Abstract
我々は、マウスの臓器における高精度の亜鉛同位体比で測定するための手順を提示します。亜鉛は、マウスの臓器の間に自然に分画される5安定同位体（64 Znを、66のZn、67のZn、68 Znおよび70 Zn系）で構成されています。まず、Zn原子を解放するために、異なる臓器を溶解する方法を示しています。このステップは、HNO 3とH 2 O 2の混合物によって実現されます。それから、希のHBr / HNO 3媒体に陰イオン交換クロマトグラフィーによる同重体干渉（ 例えば 、Ni）の、より具体的には、他のすべての要素からの亜鉛原子を精製します。これらの最初の2つのステップは、高純度化学薬品を使用して、きれいな実験室で行われています。最後に、同位体比は、低解像度のマルチコレクタ誘導結合プラズマ質量分析計を用いて測定されます。サンプルはcorrecあるスプレーチャンバーと質量分析計により誘導される同位体分別を用いて注入されています標準（標準ブラケット技術）の比にサンプルの比率を比較することにより、テッド。この完全な典型的な手順は、50 ppmの（2 SD）再現性の同位体比を生成します。
Introduction
高精度（より良い100ppm以下/原子質量単位）の測定は、亜鉛安定同位体組成は約15年間、マルチコレクタプラズマソース質量分析計の開発のおかげで可能になった、それ以来、主に地球に適用されています惑星科学。医療分野への応用は、新規であり、亜鉛（ 例えば、アルツハイマー病）の代謝を変更する疾患のバイオマーカーとしての大きな可能性を持っています。本稿では、種々のマウス臓器で高精度に亜鉛の自然な安定同位体比を測定する方法を報告します。同じことが、ヒトサンプルに適用可能です。この方法は、臓器、原子の残りの部分からの亜鉛の化学的精製、その後、質量分析計での同位体比の分析の溶解で構成されています。
亜鉛同位体測定の質は、化学的精製（亜鉛の純度、低ブランクCOMPの品質に依存していますサンプル中のZnの存在量、手順の高い化学収率）にし、楽器のバイアスの制御にared。最終的な亜鉛画分の純度は、マトリックス効果を作成両方同重体干渉と非同重体干渉を除去するために必要とされます。同重体核種が直接干渉（ 例えば、64のNi）を作成します。非同重体干渉は、いわゆる「マトリックス」効果を生成し、サンプルが1と比較される純亜鉛の標準に比べてイオン化の条件を変更することにより、測定値の分析精度を変化させます。低ブランク（<10 ngの）そのバイアス測定同位体組成を、外付けのZnによる試料のコンタミネーションがないことを示しています。亜鉛同位体は、イオン交換クロマトグラフィーの間に2分画できるように、すべてのZn原子の集合は、化学的手順は、完全な収率を有していなければならないことを意味する、いかなる同位体分別が起こらないことを保証します。最後に、質量分析測定中の楽器の同位体分別の補正は、「標準ブラケット "メソッドを介して行われます。
そのため、正確な測定値を得るための主な困難は、他の原子または分子のクリーンで完全降伏化学的精製を製造、および質量分析計で楽器同位体分別の補正、外部汚染（ すなわち、低ブランク）を制御しています。本稿では、マウスの臓器と同様に質量分析の測定値からのZnを分離するために私たちの分析プロトコルを記述します。
抽出は、陰イオン交換樹脂のマイクロカラム（0.5μLおよび0.1μL）で希釈した酸（HBrを/ HNO 3メディア）の少量を使用して行われます。これは、完全な収率を有しており、測定値が66のZn / 64のZn比で50ppmのよりも優れた外部再現性を持っています。メタの別の利点ODが、それは非常に高速であるということです。この方法は、極めてよくつこれらの分析法が開発された地球科学に比べて多数のサンプルを分析する必要のある、医学に適合されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：動物を含む手順は、大学のパリディドロにおける施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。
材料の作製
- サブ沸騰不純物からそれらを精製するために酸（HNO 3、HBrを）の1 Lを蒸留します。
- きれいに熱い（〜100℃）でビーカーと先端アダプタは、少なくとも2日間HNO 3酸浴を濃縮しました。
- 数日間の冷3 N HNO 3浴中でピペットチップを洗浄し、脱イオン水で個別に3回すすいでください。
2.サンプル調製
- ケタミンとキシラジンの腹腔内注射によりマウスを麻酔。つま先のピンチ方式により麻酔を評価します。
- 1.5ミリリットルチューブ内のヘパリンの存在下での心臓穿刺により血液を収集します。
- 遠心分離（10分、1,500×gで）により血液細胞から血漿を分離し、ポリプロピレンcにプラズマを転送しますポリプロピレンのヒントを使用してryogenicバイアル。
