Summary
وينظم قدرة البطانة الملتهبة لتجنيد الكريات البيض من تدفق الخلايا اللحمية الوسيطة. وصفنا اثنين في المختبر نماذج دمج خلايا الإنسان الأساسية التي يمكن استخدامها لتقييم التوظيف العدلات من التدفق ودراسة الدور الذي تلعبه خلايا انسجة الوسيطة في تنظيم هذه العملية.
Abstract
خلايا انسجة تنظم توظيف تعميم الكريات البيض خلال الالتهاب من خلال عبر الحديث مع الخلايا البطانية المجاورة. نحن هنا وصف اثنين في المختبر "الأوعية الدموية" نماذج لدراسة توظيف تعميم العدلات من تدفق الخلايا البطانية الملتهبة. والميزة الرئيسية لهذه النماذج هي القدرة على تحليل كل خطوة في سلسلة التصاق الكريات البيض في النظام، كما أن تحدث في الجسم الحي. وصفنا أيضا كيف يمكن تكييفها كلا النموذجين لدراسة دور الخلايا اللحمية، في هذه الحالة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC)، في تنظيم تجنيد الكريات البيض.
كان المثقف الخلايا البطانية الأولية وحدها أو مع MSC الإنسان في اتصال مباشر على microslides Ibidi أو على طرفي نقيض من مرشح Transwell لمدة 24 ساعة. وقد حفزت الثقافات مع عامل نخر الورم ألفا (TNFα) لمدة 4 ساعة ودمجها في التصاق الفحص القائمة على التدفق. تم perfused لبلعة العدلاتعلى البطانة لمدة 4 دقائق. وقد تصور القبض على تدفق العدلات وتفاعلاتها مع البطانة التي على النقيض من المرحلة المجهري.
في كلا النموذجين، وزيادة خلوى التحفيز التوظيف البطانية العدلات تتدفق بطريقة تعتمد على الجرعة. وأظهر تحليل سلوك العدلات جند انخفاضا تعتمد على الجرعة في المتداول وزيادة تعتمد على الجرعة في التهجير من خلال البطانة. في ثقافة مشتركة، قمعت MSC العدلات التصاق لحفز TNFα البطانة.
لدينا نماذج المستندة إلى التصاق تدفق تحاكي المراحل الأولية لتجنيد الكريات البيض من التداول. بالإضافة إلى الكريات البيض، ويمكن استخدامها لدراسة توظيف أنواع الخلايا الأخرى، مثل MSC أو تعميم الخلايا السرطانية تدار علاجيا. وقد أظهرت لنا نماذج متعددة الطبقات المشارك الثقافة التي MSC التواصل مع البطانة لتعديل استجابتها لالسيتوكينات الموالية للالتهابات، alteriنانوغرام تجنيد العدلات. مزيد من الابحاث التي تستخدم مثل هذه النماذج هو مطلوب لنفهم تماما كيف الخلايا اللحمية من الأنسجة المختلفة والشروط (الاضطرابات الالتهابية أو السرطان) التأثير على تجنيد الكريات البيض خلال الالتهاب.
Introduction
الالتهاب هو استجابة وقائية لالعدوى الميكروبية أو إصابة الأنسجة التي تتطلب تنظيم محكم من دخول الكريات البيض في والخروج من الأنسجة الملتهبة للسماح قرار 1،2. عبر الحديث بين الخلايا البطانية (EC) أن السفن خط الدم، الكريات البيض وتعميم خلايا انسجة الأنسجة المقيمين ضروري لتنسيق هذه العملية 3. ومع ذلك، والتوظيف غير المنضبط من الكريات البيض وإزالتها غير فعالة ركيزة تطور الأمراض الالتهابية المزمنة 4. فهمنا الحالي للتجنيد الكريات البيض في الصحة والمرض غير مكتمل وهناك حاجة إلى نماذج أكثر قوة لتحليل هذه العملية.
آليات دعم التوظيف من الكريات البيض من الدم من خلال الأوعية الدموية EC في الأوردة ما بعد الشعرية وقد وصفت جيدا 1،2،5. يتم التقاط الكريات البيض الدموية من خلال مستقبلات متخصصة (على سبيل المثال، VCAM-1، E-selectin، ف selectin) الذيوتصل ينظم على البطانة الملتهبة. هذه التفاعلات عابرة تسمح الكريات البيض للتفاعل مع سطح ملزمة كيموكينات وسطاء المشتقة من الدهون (إما البطانية أو اللحمية في الأصل) التي تنشط integrins التي أعربت عنها الكريات البيض 6- 11. وهذا بدوره استقرار التصاق ومحركات الهجرة عبر البطانة وإلى الأنسجة 12- 15. داخل الأنسجة، وتجنيد يتعرضون الكريات البيض إلى وكلاء المشتقة من انسجة التي تؤثر على الحركة والوظيفة والبقاء على قيد الحياة 16،17. أدلة متزايدة تشير بقوة إلى أن إشارات وردت في كل مرحلة من شروط عملية التوظيف الكريات البيض لالمقبل. ومع ذلك، فإن فهمنا للتجنيد الكريات البيض لا يزال غير مكتمل، والقليل جدا هو معروف عن حركة الكريات البيض مكونات تشكيل داخل الأنسجة.
في برمنغهام وضعنا عدة في المختبر "الأوعية الدموية" نماذج لدراسة تجنيد الكريات البيض منتدفق 9،18،19. ونحن نفهم الآن أن الأوعية الدموية فعل EC المنظمين المباشرة اعتبارا من تجنيد الكريات البيض الاستجابة للتغيرات في المكروية المحلية. على وجه التحديد، يمكن للخلايا انسجة الأنسجة مقيمة تنظيم بنشاط الاستجابة الالتهابية، في جزء منه عن طريق التحدث مع الأوعية الدموية EC المجاورة للتأثير على دورها في تجنيد 3. لقد أظهرنا سابقا أن الخلايا اللحمية مختلف تعدل قدرة EC لدعم التصاق وهجرة الكريات البيض بطريقة الأنسجة محددة، وأن هذه الآثار أصبحت تغير في الأمراض المزمنة 13،16،20،21. وهكذا، والخلايا اللحمية تضع الأنسجة "عنوان رموز" التي تحدد سياق كل استجابة التهابية 22. وفي الآونة الأخيرة، لقد أثبتنا أن النخاع العظمي المستمدة MSC (BMMSC) أكثر قدرة أسفل تنظيم استجابة EC لالسيتوكينات، مما يؤدي إلى انخفاض في توظيف كل من العدلات واللمفاويات 23.
