Abstract
Vi presenterer en prosedyre for å måle med høy presisjon sink isotopratene i muse organer. Sink er sammensatt av 5 stabile isotoper (64 Zn, Zn 66, 67, 68 Zn og Zn-70 Zn) som er naturlig fraksjonert mellom museorganer. Vi viser først hvordan å oppløse de forskjellige organer for å frigjøre Zn-atomer; Dette trinnet er realisert ved en blanding av HNO 3 og H 2 O 2. Vi deretter rense sinkatomene fra alle de andre elementer, særlig fra isobariske forstyrrelser (f.eks, Ni), ved anionbytterkromatografi i et fortynnet HBr / HNO 3 medium. Disse første to trinnene utføres i et laboratorium ved hjelp av ren høy renhet kjemikalier. Til slutt blir de isotopforhold målt ved hjelp av en multi-kollektor induktivt koblet plasma-masse-spektrometer, med lav oppløsning. Prøvene ble injisert ved hjelp av en sprøytekammeret og isotopisk fraksjonering indusert av masse-spektrometer er corrected ved å sammenligne forholdet mellom prøvene til forholdet mellom en standard (standard eksponeringer teknikk). Denne full typisk prosedyre produserer en isotop-forhold med en 50 ppm (2 sd) reproduserbarhet.
Introduction
Målingen av høy presisjon (bedre enn 100 ppm / atommasseenhet) sink stabile isotoper sammensetningen har bare vært mulig for ca 15 år takket være utviklingen av multi-samleren plasma-source massespektrometre og har siden vært mest brukt i Earth og planet vitenskaper. Søknadene til det medisinske feltet er nye og har et stort potensial som biomarkører for sykdommer som endrer metabolismen av sink (f.eks Alzheimers sykdom). Dette papiret rapporterer en metode for å måle med stor presisjon de naturlige stabile isotopforhold av sink i forskjellige muse organer. Det samme vil gjelde for humane prøver. Metoden består av oppløsningen av organene, kjemisk rensing av sink fra resten av atomene, og deretter analyse av isotopforholdet i en masse-spektrometer.
Kvaliteten av Zn isotopiske målingene er avhengig av kvaliteten av den kjemiske rensing (renhet Zn, lav blank kompared til mengden av Zn til stede i prøven, høy kjemisk utbytte av prosedyren) og ved kontroll av instrument bias. Den høye renhet av det endelige Zn fraksjonen er nødvendig for å fjerne både isobariske interferens og ikke-interferens isobar som skaper en matrise effekt. Isobariske nuklider opprette direkte forstyrrelser (f.eks 64 Ni). Ikke-isobariske interferens genererer den såkalte "matrix" effekt og endre den analytiske nøyaktighet av målingene ved å endre tilstanden av ionisering i forhold til den rene sink standarden som prøvene blir sammenlignet med en. En lav blank (<10 ng) indikerer at det ikke er noen forurensning av prøvene ved ytre Zn som ville forspenne den målte isotop-sammensetning. Som Zn-isotoper kan fraksjoneres ved ionebyttekromatografi 2, sørger for samling av alle Zn-atomene som ingen isotoper fraksjonering finner sted, noe som innebærer at den kjemiske prosedyren bør ha en full utbytte. Til slutt blir den korreksjon av den instrument isotopisk fraksjonering under massespektrometri målingen gjøres via "standard eksponeringer" metoden.
Derfor, til de største vanskelighetene få nøyaktige målinger er kontrollerende ytre forurensing (dvs. lav blank), som produserer en full utbytte kjemisk rensing som er ren av eventuelle andre atomer eller molekyler, og korrigere den instrument isotop fraksjone på masse-spektrometer. I denne artikkelen vil vi beskrive vår analyseprotokoll for å separere Zn fra musen organer samt massespektrometri målinger.