- 肝静脈を切断し、心臓にDPBSを注入することにより器官から残りの血液を除去。頚椎脱臼によりマウスの死を評価します。
- 滅菌ステンレス鋼の機器との臓器を収穫、もしあれば脂肪周囲のそれらを解放し、スナップ凍結してポリプロピレンの低温バイアル中。
3.化学精製
- まず、濃（30％）〜1ミリリットルH 2 O 2、濃縮（15〜M）HNO 3の約1 mlと混合物中にサンプルを溶解します。ヒュームフード内のすべての手順を実行してください。
- 15ミリリットルのテフロンビーカーに関心のある器官全体を配置します。その後、ビーカー5にH 2 O 2 / HNO 3を追加。有機物の酸化反応およびCO 2の放出に起因する飛沫を避けるために、数分間開放ビーカーにしてください。
- 最後に、ABOのホットプレート上でビーカーを置きます時間のカップルのための、または溶液が完全に透明になるまで100℃でユタ。
- ビーカーを開き、約100℃のホットプレート上に溶液を乾燥。
- サンプルが乾燥すると、サンプルに1.5 NのHBrの1ミリリットルを追加します。ビーカーを閉じて、それが時間のカップルのため、100℃のホットプレート上で溶解させます。
- 一方、500μlのカラムを準備します。
- 列にAG1X8 200〜400メッシュの樹脂の500μlを添加して、その下のゴミ箱のビーカーでカラムラックの上に置きました。 5ミリリットル18.2のMΩ⋅センチ水、0.5 N 5mlのHNO 3、5mlの水、0.5 N 5mlのHNO 3、および水の後、5ミリリットルを：交互に樹脂を洗浄。 1.5 NのHBr 5mlで樹脂を調整。
- ホットプレートからビーカーを取り出して、約30分間超音波浴に入れ、その後、ビーカーを室温まで冷却させます。
- ビーカーを冷却し、樹脂を洗浄した後、ビーカーを開きます。 tに先端アダプタを入れて彼は、注射器、ピペットチップを追加します。サンプルの1ミリリットルをピペット（樹脂を攪拌させないために、非常にゆっくりと）樹脂上にロードします。
- すべての液体がカラムを通過した後、1.5 NのHBrの5ミリリットルを追加します。
- 1.5 NのHBr 5mlをカラムを通過すると、きれいな15ミリリットルビーカーでゴミのビーカーを交換してください。
- 一度に0.5 NのHNO 3 2.5ミリリットルの5ミリリットルを追加します。この段階で、Znが樹脂から溶出されます。
- HNO 3 5mlをカラムを通過したら、ビーカーを除去し、乾燥するまで、100℃のホットプレート上に置きます。
- カラムホルダーから列を削除します。樹脂をゴミ箱（各サンプルのための新しい樹脂を使用します）。
- サンプルが乾燥したら、小さい列に酸（100μl）を同容量のプロトコルを繰り返した後、乾燥するまで、ホットプレートの上に置きます。サンプルは、質量分析のための準備ができました。
4.質量分析測定
- 亜鉛同位体コンポを分析マルチコレクタ - 誘導結合プラズマ質量分析計（MC-ICP-MS）にジション。
- 表1にまとめた機械パラメータを使用してください。
- 62のNi、63銅、64亜鉛、銅65、66のZn、67 Znおよび68 Znを質量（M / Z）で収集するために、ファラデーカップを置きます。
- 同位体分析のために、0.1M HNO 3で500 ppbでのZnを含む溶液を調製します。
- 100μL/分テフロンネブライザーと組み合わせたスプレーチャンバを使用して、亜鉛の500 ppbの液を分析。各サンプルについて、各スキャンの積分時間は8.389秒である30のスキャン（30サイクルの1ブロック）を測定します。
- ブランク溶液（サンプルを再溶解するために使用される、0.1M HNO 3溶液）からのピークゼロ強度を差し引くことにより、バックグラウンドを修正してください。
- 62 Niのピークの強度を測定することによって制御し、正しい可能性64 Niの同重体干渉。64のNi / 62 Ni比が（0.2548）自然で、楽器のマスバイアスから、この値を修正し、などのマス64の64のNiを削除することを想定します。
64 Znの実 = 64 Znを測定 - 64のNi = 64のZnを測定 - （64のNi / 62 Ni）の自然のx 62 Niを測定しました 。 - JMCリヨンのZn標準の500 ppbの標準溶液（またはIRMM-3702のような別の利用可能な標準）での各サンプルをブラケットにより楽器マスバイアスを修正してください。 （ 式1を参照）は、2つの標準サンプルマイナス1前後で測定し、千を乗じの66のZn / 64のZn比の平均による試料の66のZn / 64 Znの比を割ることにより、標準のブラケットを実行します。 JMCリヨンのZn標準の一般的な外部精度は0.05パーミル/ AMU（2標準偏差、2 SD）です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1.5 NのHBrでは、主亜鉛種（ZnBr3-）陰イオン交換樹脂でフォーム非常に強い複合体は、他のほとんどの要素は、樹脂と相互作用しないながら。亜鉛は、その後、樹脂6,7から放出される2+ Znに亜鉛の分化を変化させる、希釈HNO 3に培地を変更することによって回収されます。