آليات الموقع govتوضيح erning التوظيف في المختبر وتستخدم إلى حد كبير المقايسات تتضمن نوع واحد خلية (على سبيل المثال، EC) أو البروتين في عزلة. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات لا تأخذ في الاعتبار آثار البيئة الأنسجة المحلية (أي وجود خلايا انسجة) على تجنيد الكريات البيض وهجرتهم اللاحقة في الأنسجة. نحن هنا وصف طريقتين القائم على التدفق في الخلايا التي اللحمية، وتحديدا الوسيطة تنبع الخلايا (MSC)، هي شارك في تربيتها مع EC 23. مثل هذه النماذج تسمح لنا لدراسة تأثير الخلايا اللحمية على الاستجابات البطانية، ولا سيما قدرتها على دعم التوظيف الكريات البيض من التدفق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. العزلة والثقافة الابتدائي الخلايا البطانية الإنسان والوسيطة الخلايا الجذعية
- خلايا العزلة وثقافة الإنسان السري الوريد البطانية (HUVEC):
- وضع الحبل السري على صينية مع المناشف الورقية ورذاذ مع الايثانول 70٪. ضع في نسيج الثقافة هود. تحديد الوريد ويقني؛ يدخل القنية في كلا الجانبين. وضع الكابل التعادل قرب نهاية مقنى لضمان الحصول عليها.
- تغسل الدم الوريدي مع برنامج تلفزيوني باستخدام حقنة. ملء المحاقن مع الهواء ويمر عبر الوريد لإزالة وتجاهل PBS المتبقية.
- ذوبان الجليد 10 ملغ / مل نوع كولاجيناز الأولى أ وتمييع 01:10 في برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم) إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. تمرير الحل كولاجيناز في الوريد حتى تمتلئ كل من حقنة عادية. إغلاق المشابك على حقنة عادية في كلا الجانبين.
- تغطية صينية مع الأنسجة ورذاذ مع الايثانول 70٪. وضع الحبل في حاضنة لمدة 20 دقيقة عند 37 ° C وCO 2 5٪.
- خذ الحبل بهامن الحاضنة وتشديد العلاقات كبل. تدليك الحبل بلطف لمدة 1 دقيقة. طرد تعليق الخلية مع 10 مل PBS وجمع في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
- ملء المحاقن مع الهواء ويمر عبر الوريد لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية مرتين، وجمع PBS في أنبوب الطرد المركزي 50 مل المستخدمة في الخطوة 1.1.5. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- نضح طاف و resuspend بيليه في 1 مل الكامل المتوسطة EC. EC المتوسطة يتكون من M199 تستكمل مع 35 ميكروغرام / مل كبريتات جنتاميسين، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة البشري، 1 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، و 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B، و 20٪ مصل العجل الجنين.
- إضافة 4 مل من EC المتوسطة وتعليق EC إلى 25 سم 2 قارورة. تغيير المتوسطة في اليوم التالي وبعد ذلك كل أيام 2.
- EC تبدي مثل الحصوه التشكل (الشكل 1Ai). لفحوصات التصاق، EC والمصنفة بشكل عام عندما تصل إلى 100٪ التقاء (انظر القسم 1.4
- عزل الخلايا الجذعية الوسيطة جيلي وارتون (WJMSC) من الحبل السري الإنسان:
- عزل المستمدة من جيلي MSC ارتون (WJMSC) من الحبل السري جديدة أو من الحبال التي تم بالفعل تستخدم لعزل EC. قطع الحبل السري إلى 5 سم قطعة طويلة. قطع كل قطعة طوليا للكشف عن الأوعية الدموية (الشرايين 2 [أبيض، جامدة] و 1 الوريد [الأصفر، منتفخة]).
- باستخدام مقص العقيمة وملقط إزالة الأوعية الدموية وتجاهل. قطع جميع الأنسجة تصبح 2 - 3 مم 3 قطع. باستخدام ملقط مكان 2-3 ملم 3 قطع في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
- ذوبان الجليد 100 ملغ / مل نوع كولاجيناز الأسهم II وتمييع 1: 100 في 10 مل PBS إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. ذوبان الجليد 20،000 U / مل الأسهم هيالورونيداز وتمييع 1: 400 إلى تركيز النهائي من 50 U / مل في حل كولاجيناز.
- إضافة كوكتيل الأنزيمية إلى أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على شظايا الأنسجة. احتضان fragmen الأنسجةTS لمدة 5 ساعة عند 37 ° C على محور دوار بطيئة.
- تمييع تعليق خلية 1: 5 في برنامج تلفزيوني. وضع 100 ميكرون فلتر المسام إلى 50 مل جديد أنبوب الطرد المركزي. صب تعليق الخلية على 100 ميكرون فلتر المسام.
ملاحظة: باقي أجزاء الأنسجة سيتم الاحتفاظ على مرشح وسيتم جمع الخلايا في أنبوب 50ML أجهزة الطرد المركزي. - تجاهل التصفية. الطرد المركزي تعليق خلية في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. نضح طاف و resuspend WJMSC بيليه في 12 مل الكامل مستنبت WJMSC (DMEM الجلوكوز منخفضا، و 10٪ FCS و 100 U / مل البنسلين + 100 ميكروغرام / مزيج الستربتومايسين مل).
- البذور جميع الخلايا في 75 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة. تغيير المتوسطة بعد 24 ساعة مع 12 مل الكامل مستنبت WJMSC. استبدال المتوسطة كل 2 - 3 أيام. خلايا ينبغي أن تصل إلى 70-80٪ التقاء في حدود 2 أسابيع. مرور عند WJMSC تصل 70-80٪ التقاء (انظر القسم 1.4).
- التوسع في العظام المستمدة من نخاع MSC (BMMSC):
- ذوبان الجليد قارورة من P2 BMMSC عن طريق وضع في 37 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة. إضافة تعليق BMMSC إلى أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على MSCGM. تخلط جيدا من قبل pipetting.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح طاف تماما.
- Resuspend الخلايا في 1 مل MSCGM وعد الخلايا باستخدام haemocytometer أو عداد الخلايا الرقمية مثل cellometer.
- خلايا البذور في 75 سم 2 قوارير الثقافة في كثافة 5،000 - 6،000 خلايا لكل سم 2 في 12 مل MSCGM. تغيير المتوسطة بعد 24 ساعة مع 12 مل MSCGM. خلايا تغذية مع 12 مل MSCGM كل 2 - 3 أيام.
- مرور عند BMMSC تصل 70-80٪ التقاء (انظر القسم 1.4). خلايا يحمل مورفولوجيا أرومي ليفي (الشكل 1Aii).
- لالركض للجنة السلامة البحرية، بيليه resuspend في 3 مل الثقافة المتوسطة. إضافة 11 مل مستنبت إلى ثلاث قوارير ثقافة منفصلة 75 سم 2. إضافة 1 مل خلية التعليق على كل قارورة الثقافة (1: 3 تقسيم). WJMSC المرور وBMMSC 3 مرات (P3) قبل استخدامها في المقايسات شارك في الثقافة.
- لبذر EC أو MSC في المقايسات التصاق - راجع أقسام 2 و 3.
- في مرور 3 فصل MSC كما هو موضح في القسم 1.4. نضح وطاف resuspend في 3 مل الجليد الباردة CryoSFM. ماصة 1 مل aliquots من تعليق خلية إلى 1.5 مل cryovials الجليد الباردة. وضع cryovials في حاوية التجمد.