Utvinningen er gjort ved hjelp av en lav mengde fortynnede syrer (HBr / HNO 3 media) på mikro kolonner (0,5 mL og 0,1 mL) av anion-utveksling harpiks. Den har et fullt utbytte og målingene har en ekstern reproduserbarhet bedre enn 50 ppm på 66 Zn / 64 Zn-forhold. En annen fordel med method er at det er svært rask. Fremgangsmåten er derfor meget godt egnet til medisinske fag, der man har behov for å analysere et stort antall prøver i forhold til geovitenskap, hvor disse analytiske metoder ble utviklet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Prosedyrer som involverer dyr har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Université Paris Diderot.
1. Utarbeidelse av Materials
- Under koke destillere en L av syrene (HNO3, HBr) for å rense dem fra urenhet.
- Rengjør begrene og tips adapter i en varm (~ 100 ° C) konsentrert HNO3 syrebad i minst to dager.
- Vask pipettespissene i en kald 3 N HNO 3 bad i flere dager og skyll individuelt tre ganger med deionisert vann.
2. Prøvepreparering
- Bedøve mus ved intraperitoneal injeksjon av ketamin og xylazin. Vurdere anestesi ved tåen klype metoden.
- Samle blodet ved en hjertepunktering i nærvær av heparin i 1,5 ml rør.
- Separer plasma fra blodcellene ved sentrifugering (10 min, 1500 x g) og overføre plasma til polypropylen cryogenic ampuller bruker polypropylen tips.
- Fjern det gjenværende blod fra organer ved å kutte den hepatiske vene og injisere DPBS gjennom hjertet. Vurdere død mus ved halshugging.
- Høste organer med sterile instrumenter av rustfritt stål, fri dem fra rundt fett om noen, og snap-fryse dem i polypropylen kryogene ampuller.
3. Kjemisk rensing
- Først oppløses prøvene i en blanding av ~ 1 ml konsentrert (30%) H 2 O 2 og ~ 1 ml konsentrert (~ 15 M) HNO3. Gjøre alle disse trinnene inne i en avtrekkshette.
- Plasser hele organ av interesse i en 15 ml Teflon beger. Deretter legger du til H 2 O 2 / HNO 3 til begeret 5. Holde begeret åpen i noen minutter for å unngå sprut på grunn av reaksjonen av oksydasjon av det organiske materialet, og frigjøring av CO2.
- Til slutt satte begeret på en kokeplate på aboUT 100 ° C i et par timer, eller til løsningen er helt klart.
- Åpne begerglass og tørke oppløsningen på en varmeplate ved ca. 100 ° C.
- Når prøven er tørr, tilsett 1 ml 1,5 N HBr i prøvene; lukke begeret og la den oppløses på en varm plate ved 100 ° C i et par timer.
- I mellomtiden forbereder de 500 ul kolonner.
- Legg 500 mL av AG1X8 200-400 mesh harpiks til kolonnen og sette det stativ kolonnen med en søppelbegerglass under den på. Vask harpiksen ved å alternere: 5 ml 18,2 Megohm ⋅ cm vann, 5 ml 0,5 N HNO 3, 5 ml vann, 5 ml 0,5 N HNO 3, og deretter 5 ml vann. Kondisjonere harpiksen med 5 ml 1,5 N HBr.
- Fjern begrene fra den varme platen og legg dem i et ultralydbad i ca 30 min, og deretter la begrene avkjøles til romtemperatur.
- Når begeret avkjøles og harpiksen vaskes, åpne beger. Sett spissen adapter til than sprøyte, legge en pipette tips; pipette 1 ml av prøven og legger det på harpiksen (veldig sakte for ikke å agitere harpiks).
- Når all væsken passerer gjennom kolonnen, tilsett 5 ml 1,5 N HBr.
- Når de 5 ml 1,5 N HBr passere gjennom kolonnen, må du bytte trash beger med en ren 15 ml beger.
- Tilsett 5 ml av 0,5 N HNO 3 2,5 ml om gangen. På dette stadiet Zn blir eluert fra harpiksen.