同位体比は、典型的には、標準に比べて千の偏差当たりの部として表現されています。
X = 66または68で使用される標準物質は、Zn「リヨン」標準JMC 3から0749 L 1です。 「リヨン」標準は、Zn同位体のデータを正規化するために最も広く使用される基準材料です。報告された全ての同位体の結果は、したがって、相対的です。この基準に地球Fの同位体組成を用いて、またはδ66 Znが0.28±0.05 8です。 66のZn JMC-リヨン = 66のZn：JMC-リヨン規格は、この規格の非存在下で、容易に入手できないので、代替は、測定中に参照として標準IRMM-3702を使用してのような基準9を使用して結果を変換することですIRMM-3702 0.29。典型的なブランクは、<10ngのです。
この方法で得られた典型的な結果は、異なるマウス臓器（δ66のZn対68のZnδ）は、3つの同位体プロットとして、 図1に示されている。典型的な地上の岩石の複製された実験の表2および3レポートの結果（ハワイ玄武岩）およびマウスの赤血球。
δ66のZn対図1δ68のZn異なるマウス臓器のための典型的なエラーバーは68 Znが図に示されているδ0.07δ66のZn用パーミルと0.15です。参照15からのデータ。
| MC-ICP-MSの設定 | ネプチューン |
| RF電力（W） | 1300 |
| 加速電位（V） | 10000 |
| ガス流量 | |
| アルゴンクーラント（リットル/分） | 18 |
| アルゴン補助（リットル/分） | 1 |
| アルゴンサンプル（リットル/分） | 1-1.2 |
| ソリューション摂取率（molution | 100 |
| 分析パラメータ | |
| ブロック数 | 1 |
| ブロックごとの測定回数 | 30 |
| 積分時間（秒） | 8.389 |
| サンプルおよび標準の典型的なZnの濃度（PPB） | 500 |
| 典型的な伝送効率V / PPM | 25 |
表1：研究所デ体格デュグローブド·パリでのZn同位体測定のためのMC-ICP-MSの設定。
| サンプル | δ66 のZn | 2SE | δ68 のZn | 2SE | n個のA |
| 1を複製します | 0.34 | 0.01 | 0.68 | 0.04 | 4 |
| 2を複製 | 0.34 | 0.01 | 0。68 | 0.01 | 3 |
| 3を複製 | 0.34 | 0.02 | 0.67 | 0.02 | 4 |
| 4を複製 | 0.36 | 0.06 | 0.7 | 0.09 | 4 |
| 5を複製 | 0.31 | 0.02 | 0.65 | 0.06 | 4 |
| 6を複製 | 0.33 | 0.01 | 0.68 | 0.02 | 3 |
| 7を複製 | 0.32 | 0.06 | 0.63 | 0.1 | 6 |
| 平均 | 0.33 | 0.03 | 0.67 | 0.05 | 7 |
| 2SD | 0.04 | 0.05 | |||
| MC-ICP-MSによる繰り返し測定のN =数 |
表2：ハワイ玄武岩K179-1R1-170.9の同位体組成をZnの各反復は、完全な化学的精製およびいくつかの独立した質量分析計の測定値の平均を表します。基準8からのデータ。
| マウス番号 | δ66 のZn | δ68 のZn |
| 11 | 0.82 | 1.6 |
| 12 | 0.79 | 1.55 |
| 13 | 0.84 | 1.65 |
| 14 | 0.87 | 1.72 |
| 平均 | 0.83 | 1.63 |
| 2SD | 0.07 | 0.15 |
表3：マウスの骨の同位体組成をZnの各反復は、完全な化学的精製を表します。参照15からのデータ。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
測定の再現性は、異なる分析セッション中に行うと同じサンプルの複製された分析によって評価されます。例6のために、私たちは同じ地上岩を7回繰り返しており、我々は表2に報告された結果を得ました。
（15〜17 例えば、隕石11-13、植物3-5、深海堆積物14、動物）、これまで任意の太陽系材料で測定同位体分別10の理論からとして期待されるように、結果は質量に従ってください依存法（ 図1参照）。 68 Znおよび64 Znの間の質量の差が66 Znおよび64 Znの間の差が2倍 であるため、δ68 Znが、約二倍66のZn（ 図1）δです。これは、我々の測定は、そのデータを追い出すことになる（同重体干渉の自由であることを示しています定額）と亜鉛同位体の同じ同位体プールから分画されます。
