דק '. עבור כל דגימה, למדוד 30 סריקות (בלוק 1 של 30 מחזורים) שבזמן האינטגרציה של כל סריקה הוא 8.389 שניות.
5. תקן את הרקע על ידי הפחתת עוצמות אפס על-שיא מפתרון ריק (M HNO הפתרון ₃ 0.1 שימוש מחדש לפזר את הדגימות).
6. בקרה והתערבות נכונה ⁶⁴ אפשריים Ni isobaric על ידי מדידת עוצמת שיא ניקל ^62.תניח ש/ ⁶² יחס ניקל ⁶⁴ Ni הוא טבעי (.2548), נכונים ערך זה מההטיה ההמונית אינסטרומנטלי, ולאחר מכן להסיר ⁶⁴ Ni במסה 64 כ:
   ⁶⁴ = ⁶⁴ Zn Zn _{האמיתי נמדד} - ⁶⁴ Ni = ⁶⁴ Zn _נמדד - ⁽⁶⁴ ניקל / ⁶² Ni) _הטבעי x ⁶² _נמדד ניקל.
7. לתקן את ההטיה ההמונית אינסטרומנטלי ידי bracketing כל אחת מהדגימות עם פתרון 500 ppb סטנדרטי של תקן JMC ליון Zn (או אחר סטנדרטית זמין כגון IRMM-3702). בצע מדורגת הסטנדרטי על ידי חלוקת יחס Zn ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ של המדגם בממוצע של יחס Zn ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ של שני הסטנדרטים נמדדו לפני ואחרי מדגם מינוס 1 ומוכפלים 1000 (ראה משוואה 1). דיוק חיצוני אופייני על תקן JMC ליון Zn הוא 0.05 permil / האמו (2 סטיית תקן, 2 SD).

Representative Results

ב 1.5 N HBr, המינים העיקריים האבץ (ZnBr3-) צורות מתחמים חזקים מאוד עם שרף אניון-החליפין, בעוד שרוב אלמנטים אחרים לא אינטראקציה עם השרף. האבץ הוא התאושש לאחר מכן על ידי שינוי הבינוני עד HNO המדולל _3, לשנות את התפצלות של Zn לZn ^{2 +} המשתחררת ^מ6,7 השרף.

יחסי איזוטופ באים לידי ביטוי בדרך כלל כחלקים לכל 1,000 סטיות ביחס לסטנדרטי:

עם x = 66 או 68. חומר ההתייחסות משמש הוא Zn "ליון" מרכז למוסיקת ירושלים הסטנדרטי 3-0,749 ¹ ליטר. הסטנדרטי "ליון" הוא החומר המשמש התייחסות הרחבה ביותר לנרמל את נתוני איזוטופ Zn. כל תוצאות איזוטופים דיווחו לכן יחסי. באמצעות התייחסות זו ההרכב האיזוטופי של F כדור הארץאו δ ⁶⁶ Zn הוא 0.28 ± 0.05 ^8. מאז סטנדרטי JMC-ליון הוא לא זמין בקלות, בהעדר תקן זה החלופי הוא להשתמש IRMM-3702 סטנדרטי כהתייחסות במהלך המדידות ולהמיר את התוצאות באמצעות התייחסות ⁹ כ: ⁶⁶ Zn _JMC-ליון = ⁶⁶ Zn _IRMM-3702 0.29. הריק הטיפוסי הוא <10ng.

תוצאות אופייניות המתקבלות בשיטה זו מיוצגות באיור 1, כעלילת שלוש-איזוטופ (δ ⁶⁸ Zn לעומת δ ⁶⁶ Zn) לאיברים שונים עכבר. תוצאות טבלה 2 ו -3 דו"ח של ניסויים משוכפלים של רוק יבשתי טיפוסי (בסגנון הוואי בזלת) ושל עכבר לתאי דם אדום.

