Abstract
Nós apresentamos um procedimento para medir com alta precisão as taxas de isótopos de zinco em órgãos do mouse. O zinco é composto por 5 isótopos estáveis (64 Zn, 66 Zn, 67 Zn 68, Zn e Zn 70), que são naturalmente fraccionados entre órgãos do mouse. Nós primeiro mostrar como dissolver os diferentes órgãos, a fim de libertar os átomos de Zn; este passo é realizado por uma mistura de HNO 3 e H 2 O 2. Em seguida, purificar os átomos de zinco a partir de todos os outros elementos, em particular de interferências isobáricas (por exemplo, NI), por cromatografia de troca aniônica em um diluído HBr / HNO meio 3. Estas duas primeiras etapas são realizadas em um laboratório limpo usando produtos químicos de alta pureza. Finalmente, as proporções de isótopos são medidos utilizando um multi-colector espectrómetro de massa acoplado indutivamente de plasma, em baixa resolução. As amostras são injectados usando uma câmara de pulverização e o fraccionamento isotópica induzida pelo espectrómetro de massa é o corrected, comparando o rácio das amostras para o rácio de um padrão (técnica de escalonamento padrão). Este procedimento típico completo produz uma razão isotópica com uma reprodutibilidade 50 ppm (2 sd).
Introduction
A medição de alta precisão (melhor do que 100 ppm / unidade de massa atômica) de zinco composição dos isótopos estáveis só foi possível por cerca de 15 anos, graças ao desenvolvimento de multi-coletor de código-fonte plasma massa-espectrómetros e desde então tem sido aplicado principalmente em Terra e ciências planetárias. Os aplicativos para a área médica são novos e têm um forte potencial como biomarcadores para doenças que modificam o metabolismo de zinco (por exemplo, a doença de Alzheimer). Este artigo relata um método para medir com alta precisão as proporções de isótopos estáveis naturais de zinco em vários órgãos do mouse. O mesmo seria aplicável a amostras humanas. O método consiste na dissolução dos órgãos, a purificação química de zinco a partir do resto dos átomos, e, em seguida, a análise da proporção isótopo num espectrómetro de massa.
A qualidade de Zn medições isotópicas está dependente da qualidade da purificação química (pureza de Zn, baixo amostra em brancoared para a quantidade de Zn presente na amostra, maior rendimento de produtos químicos do processo) e no controlo da polarização instrumental. O elevado grau de pureza da fracção de Zn final é necessária para remover ambas as interferências isobáricas e não-interferência isobárica que criam um efeito de matriz. Nuclides isobáricas criar interferências diretas (por exemplo, 64 Ni). Interferências não-isobáricas gerar o chamado efeito de "matriz" e alterar a precisão analítica das medições, alterando o estado de ionização por comparação com o padrão de zinco puro a que as amostras são comparados com um. Um baixo em branco (<10 ng) indica que não existe contaminação das amostras por Zn externo que distorceria a composição isotópica medido. Como isótopos de Zn pode ser fraccionado durante a cromatografia de permuta iónica 2, o conjunto de todos os átomos de Zn assegura que não ocorre fraccionamento isotópica, o que implica que o processo químico deve ter um rendimento total. Finalmente, a correção do fracionamento isotópico instrumental durante a medição espectrometria de massa é feita através do método de "bracketing padrão".
Portanto, as principais dificuldades para a obtenção de medições precisas está controlando a contaminação externa (ou seja, baixo em branco), produzindo uma purificação química rendimento total que é limpo de quaisquer outros átomos ou moléculas, e corrigir o fracionamento isotópico instrumental na massa espectrômetro. Neste artigo vamos descrever o nosso protocolo analítico para separar Zn dos órgãos do rato, bem como as medidas de espectrometria de massa.