マウスの臓器については、各臓器中のZnの限られた量は、単一の臓器15の多くの反復を行うことから私たちを防止しています。しかし、（16週齢マウスの骨のために、例えば、表3）を 、同じ年齢、同じ系統の異なるマウスについて同じ組織のデータを比較することにより、再現性のための上限を推定することができます。この再現性は、試料の不均一性ならびに異なるマウスとの間の同位体変動が含まれているため、驚くべきことではない玄武岩から推定したものよりも大きい（δ66のZn 0.04対0.07）です。したがって、再現性の過大評価であり、我々は、個々の臓器の精度は、我々は玄武岩質岩の上決定していたものと同様であると考えています。私たちは、安全に^のための0.10よりも優れた再現性をとることができます8; 66のZn特定の臓器（ 図1、参照15参照）との間に報告された変動よりも10倍の精度を表す（2 SD）。
亜鉛の安定同位体組成を測定する体のZnのバランスを変更する疾患の診断ツールとして、将来的に使用されます。例えば、アルツハイマー病に関連したジンクリッチプラークは、血清中の亜鉛の濃度を変更して、脳および血清は、異なる同位体組成を有するので、15のZn同位体は、疾患の初期段階を検出するために使用することができます。
ほとんどの代替方法がここ1-4使用されるものよりも大きい列に濃HCl媒体中の化学物質の精製を伴うMC-ICP-MSによる亜鉛同位体組成を測定しました。マイクロカラムと希釈酸に基づいて私たちの方法は、低ブランクがあり、2倍以上の正確されたデータ（100 ppmの2 SD対50 ppm）を生成します。 ADDITでイオンは、我々の方法は（これは、列のサイズが小さく、使用する酸の少量の）非常に高速であり、非常によく（通常、臨床研究で必要とされるように）大量の試料を分析するために適しています。この方法の簡単さは、多数のサンプルの測定を可能にする自動化学浄化システムでの使用によく適しているであろう。
このアプローチの1つの制限は、（手順はZnを〜1μgのを使用しています）だけ大きなバルクサンプルは分析することができることです。貴重な臨床サンプルを扱う場合、サンプルの大きさを減らすことが重要です。 その場での分析において 、いくつかの用途のために必要とすることができるが、この方法は、バルク測定に限定されます。技術に関する今後の改善がプラズマ質量分析計（LA-MC-ICP-MS）を用いてレーザーアブレーションシステムを組み合わせることで、その場の同位体測定における改善との関係であるべきです。これは、pすることなく、空間的に少量の試料の測定を可能にするであろう（サンプルを汚染する傾向がある）rior化学精製。また、 現場での測定は、生体組織の亜鉛同位体組成の測定を可能にします。我々の知る限りでは存在だけそのような技術18を使用して、亜鉛同位体比を測定するための一つの試みとなって、メソッドがまだ十分に正確ではありません、しかし、LA-MC-ICP-MSによる高精度な同位体比の測定は、鉄のために行われています近代的なレーザーを用いた技術の19とB 20と精製が大躍進につながる可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
FMは、PNPグラント、研究所Universitaire·ド·フランスなどソルボンヌパリシテ（ANR-10-LABX-0023とANRでLabex UniverEarthプログラムを通じてchaireドール優秀IDEXソルボンヌパリシテ、INSUを通じてANRからの資金調達を認めます-11-IDEX-0005から02）。また、欧州共同体のH2020フレームワークプログラム/ ERC助成契約＃637503（プリスティン）の下で欧州研究評議会からの資金に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter | Thermo-Fisher | ||
| Anion-exchange resin AG1 X8 200-400 | Bio-Rad | 140-1443-MSDS | |
| Teflon beakers | Savillex | 200-015-12 | |
| In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon |
References
- Marechal, C. N., Telouk, P., Albarede, F. Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma-source mass spectrometry. Chemical Geology. 156 (1), 251-273 (1999).