- تخزين الحاويات في -80 درجة CO / N. نقل إلى النيتروجين السائل. قارورة ذوبان MSC (اتبع الخطوات من 1.3.1 - 1.3.6). في resuspend MSC في 5 مل مستنبت (اختيار الوسيلة المناسبة لWJMSC أو BMMSC) والبذور إلى 25 سم 2 قارورة.
2. إنشاء غشائي-الوسيطة الخلايا الجذعية المشارك الثقافات على Ibidi Microslides
- يعرض للتريبسين ومتموجة 25 سم 2 قارورة من EC (~ 1.5 × 10 6 خلايا؛ والقسم 1.4). في resuspend EC في 380 ميكرولتر MSCGM (1 × 25 سم 2 قارورة سوف البذور اثنين من 6 قنوات microslides Ibidi (~ 1.25 × 10 5 / قناة)، لفحوصات التصاق كل خلية تايعبوة يتم تربيتها في MSCGM). إضافة 30 ميكرولتر من EC التعليق على كل قناة (هذا سوف تغطي منطقة النمو من خلال العمل الشعري). احتضان Ibidi شريحة مجهرية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة.
- إضافة 140 ميكرولتر MSCGM إلى كل قناة وثم نضح تشغيله. كرر مرتين ليصبح المجموع 3 يغسل. إضافة 140 ميكرولتر MSCGM ووضعه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
- للمشاركة في الثقافات فصل MSC (القسم 1.4). إجراء تعداد خلايا باستخدام haemocytometer أو cellometer. ضبط تركيز MSC إلى 1.5 × 10 5 خلية / مل.
- نضح المتوسطة الزائدة من القنوات Ibidi (ولم يتبق سوى منطقة نمو القناة في المتوسط). إضافة 30μl من MSC تعليق على القنوات Ibidi. نضح المتوسطة أن طرد من منطقة نمو القناة وإضافة 30 ميكرولتر آخر من MSC تعليق. أكرر مرة أخرى ثم ضع شريحة مجهرية Ibidi في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 </ الفرعية> لمدة 1 ساعة.
- إضافة 140 ميكرولتر MSCGM إلى كل قناة وثم نضح تشغيله. كرر مرتين ليصبح المجموع 3 يغسل. إضافة الحجم النهائي من 140 ميكرولتر MSCGM إلى كل قناة ووضعه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
- ذوبان الجليد 1 × 10 5 U / مل الأسهم TNFα وتمييع 1: 1،000 في MSCGM إلى تركيز النهائي من 100 U / مل (أي ما يعادل ~ 10 نانوغرام / مل). إجراء التخفيف المتسلسل عن طريق تمييع 100 U / مل TNFα التي كتبها 01:10 في MSCGM للحصول على 10 U / مل. تمييع 10 U / TNFα مل من 1:10 في MSCGM الحصول على 1 U / مل.
- علاج قنوات مع TNFα عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات قبل الفحص. سوف التقلبات في درجات الحرارة خلال العلاج خلوى يغير أنماط التوظيف العدلات ملاحظتها. إضافة MSCGM جديدة لقنوات غير المعالجة.
3. إنشاء غشائي-الوسيطة الخلايا الجذعية المشارك الثقافات على الفلاتر
- فصل WJ أو BMMSC كما هو موضح في القسم 1.4. resuspend الكريةفي 1 مل MSCGM. إجراء الخلايا خلايا باستخدام haemocytometer أو cellometer.
- ضبط مستوى الصوت بحيث التركيز النهائي هو 5 × 10 5 MSC في 500 ميكرولتر من MSCGM.
- باستخدام ملقط معقم عكس 6 جيدا، 0.4 ميكرومتر مرشحات PET Transwell ومكان في علبة معقم.
- البذور 5 × 10 5 MSC على السطح الخارجي للمرشحات. احتضان المرشحات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة.
- جمع وسائل الاعلام من السطح الخارجي للمرشح. حساب عدد غير ملتصقة MSC في وسائل الإعلام. إعادة عكس المرشحات باستخدام ملقط معقم ووضعه في مطابقة وحة 6 جيدا تحتوي على 3 مل MSCGM.
- إضافة 2 مل من MSCGM على السطح الداخلي للمرشح (الشكل 1B). وضع في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة. يعرض للتريبسين ومتموجة 25 سم 2 قارورة من EC (الشكل 1Ai؛ والقسم 1.4).
- و resuspend EC في 8 مل MSCGM (1 س 25cm 2 قارورة وايليرة لبنانية البذور أربع مرشحات 6 جيدا. ~ 5 × 10 5 EC / فلتر). نضح المتوسطة من أعلى وأسفل من المرشحات التي يسهل اختراقها. إضافة MSCGM 3 مل الطازجة في أقل غرفة (تحت التصفية). إضافة 2 مل EC تعليق على السطح الداخلي للكل مرشح. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
- نضح المتوسطة ليغسل غير ملتصقة EC واستبدال مع MSCGM الطازجة. إعداد موازية EC مرشحات أحادية الثقافة عن طريق بذر خلايا على السطح الداخلي دون الأولى MSC البذر. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
- تأكد من أن أحادي الطبقة EC هي متكدسة ويحتوي على أي ثغرات. الطبقات الوحيدة الفرعية متموجة لا يمكن أن تستخدم لفحوصات التصاق (الشكل 1B).
- علاج الغرف العلوية والسفلية من المرشحات مع 1 أو 10 أو 100 U / مل TNFα (أي ما يعادل ~ 10 نانوغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات قبل الفحص (الموصوفة في القسم 2).
4. عزل الكريات البيضاء
- اتخاذ الوريديالدم من المتطوعين الأصحاء وقسامة على الفور في أنابيب EDTA. أنابيب عكس بلطف لخلط.
- طبقة 2.5 مل Histopaque 1077 على 2.5 مل Histopaque 1119 في 10 مل القاع جولة أنبوب. طبقة 5 مل الدم كله على التدرج Histopaque. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 40 دقيقة في RT.
- الحصاد العدلات المحيطية النوى (PMN) في واجهة Histopaque 1077 و1119 (فوق طبقة كرات الدم الحمراء). ضع في 10 مل القاع جولة أنبوب وجعل ما يصل إلى 10 مل مع PBSA. عكس بلطف أنبوب والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- تمييع 7.5٪ BSA حل 1:50 في 100 مل PBS (مع الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم) إلى تركيز النهائي من 0.15٪ (ث / ت. PBSA). نضح وطاف resuspend في 10 مل PBSA. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- Resuspend في 1 مل PBSA. اتخاذ قسامة 20 ميكرولتر من تعليق خلية وإضافة إلى 380 ميكرولتر PBSA (01:20 تمييع). عد الخلايا باستخدام haemocytometer أو cellometer. تمييع للبغية دراسته واقراره المطلوبةntration (1 × 10 6 / مل للمرشحات Transwell وIbidi شريحة مجهرية) في PBSA. الحفاظ على تعليق العدلات في RT حتى الفحص.