A extração é feita usando uma baixa quantidade de ácidos diluídos (HBr / HNO3 media) em micro-colunas (0,5 ul e 0,1 ul) de resina de troca aniônica. Tem um rendimento total e as medições tem uma reprodutibilidade externa melhor do que 50 ppm em relação a 66 Zn / 64 Zn. Outra vantagem da metanfetaminaOD é que ele é muito rápido. O método é, portanto, muito bem adaptado para ciências médicas, em que é necessário analisar um grande número de amostras em comparação com geosciences, onde estes foram desenvolvidos métodos analíticos.
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Protocol
NOTA: Os procedimentos que envolvem animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) na Université Paris Diderot.
1. Preparação de Materiais
- Sub-ferver 1 L de destilar os ácidos (HNO 3, HBr) a fim de purificá-los a partir de impureza.
- Limpe os copos e adaptador de ponta em um quente (~ 100 ° C) HNO 3 banho de ácido concentrado durante pelo menos dois dias.
- Lave as pontas de pipeta em um resfriado 3 N HNO 3 banho por vários dias e enxaguar individualmente três vezes com água deionizada.
Preparação 2. Amostra
- Anestesiar os ratos por injecção intraperitoneal de cetamina e xilazina. Avaliar anestesia pelo método toe pitada.
- Recolhe-se o sangue por punção cardíaca, uma na presença de heparina em tubos de 1,5 ml.
- Separa-se o plasma a partir de células de sangue por centrifugação (10 min, 1500 xg) e transferir o plasma para o polipropileno cfrascos ryogenic usando dicas de polipropileno.
- Remover o sangue restante a partir de órgãos de corte da veia hepática e injectando DPBS através do coração. Avaliar a morte do mouse por deslocamento cervical.
- Colher os órgãos com instrumentos de aço inoxidável estéreis, libertá-los de gordura em torno se houver, e snap-congelá-los em frascos de polipropileno criogênicas.
3. Chemical Purificação
- Em primeiro lugar, dissolve-se as amostras com uma mistura de ~ 1 ml de concentrado (30%) de H 2 O 2 e ~ 1 ml de concentrado (~ 15 M) HNO3. Será que todos estes passos dentro de um exaustor.
- Coloque todo o órgão de interesse em uma proveta de 15 ml Teflon. Em seguida, adicione o H 2 O 2 / HNO 3 a 5 o copo. Manter o vaso aberto durante alguns minutos, a fim de evitar salpicos, devido à reacção de oxidação da matéria orgânica e a libertação de CO 2.
- Finalmente, colocar o copo sobre uma placa quente a about 100 ° C durante um par de horas ou até que a solução é perfeitamente claro.
- Abrir o recipiente e secar a solução sobre uma placa quente a cerca de 100 ° C.
- Uma vez que a amostra é seca, adicionar 1 ml de HBr 1,5 N para as amostras; fechar a proveta e deixou-se dissolver numa placa quente a 100 ° C durante um par de horas.
- Enquanto isso prepare os 500 colunas ul.
- Adicionar 500 mL de resina malha AG1X8 200-400 para a coluna e colocá-lo na prateleira coluna com uma taça de lixo abaixo dela. Lavou-se a resina alternando: 5 ml de 18,2 mohms ⋅ cm de água, 5 ml de 0,5 N HNO 3, 5 ml de água, 5 ml de 0,5 N HNO 3, e, em seguida, 5 ml de água. Condiciona-se a resina com 5 ml de HBr 1,5 N.
- Retirar os copos da chapa quente e colocá-los em um banho de ultra-som para cerca de 30 min, e em seguida, deixar as taças esfriar a temperatura ambiente.
- Uma vez que o recipiente é arrefecido e a resina é lavada, abrir o recipiente. Coloque o adaptador de ponta para tele seringa, adicione uma ponta de pipeta; Pipete a 1 ml de amostra e carregá-lo sobre a resina (muito lentamente a fim de não agitar a resina).
- Uma vez todo o líquido passa através da coluna, adicionam-se 5 ml de HBr 1,5 N.
- Uma vez que os 5 ml de HBr 1,5 N passar através da coluna, substituir o recipiente de lixo, com uma proveta de 15 ml limpo.