- Når 5 ml HNO 3 passerer gjennom kolonnen, fjerner begeret og plassere den på en varm plate ved 100 ° C inntil tørket.
- Fjerne kolonnen holderen kolonnen fra; søppel harpiks (bruk en ny resin for hver prøve).
- Når prøven er tørr, gjentar protokollen med samme volum av syrer på en mindre kolonne (100 mL) og deretter plassere den på en varm plate før tørket. Prøven er nå klar for masse-spektrometri.
4. massespektrometri måling
- Analyser Zn isotoper composisjon på en multi-kollektor induktivt koplet plasma-massespektrometer (MC-ICP-MS).
- Bruk maskinparametre oppsummert i tabell 1.
- Plasser Faraday koppene for å samle på masse (m / z) 62 Ni, 63 Cu, 64 Zn, 65 Cu, Zn 66, 67 og 68 Zn Zn.
- Forbered en løsning som inneholder 500 ppb Zn i 0,1 M HNO 3 for isotopisk analyse.
- Analyser 500 ppb løsning av Zn ved hjelp av en spraykammer kombinert med 100 mL / min teflon forstøver. For hver prøve, måle 30 skanner (en blokk av 30 sykluser) i hvilken integreringstiden for hver skanning er 8,389 sek.
- Korriger bakgrunnen ved å trekke på topp null sintensitetene fra en blank oppløsning (i 0,1 M HNO3 løsning som brukes til å re-oppløsning av prøvene).
- Kontroll og riktig mulig 64 Ni isobar interferens ved å måle intensiteten av 62 Ni topp.Anta at 64 Ni / 62 Ni forholdet er naturlig (0,2548), riktig denne verdien fra instrumental masse bias, og deretter fjerne 64 Ni på massen 64 som:
64 Zn real = 64 Zn målt - 64 Ni = 64 Zn måles - (64 Ni / 62 Ni) naturlig x 62 Ni målt. - Korriger instrumental masse skjevhet ved bracketing hver av prøvene med en 500 ppb standard løsning av JMC Lyon Zn standard (eller en annen tilgjengelig standard som IRMM-3702). Utføre standard eksponeringer ved å dividere 66 Zn / Zn-forhold på 64 prøven ved gjennomsnittet av 66 Zn / Zn 64 forholdet mellom de to standarder, målt før og etter at prøven minus en og multiplisert med 1000 (se ligning 1). Typisk ekstern presisjon på JMC Lyon Zn standard er 0,05 permil / amu (2 standardavvik, 2 sd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I 1.5 N HBr, de viktigste sink arter (ZnBr3-) former svært sterke komplekser med Anion-utveksling harpiks, mens de fleste andre elementer ikke samhandle med harpiks. Sink utvinnes deretter ved å endre det medium som fortynnet HNO 3, endrer arts av Zn i Zn 2+ som frigjøres fra harpiksen 6,7.
Isotopforhold er vanligvis uttrykt som deler per 1000 avvik i forhold til en standard:
med x = 66 eller 68. Den referansemateriale som brukes er den Zn "Lyon" standard JMC 3-0749 L 1. Den "Lyon" standard er den mest bredt brukt referansemateriale for å normal Zn isotop data. Alle de isotopiske resultatene som er rapportert er derfor relativ. Ved hjelp av denne referansen til isotopsammensetningen av jorden feller δ 66 Zn er 0,28 ± 0,05 8. Siden JMC-Lyon standard er ikke lett tilgjengelig, i fravær av denne standarden alternativ er å bruke standard IRMM-3702 som en referanse under målingene og konvertere resultatene med henvisning 9 as: 66 Zn JMC-Lyon = 66 Zn IRMM-3702 0,29. Den typiske blank er <10 ng.
Typiske resultater oppnådd med denne metoden er representert i figur 1, som en tre-isotop plot (δ 68 Zn vs δ 66 Zn) for forskjellige museorganer. Tabell 2 og 3 rapportere resultater fra replikerte eksperimenter av en typisk jordisk stein (en hawaiisk basalt) og av mus røde blodlegemer.