- Marechal, C. N., Albarede, F. Ion-exchange fractionation of copper and zinc isotopes. Geochim. Cosmochim. Acta. 66 (9), 1499-1509 (2001).
- Weiss, D. J., Mason, T. F. D., Zhao, F. J., Kirk, G. J. D., Coles, B. J. Isotopic discrimination of zinc in higher plants. New Phytologist. 165 (3), 703-710 (2005).
- Jouvin, D., Louvat, P., N, M. F. C. Zinc isotopic fractionation: why organic matters. Environ Sci Technol. 43 (15), 5747-5754 (2009).
- Moynier, F., et al. Isotopic fractionation and transport mechanisms of Zn in plants. Chemical Geology. 267 (3-4), 125-130 (2009).
- Moynier, F., Herzog, G., Albarede, F. Isotopic composition of zinc, copper, and iron in lunar samples. Geochim. Cosmochim. Acta. 70 (24), 6103-6117 (2006).
- Moynier, F., et al. Isotopic fractionation of zinc in tektites. Earth Planet. Sci. Lett. 277 (3-4), 482-489 (2009).
- Chen, H., Savage, P., Teng, F. Z., Helz, R., Moynier, F. Zinc isotope fractionation during magmatic differentiation and the isotopic composition of the bulk Earth. Earth Planet. Sci. Lett. 369-370, 34-42 (2013).
- Moeller, K., et al. Calibration of the new certified materials ERM-AE633 and ERM-AE6447 for copper and IRMM 3702 for zinc isotope amount ratio determination. Geostd. Geoan. Res. 36 (2), 177-199 (2012).
- Bigeleisen, J., Mayer, M. Calculation of equilibrium constants for isotopic exchange reactions. J. Chem. Phys. 15, 261-267 (1947).
- Luck, J. M., Ben Othman, D., Albarede, F. Zn and Cu isotopic variations in chondrites and iron meteorites: Early solar nebula reservoirs and parent-body processes. Geochim. Cosmochim. Acta. 69 (22), 5351-5363 (2005).
- Moynier, F., Dauphas, N., Podosek, F. A Search for 70Zn Anomalies in Meteorites. Astrophys. J. 700 (2), L92-L95 (2009).
- Paniello, R., Day, J., Moynier, F. Zn isotope evidence for the origin of the Moon. Nature. 490 (7420), 376-380 (2012).
- Pichat, S., Douchet, C., Albarede, F. Zinc isotope variations in deep-sea carbonates from the eastern equatorial Pacific over the last 175 ka. Earth and Planetary Science Letters. 210 (1-2), 167-178 (2003).
- Moynier, F., Fujii, T., Shaw, A., Le Borgne, M. Heterogeneous of natural Zn isotopes in mice. Metallomics. 5 (6), 693-699 (2013).
- Balter, V., et al. Bodily variability of zinc natural isotope abundance in sheep. Rapid Com. Mass. Spec. 24, 605-612 (2010).
- Balter, V., et al. Contrasting Cu, Fe, and Zn isotopic patterns in organs and body fluids of mice and sheep, with emphasis on cellular fractionation. Metallomics. 5 (11), 1470-1482 (2010).
- Urgast, D. S., et al. Zinc isotope ratio imaging of rat brain thin sections from stable isotope tracer by LA-MC-ICP-MS. Metallomics. 4, 1057-1063 (2012).
- Marin-Carbonne, J., Rollion-Bard, C., Luais, B. In-situ measurements of iron isotopes by SIMS: MC-ICP-MS intercalibration and application to a magnetite crystal from the Gunflint chert. Chem. Geol. 285 (1-4), 50-61 (2011).
- Fietzke, J., et al. Boron isotope ratio determination in carbonates via LA-MC-ICP-MS using soda-lime glass standards as reference material. J. Anal. Atom. Spec. 25, 1953-1957 (2010).