- Adicionar 5 ml de 0,5 N HNO 3 2,5 ml de cada vez. Nesta fase, o Zn é eluído a partir da resina.
- Uma vez 5 ml de HNO 3 passa através da coluna, retirar o copo e colocá-lo sobre uma placa quente a 100 ° C até seca.
- Retirar a coluna do suporte da coluna; lixo a resina (usar uma nova resina para cada amostra).
- Uma vez que a amostra é seca, repetir o protocolo com o mesmo volume de ácidos sobre uma coluna mais pequena (100 ul) e, em seguida, colocá-la numa placa quente até seca. A amostra está agora pronto para espectrometria de massa.
4. espectroscopia de massa de Medição
- Analisar o compo isotópica Znsição num espectrómetro de massa de plasma indutivamente acoplado-colector multi (MC-ICP-MS).
- Com os parâmetros de máquina resumidos na Tabela 1.
- Posicione os copos de Faraday para coletar a massa (m / z) de 62 Ni, 63 Cu, Zn 64, 65 Cu, Zn 66, 67 Zn e 68 Zn.
- Preparar uma solução contendo 500 ppb Zn em 0,1 M HNO3 para análise isotópica.
- Analisar a solução de 500 ppb de Zn usando uma câmara de pulverização combinada com 100 ul / min nebulizador de teflon. Para cada amostra, medir 30 scans (1 bloco de 30 ciclos), em que o tempo de integração de cada digitalização é 8,389 sec.
- Corrija o fundo subtraindo o zero intensidades sobre-pico a partir de uma solução em branco (o M HNO3 0,1 solução usada para re-dissolver as amostras).
- Controlo e à possível interferência isobárica 64 Ni correto medindo a intensidade do pico de 62 Ni.Suponha que a taxa de 62 64 Ni / Ni é natural (0,2548), este valor correto a partir do viés de massa instrumental, e depois remover o Ni 64 na massa 64 como:
64 Zn reais = 64 Zn medido - 64 = 64 Ni Zn medido - (64 Ni / 62 Ni) naturais x 62 Ni medido. - Corrigir a polarização massa instrumental por escalonamento cada uma das amostras com uma solução de 500 ppb padrão da norma JMC Lyon Zn (ou outro padrão disponíveis, tais como IMMR-3702). Realizar o escalonamento padrão dividindo a relação de 66 Zn / 64 Zn de amostra pelo valor médio da relação de 66 Zn / 64 Zn de os dois padrões medidos antes e depois da amostra de menos de 1 e multiplicado por 1.000 (ver equação 1). Precisão externo típico no padrão JMC Lyon Zn é de 0,05 permil / amu (2 desvio padrão, 2 sd).
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Representative Results
Em 1,5 N HBr, as principais espécies de zinco (ZnBr3-) forma complexos muito fortes com a resina de troca aniônica, enquanto a maioria dos outros elementos não interagem com a resina. O zinco é, então, recuperado, alterando a forma diluída de HNO 3, mudando a especiação de Zn para o Zn2 + que é libertado a partir da resina de 6,7.
As taxas de isótopos são tipicamente expressos em partes por mil desvios relativos a um padrão:
com x = 66 ou 68. O material de referência utilizado é o Zn "Lyon" JMC padrão 3-0749 L 1. O padrão "Lyon" é o material de referência mais amplamente usado para normalizar dados de isótopos de Zn. Todos os resultados relatados isotópicas são, por conseguinte, em relação. Usando esta referência a composição isotópica da Terra fou δ 66 Zn é 0,28 ± 0,05 8. Desde o padrão JMC-Lyon não é facilmente disponível, na ausência desta norma a alternativa é usar o padrão IRMM-3702 como uma referência durante as medições e converter os resultados usando referência 9 como: 66 Zn JMC-Lyon = 66 Zn IRMM-3702 0,29. O típico em branco é <10 ng.