Figur 1. δ 68 Zn vs δ 66 Znfor forskjellige muse organer. Den typiske feilen bar er 0,07 permil for δ 66 Zn og 0,15 for δ 68 Zn er vist på figuren. Data fra referanse 15.
| MC-ICP-MS innstillinger | Neptune |
| RF power (W) | 1300 |
| Akselerasjon potensial (V) | 10.000 |
| Gasstrømningshastigheter | |
| Ar kjølevæske (l / min) | 18 |
| Ar hjelpe (l / min) | 1 |
| Ar prøve (l / min) | 1-1,2 |
| Løsning opptakshastighet (molution | 100 |
| Analyseparametere | |
| Antall blokker | 1 |
| Antall målinger per blokk | 30 |
| Integrasjon gang (er) | 8,389 |
| Typisk Zn konsentrasjon av prøver og standard (ppb) | 500 |
| Typisk overføring effektivitet V / ppm | 25 |
Tabell 1: MC-ICP-MS innstillingene for Zn isotopmålinger ved Institut de Fysikk du Globe de Paris.
| Prøver | δ 66 Zn | 2SE | δ 68 Zn | 2SE | n en |
| replikere 1 | 0,34 | 0,01 | 0,68 | 0,04 | 4 |
| replikere 2 | 0,34 | 0,01 | 0.68 | 0,01 | 3 |
| replikere 3 | 0,34 | 0,02 | 0,67 | 0,02 | 4 |
| replikere 4 | 0,36 | 0,06 | 0.7 | 0,09 | 4 |
| replikere 5 | 0,31 | 0,02 | 0,65 | 0,06 | 4 |
| replikere 6 | 0,33 | 0,01 | 0,68 | 0,02 | 3 |
| replikere 7 | 0,32 | 0,06 | 0,63 | 0.1 | 6 |
| Gjennomsnittlig | 0,33 | 0,03 | 0,67 | 0,05 | 7 |
| 2SD | 0,04 | 0,05 | |||
| a n = antall gjenta målingen ved MC-ICP-MS |
Tabell 2: Zn isotopiske sammensetning av Hawaii basalt K179-1R1-170.9 Hver replikat representerer en full kjemisk rensing og et gjennomsnitt av flere uavhengige masse-spektrometer målinger.. Data fra referanse 8.
| Mus nummer | δ 66 Zn | δ 68 Zn |
| 11 | 0,82 | 1.6 |
| 12 | 0,79 | 1,55 |
| 1. 3 | 0,84 | 1,65 |
| 14 | 0,87 | 1,72 |
| Gjennomsnittlig | 0,83 | 1,63 |
| 2SD | 0,07 | 0,15 |
Tabell 3: Zn isotopsammensetningen av bein av mus Hver replikere representerer en full kjemisk rensing.. Data fra referanse 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reproduserbarheten av målingene vurderes gjennom replikert analyser av de samme prøver som utføres i de forskjellige analytiske sesjoner. For eksempel 6, har vi replikert den samme bakke stein 7 ganger, og vi oppnådde resultater er rapportert i tabell 2.
Som forventet fra teorien om isotoper fraksjone 10 og målt i noen solsystemet materialet så langt (f.eks meteoritt 11-13, planter 3-5, deep-sea sedimenter 14, dyr 15-17), resultatene følge en masse avhengige lov (se figur 1). δ 68 Zn er omtrent dobbelt δ 66 Zn (figur 1), fordi massen forskjellen mellom 68 og 64 Zn Zn er to ganger differansen mellom 66 og 64 Zn Zn. Dette viser at våre målinger er fri for isobariske forstyrrelser (som ville kjøre data utav den lineære) og at sink isotoper fraksjoneres ut av samme isotoper bassenget.