5. تجميع نظام تدفق
- إعداد نظام تدفق كما هو مبين في الشكل 1C. بدوره على سخان وتعيين إلى 37 درجة مئوية. نعلق حقنة 20 مل (إزالة الغطاس) وحقنة 5 مل إلى 3 في اتجاه الصنبور. إرفاق الصنبور إلى غرفة البرسبيكس باستخدام شريط من micropore.
- قياس وقطع قطعة طويلة من السيليكون 2/4 مم (سميكة) أنابيب أن ما يقرب المسافة بين صمام و3 في اتجاه الصنبور. قطع على 8-10 ملم قطعة طويلة من 1/3 ملم (رقيقة) أنابيب وتضاف إلى واحدة من نهاية الأنبوب سميكة. نولي الجانب أنابيب سميكة على 3 في اتجاه الصنبور.
- قم بتوصيل الطرف أنابيب رقيقة على ميناء من microvalve 3 في اتجاه الإلكتروني. هذا هو "خزان غسل". قطع 6-8 ملم قطعة طويلة من الأنابيب السراء والضراء.
- إدراج أنابيب رقيقة في واحدة من نهاية الأنبوب سميكة. توريمنظمة العمل ضد الجوع أنابيب سميكة تنتهي على حقنة 2 مل (إزالة الغطاس).
- قم بتوصيل الطرف أنابيب رقيقة من حقنة 2 مل على منفذ على microvalve الإلكترونية لجعل "عينة الخزان". ربط صمام إلى غرفة تدفق مرشح من خلال قياس وقطع قطعة طويلة من الأنابيب رقيقة وهذا هو المسافة بين microvalve ومركز للمرحلة المجهر.
- لنموذج شريحة مجهرية، إرفاق 8-10 ملم قطعة من أنبوب سميك إلى نهاية أنابيب رقيقة. وضع L على شكل موصل إلى نهاية أنابيب سميكة. وهذا الاتصال إلى شريحة مجهرية. لنموذج الترشيح، إرفاق 8-10 ملم قطعة من بورتكس الخط الأزرق المانومتر ربط أنابيب إلى نهاية أنابيب رقيقة.
- ضع نهاية أنابيب رقيقة على microvalve. هذا هو الإخراج المشترك للغسل وعينة الخزانات. ملء الخزانات مع PBSA. أنابيب الوزراء من قبل تتدفق PBSA من خلالهم لإزالة أي فقاعات الهواء.
- إرفاق المانومتر الأنابيب إلى 29 ملم (50 مل) الزجاج الصورةyringe. رئيس الوزراء حقنة عن طريق ملء مع 10 مل PBSA. عكس الحقنة بحيث نهاية متصلا أنابيب تواجه صعودا وطرد جميع فقاعات الهواء. الملء مع 5 مل PBSA.
- لنموذج شريحة مجهرية فقط، إرفاق 10-12 مم قطعة من أنبوب سميك إلى نهاية الأنبوب المانومتر مما يؤدي إلى الحقنة الزجاج. وضع L على شكل موصل إلى نهاية أنابيب سميكة. وضع حقنة زجاجية إلى ضخ حقنة للتسريب / الانسحاب.
- حساب معدل تدفق الملء (Q) المطلوبة لتوليد إجهاد القص الجدار المطلوب (τ ث في باسكال، باسكال) 0.1 (الفلاتر Transwell) با أو 0.05 (microslides Ibidi) با باستخدام الصيغ التالية:
γ ث = (6.Q) / (WH 2)
τ = n.γ
حيث ث = الداخلي العرض وح = العمق الداخلي للقناة التدفق. ن = اللزوجة من الحل المتدفقة. PBSA هو ن = 0.7 mPa.s. لوحة تصفية موازية غرفة التدفق، والعرض (ث) 4 مم وعمق (ح) هو 0.133 ملم. دepth من الغرفة يمكن أن تختلف قليلا بسبب الاختلافات في سمك طوقا بارافيلم المستخدمة. لشريحة مجهرية Ibidi، والعرض هو 3.8 مم وعمق 0.4 مم.
ملاحظة: نظرا للاختلافات في أبعاد قناة التدفق، وديناميات التقاط نستخدم الضغوط القص المختلفة لنموذج شريحة مجهرية مقارنة مع نموذج فلتر 6.
6. إعداد لأعلى لوحة موازية غرفة تدفق دمج الفلاتر
- قطع قطعة من بارافيلم (نفس حجم ساترة الزجاج) باستخدام قالب معدني. قطع فتحة 20 × 4 مم في بارافيلم (لإنشاء قناة التدفق) باستخدام قالب معدني. استخدام طوقا للاحتفال قناة التدفق على ساترة الزجاج.
- محاذاة حواف فلتر 6 جيدا على ساترة الزجاج. تأكد من أن مرشح يغطي علامات قناة التدفق. قطع بعناية من مرشح باستخدام مشرط نوع 10A.
- تغطية بعناية فلتر مع طوقا بارافيلم، وضمان أن القناة تدفقفتحة في منتصف فلتر (1D الشكل). استخدام قطعة من النسيج نظيفة وطرد أي فقاعات.
- ضع ساترة في عطلة لوحة أسفل من الغرفة تدفق البرسبيكس. ضع أعلى لوحة البرسبيكس فوق الجزء العلوي من طوقا والمسمار لوحات معا (1D الشكل).
- تحويل 3 في اتجاه الصنبور للسماح غسل عازلة (PBSA) لتتدفق من خلال الصمام. ربط المانومتر أنابيب إلى ميناء مدخل من أعلى لوحة Persex. تشغيل PBSA من خلال قناة تدفق للسماح فقاعات بالمرور.
- قم بتوصيل أنابيب المانومتر من ضخ حقنة في منفذ منفذ لوحة البرسبيكس. تعيين ضخ حقنة لإعادة ملء وتشغيل الصحافة. تنظيف أي PBSA الذي يسيل على طبق العليا من الغرفة.
- ضع دائرة على مرحلة مجهر مقلوب على النقيض من المرحلة. ضبط التركيز على تصور EC فوق مرشحات (الشكل 1B).
7. إعداد Microslides لتدفق </ P>
- ضع شريحة مجهرية على خشبة المسرح من المجهر النقيض من المرحلة المقلوب. قم بتوصيل موصل L على شكل بمنفذ مدخل قناة. تشغيل PBSA من خلال قناة التدفق.
- ضع L على شكل موصل من ضخ حقنة في منفذ مخرج القناة. تعيين ضخ حقنة لإعادة ملء وتشغيل الصحافة. تنظيف أي PBSA الذي يسيل على شريحة مجهرية. ضبط التركيز على تصور أحادي الطبقة EC.
8. الإرواء من خلايا الكريات البيضاء أكثر من غشائي
- ضع 2 مل من العدلات المنقى إلى الخزان عينة وترك لتدفئة لمدة 2 دقيقة. غسل البطانة مع PBSA لمدة 2 دقيقة.
- تحويل صمام ON إلى يروي العدلات على البطانة. تقديم البلعة العدلة لمدة 4 دقائق. تحويل OFF صمام ويروي PBSA من الخزان غسل للفترة المتبقية من التجربة.