Os resultados típicos obtidos com este método está representado na Figura 1, como um lote de três isótopos (δ 68 Zn vs δ 66 Zn) em diferentes órgãos dos ratos. Tabela 2 e 3 relatório resultados de experiências replicadas de uma pedra típica terrestre (um havaiano basalto) e de rato As células vermelhas do sangue.
Figura 1. δ 68 Zn vs δ 66 Znpara diferentes órgãos do mouse. A barra de erro típico é de 0,07 permil para δ 66 Zn e 0,15 para δ 68 Zn é mostrado na figura. Os dados de referência 15.
| Configurações MC-ICP-MS | Netuno |
| Potência de RF (W) | 1300 |
| Potencial de aceleração (V) | 10.000 |
| Caudais de gás | |
| Ar refrigerante (l / min) | 18 |
| Ar auxiliar (l / min) | 1 |
| Amostra Ar (l / min) | 1-1,2 |
| Taxa de absorção de solução (molution | 100 |
| Parâmetros de análise | |
| Número de blocos | 1 |
| Número de medições por bloco | 30 |
| Tempo (s) Integração | 8,389 |
| Concentração de Zn típico de amostras e padrão (ppb) | 500 |
| A eficiência de transmissão típica V / ppm | 25 |
Tabela 1: Configurações de MC-ICP-MS para as medições de isótopos de Zn no Institut de Physique du Globe de Paris.
| Amostras | δ 66 Zn | 2SE | δ 68 Zn | 2SE | n / D |
| replicar 1 | 0.34 | 0,01 | 0.68 | 0.04 | 4 |
| replicar 2 | 0.34 | 0,01 | 0.68 | 0,01 | 3 |
| replicar 3 | 0.34 | 0,02 | 0.67 | 0,02 | 4 |
| replicar 4 | 0.36 | 0.06 | 0,7 | 0.09 | 4 |
| replicar 5 | 0.31 | 0,02 | 0.65 | 0.06 | 4 |
| replicar 6 | 0.33 | 0,01 | 0.68 | 0,02 | 3 |
| replicar 7 | 0.32 | 0.06 | 0.63 | 0,1 | 6 |
| Média | 0.33 | 0,03 | 0.67 | 0,05 | 7 |
| 2SD | 0.04 | 0,05 | |||
| a n = número de repetição da medição por MC-ICP-MS |
Tabela 2: Zn composição isotópica do Havaí basalto K179-1R1-170.9 Cada repetição representa uma purificação química total e da média de várias medições de massa, espectrômetro independentes.. Os dados de referência 8.
| Número do mouse | δ 66 Zn | δ 68 Zn |
| 11 | 0.82 | 1.6 |
| 12 | 0.79 | 1.55 |
| 13 | 0,84 | 1.65 |
| 14 | 0,87 | 1.72 |
| Média | 0.83 | 1.63 |
| 2SD | 0.07 | 0.15 |
Tabela 3: Zn composição isotópica dos ossos dos camundongos Cada repetição representa uma purificação química completa.. Os dados de referência 15.
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Discussion
A reprodutibilidade das medidas é avaliada através de análises replicadas das mesmas amostras realizadas durante as diferentes sessões de análise. Por exemplo 6, que foram replicados da mesma rocha terrestre 7 vezes e obtivemos os resultados reportados na Tabela 2.
Como esperado a partir da teoria de fracionamento isotópico 10 e tal como medido em qualquer material sistema solar até agora (por exemplo, meteorito 11-13, plantas 3-5, os sedimentos do fundo do mar 14, animais 15-17), os resultados seguem uma em massa lei dependente (ver Figura 1). δ 68 de Zn é aproximadamente o dobro δ 66 Zn (Figura 1), porque a diferença de massa entre 68 e 64 Zn: Zn é duas vezes a diferença entre 66 e 64 Zn Zn. Isso mostra que nossas medidas são livres de interferências isobáricas (que iria conduzir os dados para forada-linha reta) e que os isótopos de zinco são fraccionados fora do mesmo pool isotópica.
Para órgãos do rato, a quantidade limitada de Zn em cada órgão nos impediu de realizar muitas repetições de um único órgão 15. No entanto, pode-se estimar um limite superior para a reprodutibilidade, comparando os dados para o mesmo tecido para diferentes ratinhos da mesma idade e mesma estirpe (por exemplo, para os ossos de 16 semanas ratos velhos, Tabela 3). Esta reprodutibilidade é maior (0,04 vs 0,07 para o δ 66 Zn) do que o que foi estimado a partir de rochas de basalto, o que não é surpreendente porque inclui a heterogeneidade das amostras, bem como a variabilidade entre os diferentes isotópica ratinhos. É, portanto, uma superestimação da reprodutibilidade, e acreditamos que a precisão em cada órgão indivíduo seria semelhante ao que havia determinado em rochas basálticas. Nós podemos seguramente assumir reprodutibilidade melhor do que 0,10 para a ^8; 66 Zn (2 SD) o que representa uma precisão de 10 vezes maior do que a variabilidade entre relatado certos órgãos (ver Figura 1 e de referência 15).
Medindo a composição isotópica de Zn deverá ser utilizado no futuro, como uma ferramenta de diagnóstico para doenças que modificam o equilíbrio Zn do corpo. Por exemplo, as placas ricas em zinco associadas com a doença de Alzheimer alterar a concentração de zinco no soro e uma vez que o cérebro e o soro têm diferentes composição isotópica 15 isótopos de Zn pode ser utilizado para detectar a fase precoce da doença.
A maioria dos métodos alternativos para medir o Zn composição isotópica por MC-ICP-MS envolve purificação química em meio HCl concentrado em colunas maiores do que o utilizado aqui 1-4. Nosso método baseado em micro-colunas e ácidos diluídos tem baixos espaços em branco e produz dados que são duas vezes mais preciso (50 ppm vs 100 ppm 2 sd). Em additião, o nosso método é muito rápido (devido ao pequeno tamanho das colunas e a pequena quantidade de ácido utilizada), e é muito bem adequado para analisar grande quantidade de amostras (como normalmente necessário nos estudos clínicos). A simplicidade do método seria também adequado para ser utilizado num sistema de purificação químico automático que permita que as medições de um grande número de amostras.
Uma limitação deste método é que apenas as grandes amostras a granel pode ser analisada (o procedimento utiliza ~ 1 ug de Zn). A redução do tamanho das amostras é crucial quando se lida com amostras clínicas preciosos. Este método também está limitado a medições a granel, ao passo que para algumas aplicações em análises in situ pode ser necessária. Melhoria futura na técnica devem estar em relação com a melhoria in situ medições isotópicas pela combinação de um sistema de laser de ablação com o espectrómetro de massa de plasma (LA-MC-ICP-MS). Isto permitiria que as medições de pequenas amostras espacialmente sem prior purificação química (que tende a contaminar as amostras). Além disso, medições in situ irá permitir a medição da composição isotópica de Zn em tecidos vivos. Para o nosso conhecimento, houve apenas uma tentativa de medir os rácios de isótopos de zinco usando essa técnica 18 eo método ainda não é suficientemente precisa, no entanto, as medições de alta precisão de razão isotópica por LA-MC-ICP-MS tem sido feito para Fe 19 e B 20 e refino da técnica usando lasers modernos pode levar a um grande avanço.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
FM reconhece financiamento da ANR através de um chaire d'Excellence IDEX Sorbonne Paris Cité, o INSU através de uma subvenção PNP, o Institut Universitaire de France, bem como o programa Labex UniverEarth na Sorbonne Paris Cité (ANR-10-LabX-0023 e ANR -11-IDEX-0005-02). Agradecemos também o financiamento do Conselho Europeu de Investigação no âmbito da Comunidade Europeia H2020 programa-quadro / ERC convenção de subvenção # 637503 (Pristine).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter | Thermo-Fisher | ||
| Anion-exchange resin AG1 X8 200-400 | Bio-Rad | 140-1443-MSDS | |
| Teflon beakers | Savillex | 200-015-12 | |
| In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon |
References
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