For muse organer har begrenset mengde Zn i hvert organ hindret oss fra å utføre mange replikater av et enkelt organ 15. Men vi kan anslå en høyere grense for reproduserbarhet ved å sammenligne data for samme vev for forskjellige mus av samme alder og samme stamme (for eksempel for skjelettet av 16 uker gamle mus, Tabell 3). Dette reproduserbarhet er større (0,04 vs 0,07 for δ 66 Zn) enn hva som ble beregnet fra basalter, som ikke er overraskende fordi den inneholder heterogeniteten av prøvene så vel som den isotopiske variabilitet mellom de forskjellige mus. Det er derfor en overvurdering av reproduserbarhet, og vi tror at presisjonen på hver enkelt organ vil være lik det vi hadde bestemt på basalter. Vi kan trygt anta reproduserbarhet bedre enn 0,10 for ^8; 66 Zn (2 SD) som representerer en ti ganger større presisjon enn variasjonen rapportert mellom visse organer (se figur 1 og referanse 15).
Måling av stabile isotoper sammensetning Zn vil bli benyttet i fremtiden som et diagnostisk verktøy for sykdommer som modifiserer Zn balansen i kroppen. For eksempel er de sinkrike plakk assosiert med Alzheimers sykdom endre konsentrasjonen av sink i serum og siden hjernen og serumet har forskjellige isotoper 15 Zn-isotoper kan brukes til å oppdage tidlig stadium av sykdommen.
De alternative metoder for å måle Zn isotopsammensetningen av MC-ICP-MS involvere kjemisk rensing i konsentrert HCl materiale på større kolonner enn det som ble brukt her var 1-4. Vår metode basert på mikro-kolonner og fortynnede syrer har lave blanks og produserer data som er to ganger mer presis (50 ppm vs 100 ppm to sd). I addition, er foreliggende fremgangsmåte meget raskt (på grunn av den lille størrelsen av søylene og den lille mengden av syre som anvendes) og er meget godt egnet til å analysere store mengder av prøvene (som vanligvis er nødvendig i kliniske studier). Enkelheten av metoden ville være godt egnet til å brukes i et automatisk kjemisk rensesystem som vil tillate måling av et stort antall prøver.
En begrensning med denne tilnærmingen er at kun store bulkprøver kan analyseres (Fremgangsmåten bruker ~ 1 ug Zn). Redusere størrelsen på prøvene er avgjørende når du arbeider med edle kliniske prøver. Denne fremgangsmåte er også begrenset til massemåling, mens det for noen anvendelser in situ analyser kan være nødvendig. Future forbedring på teknikken skal være i forhold til å forbedre in situ isotoper målinger ved å kombinere en laser-ablasjon system med plasma masse spektrometer (LA-MC-ICP-MS). Dette ville tillate målinger av rommessig små prøver uten prior kjemisk rensing (som har en tendens til å forurense prøvene). I tillegg, i situ målinger vil tillate måling av Zn isotopsammensetningen på levende vev. Så vidt vi vet har det bare vært ett forsøk på å måle sink isotopratene bruker en slik teknikk 18 og metoden er fortsatt ikke nøyaktig nok, men målinger av høy presisjon isotopforholdet av LA-MC-ICP-MS har blitt gjort for Fe 19 og B 20 og raffinering av teknikken ved hjelp av moderne lasere kan føre til et stort gjennombrudd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
FM erkjenner midler fra ANR gjennom en chaire d'Excellence IDEX Sorbonne Paris Cité, den INSU gjennom en PNP stipend, Institut Universitaire de France samt LABEX UniverEarth programmet ved Sorbonne Paris Cité (ANR-10-LabX-0023 og ANR -11-IDEX-0005-02). Vi takker også midler fra European Research Council under EFs H2020 rammeprogram / ERC tilskuddsavtalen # 637503 (Tine).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter | Thermo-Fisher | ||
| Anion-exchange resin AG1 X8 200-400 | Bio-Rad | 140-1443-MSDS | |
| Teflon beakers | Savillex | 200-015-12 | |
| In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon |
References
- Marechal, C. N., Telouk, P., Albarede, F. Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma-source mass spectrometry. Chemical Geology. 156 (1), 251-273 (1999).