איור 1. δ ⁶⁸ Zn לעומת δ ⁶⁶ Znלאיברים שונים עכבר. בר השגיאה האופייני הוא 0.07 permil לδ ⁶⁶ Zn ו0.15 לδ ⁶⁸ Zn מוצג באיור. נתונים מהתייחסות ^15.

הגדרות MC-ICP-MS	נפטון
כוח RF (W)	1,300
פוטנציאל ההאצה (V)	10,000
זרימת גז שיעורים
נוזל קירור Ar (ליטר / דקה)	18
עזר Ar (ליטר / דקה)	1
מדגם Ar (ליטר / דקה)	1-1.2
שיעור ספיגת פתרון (molution	100
פרמטרים ניתוח
מספר בלוקים	1
מספר מדידות לכל בלוק	30
זמן אינטגרציה (ים)	8.389
ריכוז אופייני Zn של דגימות וסטנדרטיות (ppb)	500
V / עמודים לדקה יעילות העברת טיפוסית	25

טבלת 1: הגדרות MC-ICP-MS למדידות איזוטופ Zn במכון דה מבנה גוף דו גלוב דה פריז.

דוגמאות	δ 66 Zn	2se	δ 68 Zn	2se	n
לשכפל 1	0.34	0.01	0.68	0.04	4
לשכפל 2	0.34	0.01	0.68	0.01	3
לשכפל 3	0.34	0.02	0.67	0.02	4
לשכפל 4	0.36	0.06	0.7	0.09	4
לשכפל 5	0.31	0.02	0.65	0.06	4
לשכפל 6	0.33	0.01	0.68	0.02	3
לשכפל 7	0.32	0.06	0.63	0.1	6
ממוצע	0.33	0.03	0.67	0.05	7
2SD	0.04		0.05
n = מספר המדידה החוזרת ידי MC-ICP-MS

טבלה 2: Zn הרכב האיזוטופי של K179-1R1-170.9 בזלת הוואי לשכפל כל אחד מייצגת טיהור כימית מלאה וממוצע של מספר מדידות המסה-ספקטרומטר עצמאיים.. נתונים מהתייחסות ^8.

מספר העכבר	δ 66 Zn	δ 68 Zn
11	0.82	1.6
12	0.79	1.55
13	0.84	1.65
14	0.87	1.72
ממוצע	0.83	1.63
2SD	0.07	0.15

טבלה 3: Zn הרכב האיזוטופי של עצמות של עכברים כל לשכפל מייצג טיהור כימית מלאה.. נתונים מהתייחסות ^15.

Discussion

שחזור של המדידות מוערך באמצעות ניתוחים משוכפלים של אותו הדגימות שבוצעו במהלך פגישות אנליטיות שונות. לדוגמא ^6, יש לנו לשכפל את אותו הסלע יבשתי 7 פעמים והשגנו את התוצאות שדווחו בטבלה 2.

כצפוי מהתאוריה של חלוקה איזוטופים ¹⁰ וכפי שנמדד בכל חומר מערכת שמש כל כך הרבה (למשל, מטאוריט ^11-13, צמחים ^3-5, משקעים עמוק-ים ^14, בעלי החיים ^15-17), את תוצאות מעקב המוניות החוק התלוי (ראה איור 1). δ ⁶⁸ Zn הוא פי שניים δ ⁶⁶ Zn (איור 1), כי ההבדל בין מסת ⁶⁸ Zn ו ^-64 Zn הוא פעמיים את ההבדל בין ⁶⁶ Zn ו ^-64 Zn. זה מראה כי המדידות שלנו הן ללא הפרעות isobaric (שהייתי נוסע נתונים מתוךשל הקו הישר) ושאיזוטופים האבץ הם מופרדים מאותה הבריכה איזוטופים.