- التأكد من أن فقاعات الهواء لا تمر من خلال قناة تدفق في أي وقت خلال الفحص حيث سيؤدي ذلك إلى تعطيل monolay ECإيه والسبب مفرزة من العدلات ملتصقة.
9. تسجيل العدلات التقاط والسلوك
- سجل العدلات التوظيف سواء أثناء تدفق العدلات أو ما بعد نضح.
- جعل جميع التسجيلات الرقمية لا يقل عن 5 - 10 حقول في وسط قناة التدفق. التعرف على مركز للقناة عن طريق تحريك الهدف إلى حافة القناة عند مدخل الميناء وتحديد منتصف الميناء.
- لتسجيل خلال تدفق العدلات، واتخاذ الصور من حقل واحد كل 10 ثانية لمدة 1 دقيقة. تحرك على طول القناة وتسجيل حقل آخر لمدة 1 دقيقة. كرر لمدة البلعة.
- لتسجيل ما بعد نضح، وجعل 10 ثانية تسجيل من 5 - 10 الحقول أسفل وسط القناة تدفق لتقييم سلوك الكريات البيض (عادة 2 دقيقة بعد نهاية البلعة العدلات). التقاط صور كل ثانية ضمن فترة 10 ثانية. وهذا يسمح الوقت الكافي لالتقاط من تدفق وسلوك neutro ملتصقةفيلس لتحليلها.
- تسجيل حقل واحد تحتوي على 10 على الأقل العدلات transmigrated لمدة 5 دقائق، مع أخذ الصور كل 30 ثانية. وهذا يمكن أن تستخدم لحساب سرعة خلايا هاجر (إما فوق أو تحت البطانة).
- تسجيل سلسلة أخرى من 10 حقول ثانية (عادة 9 دقيقة بعد التروية). وهذا يسمح العدلات الوقت لتهاجر من خلال أحادي الطبقة البطانية.
- وقف ضخ حقنة وإزالة الأنبوب. تفكيك غرفة التدفق وشطف الخزان عينة والأنابيب. أكرر للمرشحات لاحقة / قنوات شريحة مجهرية.
تحليل 10. من خلايا الدم البيضاء التوظيف والسلوك
- حساب عدد العدلات في كل حقل أثناء التسجيلات ثانية 10 في نقطة زمنية 2 دقيقة. يجب أن تكون جميع خلايا موجودة في أول حقل الثاني من أجل لفرزها. يتم تضمين الخلايا التي هي جزئيا في هذا المجال على 2 الجانبين (على سبيل المثال، أعلى / يمين الحدود اليد) من مجال الرؤية فيالتهم، طالما أنها لا تزال في الميدان لمدة 10 ثانية كاملة.
- حساب متوسط عدد العدلات ملتصقة لكل حقل. قياس الطول والعرض من حقل المسجلة. حساب مساحة الحقل. حساب عدد الحقول هناك في 1 مم 2. مضاعفة عدد العدلات متوسط من قبل عدد من الحقول في 1 مم 2.
- حساب إجمالي عدد العدلات perfused لبضرب كمية من العدلات perfused ل(على سبيل المثال، 2 × 10 6 / مل * Q [على سبيل المثال، 0.0999 مل / دقيقة لوحة موازية تدفق غرفة]) قبل مدة من البلعة (على سبيل المثال، 4 دقيقة ).
- تقسيم العدلات العد / مم 2 من إجمالي عدد العدلات perfused للتحديد العدد الكلي للخلايا التي انضمت (ملتصقة خلية / ملم 2/10 6 perfused ل).
- تقييم ما إذا كانت ملتصقة العدلات والمتداول، تمسكا راسخا أو transmigrated (التكميلي فيديو 1 و 2).
- Aالمتداول العدلات هي مرحلة مشرقة وسوف تتحرك ببطء على طول البطانية أحادي الطبقة (1 - 10 ميكرون / ثانية؛ التكميلية فيديو 1).
- الخلايا الملتصقة بحزم هي مرحلة مشرقة ومنضمة إلى السطح EC، إما تبقى ثابتة (أي لا تتحرك أثناء التسجيل) أو خضعوا لتغيير شكل والمهاجرة على سطح EC (الشكل 1Ei).
- والعدلات transmigrated هي المرحلة المظلمة وتحت طبقة EC (الشكل 1Eii).
- حساب نسبة الخلايا الملتصقة التي يتم المتداول، الثابتة وtransmigrated. بدلا من ذلك، يمكن التعبير عن السلوك العدلات حيث بلغ إجمالي أعداد الخلايا التي تظهر السلوكيات المختلفة من خلال تطبيق نفس الصيغة المستخدمة لحساب مجموع التصاق (كما هو موضح في الخطوات 10،6-10،7).
- علامة الحافة الأمامية من العدلات المتداول. بمناسبة الحافة الأمامية من نفس الخلية في نهاية تسلسل 10 ثانية. رسم خط الرهانوين 2 نقطة وقياس المسافة أن الخلية قد سافر.
- تقسيم هذه القيمة من خلال مدة التسجيل التي الخلية هو المتداول (أي 10 ثانية). محاولة لتحديد العدلات التي هي في مجال لكامل فترة 10 ثانية.
- لحساب سرعة العدلات المهاجرة على سطح (على شكل تغير المرحلة مشرق) أو تحت البطانة (المرحلة الظلام) استخدام 5 دقائق تسجيل (فيديو التكميلي 2).
- رسم الخطوط العريضة للخلايا هاجر في بداية تسلسل وتتبع تحركاتهم في جميع أنحاء التسلسل. جعل علما مواقف X و Y من النقطه الوسطى في كل فاصل 1 دقيقة لكل خلية. طرح قيم X و Y الموقف من الصورة الأولى من سلسلة من القيم في الصورة الثانية. ويستند هذا على نظرية فيثاغورس ".
- طرح القيم من الصورة الثانية من الصورة الثالثة. نفعل ذلك لجميع الصور في التسلسل. مربع رانه X و Y القيم وإضافتها معا.
- الجذر التربيعي القيمة الناتجة. حساب سرعة لكل خلية عن طريق حساب متوسط سرعات محسوبة في كل فاصل زمني دقيقة. المسار 10 هاجر العدلات وحساب السرعة المتوسطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في البداية، قمنا بتحليل تأثير تحفيز EC مع TNFα على تجنيد العدلات من تدفق باستخدام نموذج شريحة مجهرية Ibidi (القسم 7-9). في غياب TNFα، القليل إذا كان أي العدلات الالتزام بها أحادي الطبقة البطانية (الشكل 2A). وكان من المتوقع هذا، كما لم يعالج / يستريح EC لا تعبر عن الجزيئات اللازمة التصاق (selectins) أو كيموكينات لدعم ملزمة 25،26. في المقابل، خلوى التحفيز زيادة كبيرة العدلات الانضمام إلى البطانة في جرعة تبعا للطريقة (الشكل 2A). التصاق يبقى عادة مستقرة على مدى الفحص. ملزمة من الكريات البيض إلى البطانة غير المعالجة يشير إلى أن إما يتم تنشيط EC (أي ملوثة LPS أثناء عملية الثقافة) و / أو العدلات تم تفعيلها خلال عملية العزل. في الواقع، وقد تبين LPS لزيادة التعبير عن E-selectin، ICAM-1 و VCAM-25-27 يناير على سطح EC، مما يتيح لهم ربط العدلات.
عند تحليل سلوك العدلات تجنيد نلاحظ عادة انخفاضا تعتمد على الجرعة في نسبة العدلات المتداول (الشكل 2B) مع جرعة زيادة تعتمد مصاحبة في نسبة العدلات المهاجرة من خلال أحادي الطبقة البطانية (الشكل 2C). في جرعات أقل من TNFα التحفيز (1 U / مل) نسبة أكبر من العدلات تظهر المرحلة مشرق مشيرا إلى أن أنها ملحقة السطح القمي من البطانة (الشكل 2B). في المقابل، في 10 و 100 U / مل (جرعات أعلى) ما يقرب من 40٪ من العدلات تجنيد تظهر مرحلة الظلام في 2 دقيقة مشيرا إلى أن هذه الخلايا قد هاجرت من خلال أحادي الطبقة البطانية وهم تحت البطانة (الشكل 2C). العدلات قادرة على الهجرة من خلال EC ضمن 1 - 2 دقيقة، مع التهجير الوصول ممستويات aximal في ~ 10min بعد نضح 28. نحن هنا لوحظت زيادة في العدلات التهجير من 40٪ في 2 دقيقة إلى 60٪ بحلول 9 دقيقة بعد نضح (الشكل 2C). لاحظنا أي تأثير تركيز TNFα على سرعة المتداول (~ 3 ميكرون / ثانية) أو المهاجرة (~ 10-12 ميكرون / دقيقة) العدلات.
في النموذج القائم على التصفية، زيادة TNFα التحفيز العدلات التصاق بطريقة تعتمد على الجرعة مماثلة لتلك التي شوهدت باستخدام نموذج شريحة مجهرية Ibidi (الشكل 3A). من حيث السلوك، كان العدلات المتداول تتأثر TNFα جرعة (الشكل 3B)، في حين لوحظ وجود زيادة تعتمد على الجرعة في نسبة هجرة (الشكل 3C). في هذه السلسلة من التجارب لاحظنا أي تأثير كبيرا من الوقت على العدلات التهجير (الشكل 3C).
ونحن نقدم الأساليب على كيفية توليد مختلفين يبني ثقافة مشتركة، كل منالتي وضعت للإجابة على أسئلة محددة. في نموذج شريحة مجهرية Ibidi، EC وMSC هي المستزرعة في أحادي الطبقة واحدة على اتصال مباشر مع بعضها البعض. هذا النموذج هو مفيد لدراسة تأثير الحقن العلاجية للجنة السلامة البحرية في الدم والتكامل في وقت لاحق في أحادي الطبقة EC. في المقابل في النموذج القائم على التصفية، EC وMSC هي مثقف على طرفي نقيض من مرشح على مقربة لكن ليس بالضرورة في الاتصال المباشر. هذا أكثر شبها الأنسجة، مع الخلايا البطانية تشكيل أحادي الطبقة التي تمثل الأوعية الدموية، وMSC يقيم في حجرة تحت البطانة. وهذا يسمح لنا لدراسة آثار MSC-الأنسجة المقيمين على استجابة EC لتحفيز خلوى.
بناء على تجاربنا، نلاحظ أن تجنيد العدلات القصوى والهجرة transendothelial يحدث عندما يتم تحفيز EC مع 100 U / مل TNFα. على هذا النحو، وقد استخدمنا هذا التركيز على دراسة تأثير MSC شارك في ثقافةعلى تجنيد البطانية العدلات من التدفق. هنا، نقدم بيانات لBMMSC في ثقافة مشتركة مع EC باستخدام شريحة مجهرية والنماذج القائمة على مرشح مثل ذلك، أنواع أخرى من MSC يمكن أيضا أن تدرس، WJMSC. في كلا النموذجين وجود BMMSC خفضت بشكل ملحوظ العدلات التصاق إلى EC بالمقارنة مع EC مثقف وحدها (الشكل 4A). وكان شارك في ثقافة أي تأثير على سلوك العدلات تجنيدهم، مع مستويات مماثلة من المتداول والتهجير لوحظ على EC مثقف وحدها أو مع MSC (الشكل 4B و C). وهكذا، يمكن MSC تعديل استجابة EC لتحفيز خلوى، الذي يقمع قدرتها على دعم التوظيف العدلات من التدفق.
الشكل 1. إنشاء EC-MSC شارك في ثقافة وتحليل التوظيف العدلات باستخدام التصاق الفحص القائمة على التدفق. (A) قوية> صورة مجهرية من (ط) EC الابتدائية و (ثانيا) مرور 3 BMMSC نمت على قوارير زراعة الأنسجة. (B) صورة مجهرية من EC وMSC المثقف في 6 جيدا Transwell إدراج مرشح. (C) رسم تخطيطي لنظام الارواء المستخدمة لتوليد التدفق. (D) تمثيل تخطيطي للغرفة موازية لوحة تدفق التصفية. (E) صورة مجهرية من (ط) ملتصقة بقوة (FA) و (ثانيا) transmigrated (TM) العدلات يلي التوظيف من تدفق لEC حفز مع 100 U / مل TNFα وتؤخذ الصور C و D من الشكلين 2 و 3 في طرق في علم الأحياء الجزيئي:. الاتجار T-الخلية، 2010، ص 53-54 28 مع اذن من النوع الوثاب العلوم وإدارة الأعمال وسائل الإعلام الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
gether.within صفحة = "دائما"> 
وقد حفز الشكل 2. العدلات التوظيف من تدفق لTNFα حفز-EC باستخدام microslides Ibidi EC مع زيادة تركيزات TNFα. (0-100 U / مل) لمدة 4 ساعة. تم perfused لبلعة 4 دقائق من العدلات على أحادي الطبقة EC في 0.05 بنسلفانيا (A) العدلات التصاق تقييمها في 2 دقيقة. أظهر ANOVA تأثير كبير من العلاج TNFα على التصاق العدلات، ف <0.01. تم تقييم السلوك العدلات في 2 و 9 دقيقة وكنسبة مئوية من الخلايا الملتصقة التي كانت (B) المتداول أو (C) transmigrated. أظهر ANOVA تأثير كبير من العلاج TNFα على سلوك العدلات ملتصقة، ص <0.001. في C، أظهرت ANOVA وكبيرا من الوقت على transmigrated العدلات ف <0.01. البيانات يعني ± SEM من ن = 3 التجارب. * P <0.05 و**ف <0.01 مقارنة مع unstimulated (0 U / مل) EC السيطرة من قبل Dunnett بعد الاختبار. ## ص <0.01 و ### p <0.001 مقارنة مع 1 U / مل EC عند نقطة نفس الوقت عن طريق Bonferroni ما بعد الاختبار.
وقد حفز الشكل 3. العدلات التوظيف من تدفق لTNFα حفز-EC باستخدام الفحص القائم على تصفية EC مع زيادة تركيزات TNFα. (0-100 U / مل) لمدة 4 ساعة. تم perfused لبلعة 4 دقائق من العدلات على أحادي الطبقة EC عند 0.1 بنسلفانيا (A) العدلات التصاق تقييمها في 2 دقيقة. أظهر ANOVA تأثير كبير من العلاج TNFα على التصاق العدلات، ص <0.001. تم تقييم السلوك العدلات في 2 و 9 دقيقة وكنسبة مئوية من الخلايا الملتصقة التي كانت (B) المتداول أو (C) transmigrated. في C، ANOVA SHOالزواج من تأثير كبيرا من الوقت والعلاج خلوى على التهجير العدلات، ف <0.05. البيانات يعني ± SEM من ن = 3 التجارب. ** ف <0.01 و*** P <0.001 مقارنة unstimulated (0 U / مل) EC السيطرة من قبل Dunnett ما بعد الاختبار. # ف <0.05 مقارنة مع 1 EC U / مل في نقطة زمنية نفس طريق البريد Bonferroni -test.
الشكل 4. العدلات التوظيف من تدفق لTNFα حفز-EC-BMMSC المشترك الثقافات. وكان BMMSC المشارك مثقف مع EC لمدة 24 ساعة قبل التحفيز مع 100 U / مل TNFα لمدة 4 ساعة. تم perfused لبلعة 4 دقائق من العدلات على أحادي الطبقة EC في 0.05 با ل(A، C، E) microslides و 0.1 با ل(B، D، F) مرشحات. تم تقييم (AB) العدلات التصاق في 2 دقيقة. تم تقييم السلوك العدلات في 2 و 9 مفي ويعبر عنه كنسبة مئوية من الخلايا الملتصقة التي كانت (CD) أو المتداول (EF) transmigrated. في C و D، أظهرت ANOVA تأثير كبير من الشروط الثقافة على العدلات المتداول، ف <0.05. في E و F، أظهرت ANOVA تأثير كبير من الوقت على هجرة العدلات، ف <0.05. ومع ذلك، لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في التهجير بين العلاجات الفردية عن طريق Bonferroni بعد الاختبار. البيانات يعني ± SEM من ن = 5 التجارب. * P <0.05 مقارنة مع الأحادية EC من قبل الاقتران اختبار t أو Bonferroni ما بعد الاختبار.
وقد حفز فيديو التكميلي 1. تحليل السرعات المتداول العدلات. EC مثقف على فلتر Transwell مع 100 U / مل TNFα لمدة 4 ساعة. تم perfused لبلعة من العدلات على EC للالمتوسطة 4min. تسلسل رقمي الممثلين واحد الحقل 10 ثانية تؤخذ 2دقيقة بعد نضح. التغير في الموقف من العدلات المتداول واحدة من بداية إلى نهاية تسلسل 10 ثانية يمكن استخدامها لحساب سرعة في الذي العدلات هو المتداول.
وقد حفز فيديو التكميلي 2. تحليل السرعات هجرة العدلات. مثقف EC على فلتر Transwell مع 100 U / مل TNFα لمدة 4 ساعة. تم perfused لبلعة من العدلات على EC لمدة 4 دقائق. تسلسل رقمي الممثلين واحد الحقل 5 دقائق لتتبع حركة العدلات transmigrated. وهذا يمكن أن تستخدم لحساب السرعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا وصف اثنين في المختبر "الأوعية الدموية" نماذج لدراسة توظيف تعميم العدلات من قبل البطانة الملتهبة. والميزة الرئيسية لهذه النماذج هي القدرة على تحليل كل خطوة في سلسلة التصاق الكريات البيض في النظام، كما أن تحدث في الجسم الحي. وقد لاحظنا سابقا زيادة تعتمد على الجرعة في العدلات التصاق لوالتهجير من خلال حفز TNFα EC 9،29. وصفنا أيضا كيف يمكن تكييفها كلا النموذجين لدراسة الآثار المترتبة على خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض. هنا، كان MSC شارك في تربيتها مع EC في شريحة مجهرية Ibidi أو على طرفي نقيض من مرشح يسهل اختراقها. وهذا يسمح كل من أنواع الخلايا على التواصل مع بعضها البعض، وبالتالي تعديل النمط الظاهري واستجابة كل منهما. لقد أظهرنا هنا، وفي دراسات سابقة 23، أن وجود MSC قمعها العدلات التصاق لTNFα حفز-EC. وهذا يدل على أن الخلايا اللحمية تعديل الاستجابة ECلالسيتوكينات وبالتالي يغير توظيف تعميم الكريات البيض.
بالإضافة إلى النماذج المذكورة أعلاه، Biochips Cellix، لوحات Bioflux وGlyotech لوحة موازية غرف تدفق هي تجاريا المتاحة أنظمة قناة تدفق التي توفر سطحا لزراعة البطانة ومراقبة التوظيف. في جميع النظم، ينبغي النظر في معايير معينة في حين إنشاء الثقافات البطانية وإجراء فحوصات التصاق القائم على التدفق، وبعضها أبرز أدناه وفي تقارير سابقة 30،31. أي العوامل المضادة للالتهابات، مثل الهيدروكورتيزون، والتي قد تؤثر على ردود خلوى يجب حذف من المتوسطة لمدة من الثقافة والفحص 18،29. عند استخدام Ibidi شريحة مجهرية ضمان عدم وجود فقاعات الهواء الموجودة في قناة التدفق خلال ثقافة EC وهذه سوف تعطل أحادي الطبقة EC. وينبغي تأكيد على سلامة أحادي الطبقة البطانية قبل cytokiشمال شرق المعاملة، كما العدلات وربط الثغرات في أحادي الطبقة حيث المغلفة BSA على شريحة مجهرية / التصفية. ومن الضروري أيضا لضمان أن EC يتم الاحتفاظ في 37 ° C في جميع أنحاء خلوى التحفيز لTNFα هو درجة الحرارة حساسة ولها تأثير القصوى عند 37 درجة مئوية فقط. لفحص تدفق نفسه، حدد غسل العازلة المناسب، ونحن عادة استخدام PBSA لفحوصات قصيرة (أقل من 30 دقيقة) وM199 المتوسطة تستكمل مع BSA (0.15٪) لفحوصات أطول (1-48 ساعة) 30،31. وأخيرا ضمان عدم وجود فقاعات الهواء الموجودة في قناة تدفق أثناء الفحص لأن هذا يعطل معدل التدفق، والأضرار أحادي الطبقة EC وينشط العدلات ملتصقة.
واحدة من المزايا الرئيسية للمتعددة الخلايا في المختبر النماذج المبينة هنا هي قدرتها على النسخ المتماثل في الجسم الحي التفاعلات بين EC وخلايا انسجة. ومن الصعب عزل آثار مكونات انسجة محددة في الجسم الحيوعلى تعديلها في الطريقة التي تسيطر عليها. في نماذجنا، والخلايا اللحمية يمكن التلاعب بها لتوضيح كيفية التواصل مع EC والتأثير على العملية الالتهابية في الصحة والمرض. على سبيل المثال، وذلك باستخدام تكنولوجيا سيرنا أظهرنا سابقا أن إنتاج IL-6 التي كتبها MSC خلال التعاون ثقافة وضرورية لآثار المثبطة للمناعة من 23. كل نموذج يمكن استخدامها لمعالجة مسائل محددة أي تأثير خلايا الأنسجة اللحمية المقيمين (نموذج قائم على فلتر) أو خلايا انسجة تدار علاجيا (microslides Ibidi وغيرها من النظم المتاحة تجاريا) على تجنيد الكريات البيض. في كلتا الحالتين قمنا معاير مختلفة أنواع الخلايا اللحمية لضمان قدرتها على الاستمرار وإقامة نسبة مناسبة من خلايا انسجة إلى EC لتقييم الآثار على التوظيف 15،25. وبالمثل يجب أن يكون مستنبت متوافق مع كل نوع من الخلايا إدراجها في النموذج. في أيدينا وعادة ما تجرى المشترك الثقافات في الخلية انسجة مedium 11،18،23،31.
باستخدام النموذج القائم على التصفية، لقد أظهرنا سابقا أن الخلايا اللحمية مختلف تعدل قدرة EC لدعم التصاق وهجرة الكريات البيض بطريقة الأنسجة محددة وأن هذه الآثار تصبح المتغيرة في الأمراض المزمنة 3. وأدى هذا إلى مفهوم أن الخلايا اللحمية تأسيس "رموز عنوان" الأنسجة محددة التي تنظم بنشاط تجنيد الكريات البيض إلى الأنسجة الملتهبة 24. تم تصميم هذه النماذج خصيصا لدراسة المراحل الأولى من التوظيف بتفصيل كبير ولكن غير قادرين على دراسة الهجرة لاحقة داخل الفضاء تحت البطانة (أي بعيدا عن البطانة في الأنسجة). سوف متعددة الخلايا، بنيات متعددة الطبقات 3D مثل ثابت جل الكولاجين فحص 12،32 تكون أكثر ملاءمة لدراسة هذه المراحل الأخيرة من التجنيد.
لدينا نماذج التصاق القائم على تدفق متعددة الاستعمالات للغاية. لدينا قصرcribed استخدامها في سياق التوظيف العدلات، ولكن مجموعات فرعية الكريات البيض الأخرى يمكن أن يتم التحقيق بطريقة مماثلة. وقد استخدمنا أيضا نظام شريحة مجهرية Ibidi للتحقيق في تجنيد تعميم MSC بواسطة EC 23، وعما إذا كان هذا يحدث من خلال نفس التصاق سلسلة التقارير عن الكريات البيض. وبالمثل يمكن أن تستخدم هذه النماذج لدراسة توظيف ودمج خطوط الخلايا السرطانية النقيلي، وآثارها اللاحقة على الاستجابات البطانية والتوظيف الكريات البيض. بدلا من ذلك، يمكن تكييف النموذج القائم على مرشح لدمج أنواع مختلفة من الخلايا اللحمية (على سبيل المثال، الخلايا الليفية، podocytes، وخلايا العضلات الملساء) من الأنسجة السليمة 13،21 والمواقع المرض 11،18،20. وهذا من شأنه تمكين دراسة مسارات التنظيمية الأنسجة محددة تعمل على مستوى على EC و / أو الكريات البيض. في جميع الحالات يمكن فحص تعطل العمليات التنظيمية العادية في مجموعة من الحالات المرضية لتحديد كهوسطاء التنظيمية ص (مثل IL-6 و TGFβ) الأهداف العلاجية الجديدة المحتملة و. في سياق التهاب مزمن يمكن أن تستخدم هذه العوامل لإيقاف عملية التوظيف، بينما في بيولوجيا السرطان يمكن للمرء أن يتخيل استخدامها لتشغيل التوظيف لاستهداف الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type Ia | Sigma | C2674 | Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots. |
| Dulbecco's PBS | Sigma | D8662 | With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT. |
| 1X Medium M199 | Gibco | 31150-022 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Gentamicin sulphate | Sigma | G1397 | Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle. |
| Human epidermal growth factor | Sigma | E9644 | Store at -20 °C in 10 µl aliquots. |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma | F9665 | FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C. |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0135 | Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots. |
| Collagenase Type II | Sigma | C6885 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots. |
| Hyaluronidase | Sigma | H3631 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots. |
| 100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used. |
| DMEM low glucose | Biosera | LM-D1102/500 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Penicillin/Streptomycin mix | Sigma | P4333 | Store at -20 °C in 1 ml aliquots. |
| 25 cc tissue culture flask | SLS | 353109 | |
| 75 cc tissue culture flask | SLS | 353136 | |
| Bone marrow mesenchymal stem cells vial | Lonza | PT-2501 | Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use. |
| Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS. |
| EDTA (0.02%) solution | Sigma | E8008 | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| Trypsin solution | Sigma | T4424 | Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately. |
| Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | Keep on ice before adding before adding cell suspension. |
| Mr. Frosty Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen. |
| Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile | Ibidi | IB-80606 | Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html). |
| Cell tracker green dye | Life technologies | C2925 | Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM. |
| Cell counting chambers | Nexcelom | SD-100 | Alternatively a haemocytometer can be used. |
| Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
| Tumor necrosis factor α (TNFα) | R&D Systems | 210-TA-100 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots. |
| 6-well, 0.4 µm PET Transwell filters | SLS | 353090 | |
| K2-EDTA in 10ml tubes | Sarstedt | Store at RT. | |
| Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Store at 4 °C. Warm to RT before use. |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Store at 4 °C. Warm to RT before use. |
| 10 ml round bottomed tube | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
| 7.5% BSA Fraction V solution | Life technologies | 15260-037 | Store at 4 °C. |
| 20 ml Plastipak syringes | BD falcon | 300613 | |
| 5 ml Plastipak syringes | BD falcon | 302187 | |
| 2 ml Plastipak syringes | BD falcon | 300185 | |
| 3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm | Micropore | 1530-1 | Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber. |
| Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) | Fisher Scientific | FB68854 | Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin. |
| Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) | Fisher Scientific | FB68855 | |
| Portex Blue Line Manometer tubing | Smiths | 200/495/200 | Tubing leading to the syringe pump. |
| 3-way stopcock | BOC Ohmeda AB | ||
| Glass 50 ml syringe for pump | Popper Micromate | 550962 | Must be primed prior to use by removing any air bubbles. |
| Glass coverslip | Raymond A Lamb | 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980. | |
| Parafilm gasket | American National Can Company | Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm. | |
| Two perspex parallel plates | Wolfson Applied Technology Laboratory | Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel. | |
| Electronic 3-way microvalve with min. dead space | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | Electronically connected to a 12 volt DC power supply. |
| Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate. |
| L-shaped connector | Labhut | LE876 | To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel. |
| Video camera | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded. |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities. |
| Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here. | |||
References
- Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
- Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
- Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
- Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
- Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
- Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
- McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
- McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
- Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177 (2009).
- Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
- Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
- Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
- Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
- Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
- Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
- Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
- Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
- Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
- Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
- Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
- Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
- Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
- Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).