- Marechal, C. N., Albarede, F. Ion-exchange fractionation of copper and zinc isotopes. Geochim. Cosmochim. Acta. 66 (9), 1499-1509 (2001).
- Weiss, D. J., Mason, T. F. D., Zhao, F. J., Kirk, G. J. D., Coles, B. J. Isotopic discrimination of zinc in higher plants. New Phytologist. 165 (3), 703-710 (2005).
- Jouvin, D., Louvat, P., N, M. F. C. Zinc isotopic fractionation: why organic matters. Environ Sci Technol. 43 (15), 5747-5754 (2009).
- Moynier, F., et al. Isotopic fractionation and transport mechanisms of Zn in plants. Chemical Geology. 267 (3-4), 125-130 (2009).
- Moynier, F., Herzog, G., Albarede, F. Isotopic composition of zinc, copper, and iron in lunar samples. Geochim. Cosmochim. Acta. 70 (24), 6103-6117 (2006).
- Moynier, F., et al. Isotopic fractionation of zinc in tektites. Earth Planet. Sci. Lett. 277 (3-4), 482-489 (2009).
- Chen, H., Savage, P., Teng, F. Z., Helz, R., Moynier, F. Zinc isotope fractionation during magmatic differentiation and the isotopic composition of the bulk Earth. Earth Planet. Sci. Lett. 369-370, 34-42 (2013).
- Moeller, K., et al. Calibration of the new certified materials ERM-AE633 and ERM-AE6447 for copper and IRMM 3702 for zinc isotope amount ratio determination. Geostd. Geoan. Res. 36 (2), 177-199 (2012).
- Bigeleisen, J., Mayer, M. Calculation of equilibrium constants for isotopic exchange reactions. J. Chem. Phys. 15, 261-267 (1947).
- Luck, J. M., Ben Othman, D., Albarede, F. Zn and Cu isotopic variations in chondrites and iron meteorites: Early solar nebula reservoirs and parent-body processes. Geochim. Cosmochim. Acta. 69 (22), 5351-5363 (2005).
- Moynier, F., Dauphas, N., Podosek, F. A Search for 70Zn Anomalies in Meteorites. Astrophys. J. 700 (2), L92-L95 (2009).
- Paniello, R., Day, J., Moynier, F. Zn isotope evidence for the origin of the Moon. Nature. 490 (7420), 376-380 (2012).
- Pichat, S., Douchet, C., Albarede, F. Zinc isotope variations in deep-sea carbonates from the eastern equatorial Pacific over the last 175 ka. Earth and Planetary Science Letters. 210 (1-2), 167-178 (2003).
- Moynier, F., Fujii, T., Shaw, A., Le Borgne, M. Heterogeneous of natural Zn isotopes in mice. Metallomics. 5 (6), 693-699 (2013).
- Balter, V., et al. Bodily variability of zinc natural isotope abundance in sheep. Rapid Com. Mass. Spec. 24, 605-612 (2010).
- Balter, V., et al. Contrasting Cu, Fe, and Zn isotopic patterns in organs and body fluids of mice and sheep, with emphasis on cellular fractionation. Metallomics. 5 (11), 1470-1482 (2010).
- Urgast, D. S., et al. Zinc isotope ratio imaging of rat brain thin sections from stable isotope tracer by LA-MC-ICP-MS. Metallomics. 4, 1057-1063 (2012).
- Marin-Carbonne, J., Rollion-Bard, C., Luais, B. In-situ measurements of iron isotopes by SIMS: MC-ICP-MS intercalibration and application to a magnetite crystal from the Gunflint chert. Chem. Geol. 285 (1-4), 50-61 (2011).
- Fietzke, J., et al. Boron isotope ratio determination in carbonates via LA-MC-ICP-MS using soda-lime glass standards as reference material. J. Anal. Atom. Spec. 25, 1953-1957 (2010).