לאיברי עכבר, הכמות המוגבלת של Zn בכל איבר מנעה אותנו מביצוע חזרות רבות של איבר יחיד ^15. עם זאת, אנחנו יכולים להעריך מגבלה גבוהה יותר לשחזור על ידי השוואת הנתונים לאותו הרקמה לעכברים שונים מאותו הגיל ואותו הזן (למשל לעצמות של עכברי 16 שבוע ישנים, לוח 3). שחזור זה הוא גדול יותר (0.04 לעומת 0.07 לδ ⁶⁶ Zn) ממה שהוערך מסלעי בזלת, וזה לא מפתיע כי זה כולל את ההטרוגניות של הדגימות, כמו גם את השונות בין איזוטופים השונים העכברים. לכן הערכת יתר של שחזור, ואנו מאמינים כי הדיוק בכל איבר בודד יהיה דומה למה שקבענו בסלעים בזלת. אנחנו יכולים להניח בבטחה שחזור טוב יותר מאשר 0.10 ל^8; ⁶⁶ Zn (2 SD) המייצג את דיוק 10 פעמים גדולות יותר מהשונות דיווחו בין איברים מסוימים (ראה איור 1 והתייחסות ^15).

מדידת הרכב איזוטופ היציב של Zn ישמש בעתיד ככלי אבחון למחלות שמשנות את איזון Zn של הגוף. לדוגמא, לוחות האבץ עשיר הקשורים למחלת אלצהיימר לשנות את הריכוז של אבץ בסרום ומאז המוח והסרום יש לי הרכב האיזוטופי ¹⁵ איזוטופים Zn שונים יכולים לשמש כדי לזהות שלב המוקדם של המחלה.

רוב השיטות חלופיות למדידת ההרכב האיזוטופי Zn על ידי MC-ICP-MS כרוכות טיהור כימית בתקשורת HCl המרוכזת על עמודים גדולים יותר מזה המשמש כאן ^1-4. יש השיטה שלנו מבוססים על מיקרו-טורים וחומצות מדוללים החסר נמוך ומייצרת נתונים שהם שתי פעמים מדויקות יותר (50 עמודים לדקה לעומת 100 עמודים לדקה 2 SD). בadditיון, השיטה שלנו הוא מהיר מאוד (בשל גודלו הקטן של העמודות והכמות הקטנה של חומצה בשימוש) והוא מתאים מאוד לנתח כמות גדולה של דגימות (לפי צורך בדרך כלל במחקרים קליניים). הפשטות של השיטה תהיה גם מתאימה לשימוש במערכת טיהור כימית אוטומטית שתאפשר המדידות של מספר גדול של דגימות.

מגבלה אחת של גישה זו היא כי ניתן לנתח דגימות בתפזורת רק גדולות (ההליך משתמש ~ 1 מיקרוגרם של Zn). הקטנת הגודל של הדגימות היא קריטית כאשר מדוברים בדגימות קליניות יקרות. שיטה זו מוגבלת גם למדידות בתפזורת, ואילו עבור יישומים מסוימים בניתוחים באתר עשוי להיות נחוץ. שיפור עתידי על הטכניקה צריך להיות ביחס לשיפור באתר מדידות איזוטופי על ידי שילוב של מערכת לייזר אבלציה עם המסה-ספקטרומטר הפלזמה (LA-MC-ICP-MS). זה יאפשר המדידות של דגימות מרחבית קטנות ללא עמ 'טיהור כימית rior (שנוטה לזהם את הדגימות). בנוסף, באתר מדידות תאפשר המדידה של ההרכב האיזוטופי Zn על רקמות חיות. למיטב ידיעתנו חלה רק ניסיון אחד כדי למדוד יחסי איזוטופ אבץ באמצעות טכניקה כזו ¹⁸ והשיטה עדיין לא מדויקת מספיק, לעומת זאת, מדידות של יחס איזוטופ דיוק גבוה על ידי LA-MC-ICP-MS נעשו לפה ¹⁹ ו- B ²⁰ וזיקוק של הטכניקה באמצעות לייזרים מודרניים עשוי להוביל לפריצת דרך משמעותית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter	Thermo-Fisher
Anion-exchange resin AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
Teflon beakers	Savillex	200-015-12
In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon