Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Published: January 7, 2015 doi: 10.3791/52480
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

Summary

היכולת של האנדותל מודלק לגייס leukocytes מזרימה מוסדרת על ידי תאי סטרומה mesenchymal. אנו מתארים שני מודלים במבחנה בשילוב תאים אנושיים עיקריים שיכול לשמש כדי להעריך גיוס נויטרופילים מזרימה ולבחון את התפקיד שתאי סטרומה mesenchymal לשחק בויסות התהליך הזה.

Abstract

תאי סטרומה להסדיר את הגיוס במחזור leukocytes במהלך דלקת דרך הצטלבות עם תאי האנדותל שכנים. כאן אנו מתארים שני מודלים במבחנה "כלי דם" ללימוד הגיוס של מחזורי נויטרופילים מזרימה על ידי תאי האנדותל מודלקים. יתרון עיקרי של מודלים אלה הוא היכולת לנתח כל צעד במפל ההידבקות לויקוציטים במטרה, כפי שהיה קורה בvivo. אנו גם מתארים כיצד ניתן להתאים את שני המודלים כדי ללמוד את התפקיד של תאי סטרומה, בתאי גזע mesenchymal זה מקרה (MSC), בויסות גיוס לויקוציטים.

תאי האנדותל עיקריים היו בתרבית לבד או יחד עם MSC אדם במגע ישיר על microslides Ibidi או בצדדים מנוגדים של מסנן Transwell למשך 24 שעות. תרבויות היו מגורה עם אלפא גורם נמק גידול (TNFα) למשך 4 שעות ושולבו assay הידבקות מבוסס זרימה. בולוס של נויטרופילים היה perfusedעל האנדותל למשך 4 דקות. לכידתו של זורם נויטרופילים ויחסי הגומלין שלהם עם האנדותל הייתה דמיינה ידי מיקרוסקופ שלב ניגודיות.

בשני המודלים, ציטוקינים גירוי מוגבר גיוס האנדותל של נויטרופילים זורמים באופן תלוי מינון. ניתוח של ההתנהגות של נויטרופילים גויסו הראה ירידה תלויה-מינון בגלגול ועלייה תלוי-מינון בגלגול דרך האנדותל. בשיתוף התרבות, MSC מודחק הידבקות נויטרופילים להאנדותל מגורה TNFα.

המודלים המבוססת על הידבקות הזרימה שלנו לחקות את השלבים הראשונים של גיוס לויקוציטים מהמחזור. בנוסף לויקוציטים, הם יכולים לשמש כדי לבחון את הגיוס של סוגי תאים אחרים, כגון תאים סרטניים MSC או מחזור מנוהלים טיפולי. דגמי שיתוף התרבות רב-שכבתי שלנו הראו כי MSC לתקשר עם האנדותל לשנות את תגובתם לציטוקינים פרו-דלקתיים, altering הגיוס של נויטרופילים. מחקר נוסף תוך שימוש במודלים אלה נדרש כדי להבין איך תאי סטרומה מרקמות שונות ותנאים (מחלות דלקתיות או סרטן) להשפיע על הגיוס של לויקוציטים במהלך דלקת.

Introduction

דלקת היא תגובה הגנתית לזיהום חיידקים או פגיעה ברקמות שדורשת רגולציה הדוקה של כניסה לויקוציטים וליציאה מהרקמה הדלקתית לאפשר 1,2 רזולוציה. צלב-שיחה בין תאי האנדותל (EC) שכלי דם קו, כדוריות דם לבנות במחזור ותאי סטרומה רקמות תושב חיונית לתיאום תהליך זה 3. עם זאת, גיוס בלתי מבוקר של כדוריות דם לבנות והפינוי יעיל שלהם לחזק את התפתחותן של מחלות דלקתיות כרוניות 4. ההבנה הנוכחית שלנו של גיוס לויקוציטים בבריאות ובמחלה אינה שלמה ויש צורך במודלים חזקים יותר כדי לנתח את התהליך הזה.

המנגנונים התומכים בגיוס של לויקוציטים מהדם דרך כלי דם בEC venules פוסט-נימים תוארו גם 1,2,5. כדוריות דם לבנות במחזור נלכדים על ידי קולטנים מיוחדים (למשל, VCAM-1, E-selectin, P-selectin) שהם מוסדרים על האנדותל מודלק. אינטראקציות חולפות אלה מאפשרים לויקוציטים לאינטראקציה עם כמוקינים משטח מחויב ומתווכים הנגזרים שומנים (או אנדותל או סטרומה במקור) המפעילים integrins לידי ביטוי על ידי כדוריות דם לבנות 6 11. זה בתורו מייצב הגירת הידבקות וכוננים על פני האנדותל ולתוך הרקמה 12 15. בתוך רקמה, גויס לויקוציטים נתונים לסוכנים הנגזר סטרומה המשפיעים על תנועתיות, תפקוד והישרדות 16,17. ראיות הולכות ומצטברים מצביעות בבירור על אותות המתקבלים בכל שלב של לויקוציטים תנאי תהליך הגיוס למשנו. עם זאת, ההבנה של גיוס לויקוציטים שלנו נשארת שלמה ומעט מאוד ידוע על תנועת ויקוציטים עיצוב רכיבים בתוך רקמה.

בברמינגהם פיתחנו כמה מודלים "כלי דם" מבחנה ללמוד הגיוס של לויקוציטים מלזרום 9,18,19. עכשיו אנו מבינים כי רגולטורים מיידיים כמעשה EC כלי דם של גיוס לויקוציטים בתגובה לשינויים במייקרו-הסביבה המקומית שלהם. באופן ספציפי, תאי סטרומה רקמה-תושב יכולים להסדיר באופן פעיל את התגובה הדלקתית, בחלקו על ידי שיחה עם EC כלי הדם השכן להשפיע תפקידם בגיוס 3. הראינו בעבר כי תאי סטרומה שונים לווסת את היכולת של EC לתמוך הידבקות והגירה של לויקוציטים באופן רקמות ספציפיות, וכי ההשפעות אלה הופכים שינו במחלות כרוניות 13,16,20,21. כך, תאי סטרומה להקים רקמה 'כתובת קודים "המגדירים את ההקשר של כל תגובה דלקתית 22. לאחרונה, יש לנו הפגנו שMSC מח עצם נגזר (BMMSC) מטה-להסדיר בעצמת התגובה של EC לציטוקינים, שהביא לירידה בגיוס של שני נויטרופילים וימפוציטים 23.

מנגנוני גובגיוס erning הובהר במבחנה השתמש בעיקר מבחני שילוב סוג תא בודד (למשל, EC) או חלבון בבידוד. עם זאת, מחקרים אלה לא לוקחים בחשבון את ההשפעות של סביבת הרקמות המקומית (כלומר, הנוכחות של תאי סטרומה) ​​על גיוס של לויקוציטים וההגירה הבאה שלהם לתוך הרקמה. כאן אנו מתארים שתי שיטות המבוססת על זרימה שבו תאי סטרומה, במיוחד mesenchymal תאי גזע (MSC), הם שיתוף תרבותי עם EC 23. מודלים כאלה מאפשרים לנו לבחון את ההשפעה של תא סטרומה על תגובות אנדותל, ביכולת שלהם בפרט לתמוך גיוס לויקוציטים מזרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד והתרבות של תאי האנדותל האדם יסודיים ותאי גזע mesenchymal

  1. תאי בידוד והתרבות של אדם טבור אנדותל הווריד (HUVEC):
    1. שים חבל טבור על מגש עם נייר סופג ולרסס עם אתנול 70%. מניחים בברדס בתרבית רקמה. זהה את הווריד וcannulate בשני קצותיו. מניחים עניבת כבל סביב סוף cannulated כדי לאבטח אותו.
    2. לשטוף את דם ורידים עם PBS באמצעות מזרק. מלא מזרק עם אוויר ועובר דרך הווריד כדי להסיר ולהשליך את PBS השייר.
    3. הפשירי 10 מ"ג / מיליליטר collagenase סוג Ia ולדלל 1:10 ב PBS (סידן ומגנזיום כלורי) לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר. לעבור פתרון collagenase לווריד עד ששני cannulae מלא. סגור את מהדק על cannulae בשני קצותיו.
    4. מכסה את המגש עם רקמה ולרסס עם אתנול 70%. הנח את הכבל לחממה עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    5. קח את הכבל החוצהשל החממה ולהדק קשרי כבל. לעסות בעדינות את כבל דקות 1. לשטוף את ההשעיה התא עם 10 מיליליטר PBS ולאסוף בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר.
    6. מלא מזרק עם אוויר ועובר דרך הווריד כדי להסיר כל PBS שייר פעמיים, איסוף PBS בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר המשמש בשלב 1.1.5. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בRT.
    7. לשאוב supernatant וגלול resuspend ב 1 מיליליטר בינוני EC מלא. בינוני EC מורכב מM199 בתוספת 35 מיקרוגרם / מיליליטר סולפט גנטמיצין, 10 ng / גורם גדילה באפידרמיס אנושי מיליליטר, 1 מיקרוגרם / מיליליטר הידרוקורטיזון, 2.5 מיקרוגרם / B amphotericin מיליליטר, ו- 20% בסרום עגל עוברי.
    8. הוסף 4 מיליליטר של מדיום EC והשעית EC בבקבוק 2 25 סנטימטר. לשנות את המדיום ביום הבא ולאחר מכן כל 2 ימים.
    9. EC תערוכת מורפולוגיה כמו מרוצפת (איור 1Ai). עבור מבחני הידבקות, EC בדרך כלל זרע כאשר הם מגיעים למפגש 100% (ראה סעיף 1.4
  2. בידוד של תאי הגזע של וורטון mesenchymal הג'לי (WJMSC) מחבלי טבור אנושיים:
    1. לבודד MSC-נגזר ג'ל וורטון (WJMSC) מחבלי טבור טריים או מכבלים שכבר משמשים כדי לבודד EC. חתך את חבל טבור ל -5 סנטימטרים חתיכות ארוכות. חותך כל פיסה longitudinally לחשוף את כלי דם (עורקי 2 [לבן, נוקשה] ווריד 1 [צהוב, נפוח]).
    2. בעזרת מספריים ומלקחיים סטרילית להסיר את כלי הדם וזורקים. לחתוך את כל הרקמה לתוך 2 - 3 מ"מ 3 חתיכות. שימוש במלקחי מקום 2 - 3 מ"מ 3 חתיכות לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר.
    3. להפשיר 100 מ"ג / מיליליטר סוג collagenase המניה השנייה ולדלל 1: 100 ב 10 מיליליטר PBS לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר. להפשיר 20,000 U / hyaluronidase מניית מיליליטר ולדלל 1: 400 לריכוז סופי של 50 U / ml בפתרון collagenase.
    4. הוסף קוקטייל האנזימטית לצינור צנטריפוגות המכיל שברי הרקמה. דגירה fragmen הרקמהts במשך 5 שעות על 37 מעלות צלזיוס על הכתף איטי.
    5. לדלל את ההשעיה תא 1: 5 בPBS. מקום מסנן מיקרומטר נקבובית 100 לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש. יוצקים את ההשעיה התא על המסנן הנקבובית 100 מיקרומטר.
      הערה: נותרה שברי רקמה תישמר על המסנן ותאים ייאספו בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל.
    6. מחק את המסנן. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT. לשאוב supernatant וגלול WJMSC resuspend ב 12 מיליליטר מדיום תרבות WJMSC מלא (גלוקוז DMEM הנמוך, FCS 10% ו 100 U / פניצילין + 100 מיקרוגרם / מיליליטר תערובת סטרפטומיצין מיליליטר).
    7. זרע כל התאים בבקבוק תרבות 2 רקמה 75 סנטימטרים. לשנות את המדיום לאחר שעות 24 עם 12 מיליליטר מדיום תרבות WJMSC מלא. החלף בינוני כל 2-3 ימים. תאים צריכים להגיע 70 - מפגש 80% בתוך 2 שבועות. מעבר כאשר WJMSC להגיע 70-80 מפגש% (ראה סעיף 1.4).
  3. הרחבת MSC העצם נגזר מח (BMMSC): לבודד MSC האדם נגזר מח עצם (BMMSC) כפי שתואר קודם לכן 24. הוסף 10 מיליליטר מדיום גידול MSC המחומם מראש (MSCGM) לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר.
  4. להפשיר בקבוקון של p2 BMMSC על ידי הנחת באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מוסיף את ההשעיה BMMSC לצינור צנטריפוגות מכיל MSCGM. מערבבים היטב על ידי pipetting.
  5. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בRT. לשאוב supernatant לחלוטין.
  6. תאי Resuspend ב 1 מיליליטר MSCGM ולספור את התאים באמצעות haemocytometer או דלפק תא דיגיטלי כגון cellometer.
  7. תאי זרע לתוך 75 סנטימטר 2 צלוחיות תרבות בצפיפות של 5,000 - 6,000 תאים לכל 2 סנטימטר ב- 12 מיליליטר MSCGM. לשנות את המדיום לאחר שעות 24 עם 12 מיליליטר MSCGM. תאי הזנה עם 12 מיליליטר MSCGM כל 2-3 ימים.
  8. מעבר כאשר BMMSC להגיע 70-80 מפגש% (ראה סעיף 1.4). תאים להציג מורפולוגיה fibroblastic (איור 1Aii).
  • ניתוק של EC ו- MSC: בינוני לשאוב מ -25 סנטימטר 2 צלוחיות תרבות. הוסף 2 מיליליטר של EDTA 0.02% לכ -2 דקות. לשאוב EDTA ולהוסיף 2 מיליליטר טריפסין (2.5 מ"ג / מיליליטר). צפה במתחת למיקרוסקופ עד שהתאים הופכים עגולים.
  • הקש על הבקבוק כדי לנתק את התאים. להשבית טריפסין ידי הוספת תרבות בינונית 8 מיליליטר (תלוי בסוג התא; בינוני EC לHUVEC, DMEM LG לWJMSC וMSCGM לBMMSC) לבקבוק התרבות והשעית העברת צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר.
  • צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בRT. supernatant ולשאוב resuspend גלולה כפי שיתואר להלן.
    1. לpassaging של MSC, גלולה גלולה במדיום תרבות 3 מיליליטר. הוסף בינוני תרבות 11 מיליליטר לשלוש צלוחיות תרבות נפרדות 75 סנטימטר 2. הוסף השעיה תא 1 מיליליטר לכל בקבוק תרבות (1: 3 מפוצל). WJMSC המעבר וBMMSC 3 פעמים (P3) לפני השימוש במבחני התרבות משותפת.
    2. לזריעת EC או MSC במבחני הידבקות - ראו סעיפים 2 ו -3.
  • MSC הקפאה:
    1. במעבר 3 MSC ניתוק כאמור בסעיף 1.4. לשאוב supernatant ו resuspend ב 3 מיליליטר CryoSFM קר כקרח. פיפטה 1 aliquots מיליליטר של השעיה תא לתוך 1.5 מיליליטר cryovials קר כקרח. שים cryovials במכל הקפאה.
    2. אחסן את המכל ב -80 CO ° / N. העברה לחנקן נוזלי. בקבוקון הפשרה של MSC (בצענה את פעולות 1.3.1 - 1.3.6). Resuspend MSC ב5 מדיום תרבות מיליליטר (לבחור בינוני מתאימים לWJMSC או BMMSC) וזרע לתוך בקבוק 2 25 סנטימטר.

    • 2. הקמת Co-תרבויות תאי גזע האנדותל-mesenchymal על Ibidi Microslides

    1. Trypsinize ומחוברות 25 סנטימטר 2 בקבוק של EC (~ 1.5 x 10 6 תאים; כסעיף 1.4). Resuspend בר ב380 μl MSCGM (1 x 25 סנטימטר 2 בקבוק יהיה זרע שתי microslides 6 ערוצי Ibidi (~ 1.25 x 10 5 / ערוץ), עבור מבחני הידבקות כל ty התאPES בתרבית MSCGM). הוסף 30 μl של ההשעיה EC לכל ערוץ (זה יכסה את אזור הצמיחה באמצעות פעולת נימים). דגירה microslide Ibidi על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור שעה 1.
    2. להוסיף 140 μl MSCGM לכל ערוץ ולאחר מכן לשאוב אותו. חזור פעמיים בסכום כולל של 3 שוטף. להוסיף 140 μl MSCGM ומקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות.
    3. לשיתוף תרבויות לנתק MSC (סעיף 1.4). לבצע ספירת תאים באמצעות haemocytometer או cellometer. התאם את הריכוז של MSC 1.5 x 10 5 תאים / מיליליטר.
    4. בינוני עודף לשאוב מערוצי Ibidi (שעזבו את אזור הגידול היחיד של הערוץ במדיום). להוסיף 30μl השעיה MSC לערוצי Ibidi. לשאוב את המדיום שנפלט מאזור הגידול של הערוץ ולהוסיף 30 μl אחר של ההשעיה MSC. חזור פעם נוספת ולאחר מכן למקם את microslide Ibidi בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </ Sub> עבור שעה 1.
    5. להוסיף 140 μl MSCGM לכל ערוץ ולאחר מכן לשאוב אותו. חזור פעמיים בסכום כולל של 3 שוטף. הוספת נפח סופי של 140 μl MSCGM לכל ערוץ ומקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות.
    6. להפשיר 1 x 10 5 U / ml מניית TNFα ולדלל 1: 1,000 בMSCGM לריכוז סופי של 100 U / ml (שווה ערך ל ~ 10 ng / ml). לבצע דילול סדרתי על ידי דילול 100 U / ml TNFα ידי 1:10 ב MSCGM להשיג 10 U / ml. לדלל 10 U / ml TNFα ידי 1:10 ב MSCGM להשיג 1 U / ml.
    7. פנק את הערוצים עם TNFα על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפני assay. תנודות טמפרטורה במהלך טיפול ציטוקינים ישנו את דפוסי גיוס נויטרופילים נצפו. להוסיף MSCGM הטרי לערוצים שלא טופלו.

    3. הקמת האנדותל-mesenchymal לתאי גזע Co-תרבויות במסננים

    1. לנתק WJ או BMMSC כמתואר בסעיף 1.4. Resuspend גלולהב 1 מיליליטר MSCGM. לבצע ספירת תאי תאים באמצעות haemocytometer או cellometer.
    2. להתאים את עוצמת קול, כך שהריכוז הסופי הוא 5 x 10 5 MSC ב 500 μl של MSCGM.
    3. מלקחיים סטריליים באמצעות היפוך 6-גם, 0.4 מיקרומטר מסנני PET Transwell ומקום בתיבת סטרילי.
    4. זרע 5 x 10 5 MSC על פני השטח החיצוניים של המסננים. דגירה מסננים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור שעה 1.
    5. לאסוף מדיה מהמשטח החיצוני של המסנן. לספור את מספר MSC שאינו חסיד בתקשורת. מסננים מחדש הפוך באמצעות מלקחיים ומקום סטרילי בצלחת 6-גם התאמה המכילה 3 מיליליטר MSCGM.
    6. הוסף 2 מיליליטר של MSCGM על המשטח הפנימי של המסנן (איור 1). מניחים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות. Trypsinize ומחוברות 25 סנטימטר 2 בקבוק של EC (איור 1Ai; כסעיף 1.4).
    7. Resuspend EC ב 8 מיליליטר MSCGM (1 x 25 הסנטימטר wi 2 בקבוקזרע ll ארבעה מסננים 6-גם; ~ 5 x 10 5 EC / מסנן). בינוני לשאוב מהחלק העליון והתחתון של המסננים נקבוביים. להוסיף MSCGM 3 מיליליטר טרי לתוך התא התחתון (מתחת למסנן). הוסף 2 מיליליטר השעיה EC אל פני השטח הפנימיים של כל מסנן. דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    8. הבינוני לשאוב כדי לשטוף את EC לא חסיד ולהחליף עם MSCGM הטרי. הגדר את המסננים חד-תרבות מקבילות EC על ידי זריעת תאים על המשטח הפנימי ללא MSC הזריעה הראשון. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    9. בדוק שmonolayer EC הוא מחוברות ולא מכיל פערים. monolayers תת-מחוברות לא ניתן להשתמש עבור מבחני הידבקות (איור 1).
    10. פנק את התאים העליונים ותחתונים של המסננים עם 1, 10, או 100 U / ml TNFα (שווה ערך ל ~ 10 ng / ml) על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפני assay (שתואר בסעיף 2).

    4. בידוד של לויקוציטים

    1. קח ורידיםדם ממתנדבים וaliquot בריאים מייד לתוך צינורות EDTA. צינורות היפוך בעדינות לתערובת.
    2. שכבת מיליליטר Histopaque 1,077 2.5 על 2.5 מיליליטר Histopaque -1119 בסיבוב 10 מיליליטר תחתית צינור. 5 מיליליטר שכבת דם כל על שיפוע Histopaque. צנטריפוגה ב 800 XG במשך 40 דקות ב RT.
    3. נויטרופילים קציר היקפיים polymorphonuclear (PMN) בממשק של Histopaque 1,077 1,119 ו( מעל השכבה כדורית אדומה). מניחים בתחתית עגולה 10 מיליליטר צינור ולעשות עד 10 מיליליטר עם PBSA. בעדינות להפוך צינור ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות בRT.
    4. לדלל 7.5% פתרון BSA 01:50 ל -100 מיליליטר PBS (סידן ומגנזיום כלורי) לריכוז סופי של 0.15% (w / v; PBSA). לשאוב supernatant וגלול ב 10 מיליליטר PBSA. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בRT.
    5. Resuspend ב 1 מיליליטר PBSA. קח aliquot 20 μl של ההשעיה התא ולהוסיף 380 PBSA μl (01:20 דילול). ספירת תאים באמצעות haemocytometer או cellometer. לדלל את conce הנדרשntration (1 x 10 6 / ml עבור מסנני Transwell וmicroslide Ibidi) בPBSA. לשמור על ההשעיה נויטרופילים ב RT עד assay.

    5. הרכבת מערכת הזרימה

    1. הגדר את מערכת הזרימה כפי שמוצג באיור 1 ג. הפעל את התנור ומוגדר 37 מעלות צלזיוס. צרף מזרק 20 מיליליטר (להסיר את הבוכנה) ומזרק 5 מיליליטר לברז 3-בדרך. צרף את הברז לתא פרספקס באמצעות קלטת micropore.
    2. למדוד ולחתוך חתיכת סיליקון 2/4 מ"מ הצינור (עבה) שהוא כ המרחק בין השסתום וברז 3-בדרך ארוכה. חותך 8 - חתיכה באורך 10 מ"מ של 1/3 מ"מ צינורות (דקים) ולהכניס לתוך קצה אחד של הצינור העבה. צרף את צד צינורות העבה אל ברז 3-בדרך.
    3. חבר את קצה צינור הדק על נמל microvalve 3-בדרך האלקטרונית. זהו "המאגר לשטוף". חותך 6 - חתיכה ארוכה 8 מ"מ של צינורות עבים ודקים.
    4. הכנס את צינורות הדקים לקצה אחד של הצינור העבה. עו"דACH צינורות העבים בסופו על מזרק 2 מיליליטר (להסיר את הבוכנה).
    5. חבר את קצה צינור הדק של מזרק 2 מיליליטר על יציאה בmicrovalve האלקטרונית כדי להפוך את "מאגר המדגם". חבר את השסתום לתא זרימת המסנן על ידי מדידה וחיתוך חתיכה ארוכה של צינורות דקים שהיא המרחק בין microvalve ומרכז הבמה מיקרוסקופ.
    6. למודל microslide, לצרף 8 - חתיכת מ"מ 10 של צינורות עבים לסוף בצינור הדק. הנח L צורת מחבר לסוף הצינור העבה. זה יהיה להתחבר לmicroslide. למודל המסנן, לצרף 8 - חתיכת מ"מ 10 של מד לחץ קו הכחול Portex חיבור צינורות לסוף בצינור הדק.
    7. מניחים את קצה צינור הדק על microvalve. זהו הפלט המשותף למאגרים לשטוף ומדגם. מלא מאגרים עם PBSA. צינורות ראש על ידי זורם PBSA דרכם כדי להסיר בועות אוויר.
    8. צרף צינורות מד לחץ ל-29 מ"מ (50 מיליליטר) של זכוכיתyringe. ראש המזרק על ידי מילוי עם 10 מיליליטר PBSA. הפוך את המזרק כך שהסוף היה מחובר לצינור פונה כלפי מעלה ודוחף החוצה את כל בועות האוויר. למלא עם 5 מיליליטר PBSA.
    9. למודל microslide רק, לצרף 10 - חתיכת הצינור עבה 12 מ"מ לסוף צינור מד הלחץ המוביל למזרק הזכוכית. הנח L צורת מחבר על הסוף של הצינור העבה. מניחים את מזרק הזכוכית לתוך משאבת מזרק עירוי / נסיגה.
    10. לחשב את זרימת מילוי השיעור (Q) נדרש כדי ליצור את לחץ גזירת קיר הרצוי (τ w בפסקל, אבא) של 0.1 (מסנני Transwell) אבא או 0.05 (microslides Ibidi) Pa תוך שימוש בנוסחות הבאות:
      γ w = (6.Q) / (ש"ש 2)
      τ = n.γ
      איפה רוחב w = הפנימי וh = עומק הפנימי של ערוץ הזרימה. n = צמיגות של הפתרון זורם; PBSA הוא n = 0.7 mPa.s. לתא זרימת מסנן צלחת המקביל, הרוחב (w) הוא 4 מ"מ והעומק (ח) הוא .133 מ"מ. דepth של החדר יכול להשתנות מעט בשל הבדלים בעובי של אטם Parafilm בשימוש. לmicroslide Ibidi, הרוחב הוא 3.8 מ"מ והעומק הוא 0.4 מ"מ.
      הערה: בשל הבדלים בממדים של ערוץ הזרימה, ודינמיקת לכידה אנו משתמשים לחצי גזירה שונים למודל microslide בהשוואה למודל המסנן 6.

    6. הגדרת פלייט המקביל תזרים לשכת שילוב מסננים

    1. חותכי פיסת Parafilm (באותו הגודל כמו coverslip הזכוכית) באמצעות תבנית מתכת. לגזור חריץ 20 x 4 מ"מ בParafilm (כדי ליצור את ערוץ הזרימה) באמצעות תבנית מתכת. השתמש באטם לציון ערוץ הזרימה על coverslip הזכוכית.
    2. יישר את הקצוות של מסנן 6-גם על coverslip הזכוכית. ודא שהמסנן מכסה את סימוני ערוץ זרימה. בזהירות לחתוך את המסנן באמצעות אזמל 10A הסוג.
    3. לכסות בזהירות את המסנן עם אטם Parafilm, על מנת להבטיח כי ערוץ הזרימהחריץ הוא באמצע של המסנן (1D איור). השתמש בפיסת רקמה נקייה ולדחוף את כל בועות.
    4. מניחים את coverslip בהפסקה של הצלחת התחתונה של חדר זרימת פרספקס. מקם את צלחת פרספקס העליונה מעל האטם ובורג הצלחות יחד (1D איור).
    5. הפעל את ברז 3-בדרך, כדי לאפשר חיץ לשטוף (PBSA) לזרום דרך השסתום. חיבור צינורות מד לחץ ליציאת הכניסה של צלחת Persex העליונה. הפעל PBSA דרך ערוץ הזרימה לאפשר בועות כדי לעבור.
    6. חבר את צינור מד לחץ ממשאבת המזרק לתוך פתח היציאה של צלחת פרספקס. הגדר את משאבת המזרק כדי למלא ולהפעיל לחץ. נקה כל PBSA שטפטף על הצלחת העליונה של החדר.
    7. מניחים את החדר על הבמה של מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך. להתאים את המיקוד כדי להמחיש את EC מעל המסננים (איור 1).

    7. הגדרת Microslides לזרימה </ P>

    1. הנח את microslide על הבמה של מיקרוסקופ לעומת שלב היפוך. חבר את מחבר L בצורה ליציאת הכניסה של ערוץ. הפעל PBSA דרך ערוץ הזרימה.
    2. הנח את L בצורת מחבר ממשאבת המזרק לתוך פתח היציאה של הערוץ. הגדר את משאבת המזרק כדי למלא ולהפעיל לחץ. נקה כל PBSA שנטף על microslide. להתאים את המיקוד כדי להמחיש את monolayer EC.

    8. זלוף של תאי האנדותל במהלך Leukocytes

    1. שים 2 מיליליטר של נויטרופילים המטוהרים למאגר המדגם ולהשאיר לחמם למשך 2 דקות. שטוף את האנדותל עם PBSA למשך 2 דקות.
    2. הפעל את השסתום ON לינקב נויטרופילים מעל האנדותל. לספק בולוס נויטרופילים למשך 4 דקות. כבה את ה- השסתום ותנקב PBSA מהמאגר לשטוף לשארית הניסוי.
    3. לוודא שאוויר בועות אינן עוברים דרך ערוץ הזרימה בכל נקודה במהלך assay כמו זה ישבש את monolay ECאה וניתוק סיבה של נויטרופילים חסיד.

    לכידת 9. ההקלטה נויטרופילים והתנהגות

    1. גיוס שיא נויטרופילים או במהלך זרימת נויטרופילים או פוסט-זלוף.
    2. הפוך את כל ההקלטות הדיגיטליות של לפחות 5 - 10 שדות במרכז ערוץ הזרימה. זהה את מרכזו של הערוץ על ידי הזזת האובייקטיבית לקצה של הערוץ בנמל הכניסה וזיהוי אמצע הנמל.
      1. להקלטה בזמן זרימת נויטרופילים, לקחת תמונות של שדה אחד בכל 10 שניות 1 דקות. לנוע לאורך הערוץ ולהקליט שדה אחר דקות 1. חזור על פעולה עבור משך זמן של בולוס.
      2. להקלטת ההודעה זלוף-, לעשות 10 שניות הקלטה של ​​5 - 10 שדות למטה במרכז של ערוץ הזרימה להערכת ויקוציטים התנהגות (בדרך כלל 2 דקות לאחר תום בולוס נויטרופילים). קח תמונות בכל שנייה במרווח של 10 שניות. זה מאפשר מספיק זמן ללכידה מזרימה וההתנהגות של neutro חסידPhils להיות מנותח.
      3. להקליט שדה יחיד המכיל לפחות 10 נויטרופילים transmigrated במשך 5 דקות, לקחת תמונות כל 30 שניות. זה יכול לשמש כדי לחשב את המהירות של תאים נדדו (מעל או מתחת לאנדותל).
      4. להקליט עוד סדרה של 10 שדות לשנייה (בדרך כלל 9 דקות שלאחר זלוף-). זה מאפשר זמן נויטרופילים להעביר דרך monolayer האנדותל.
      5. עצור את משאבת המזרק ולהסיר את הצינור. לפרק את תא הזרימה ולשטוף את מאגר המדגם וצינורות. חזור על פעולה עבור מסננים / ערוצי microslide שלאחר מכן.

    ניתוח 10. של יקוציט גיוס והתנהגות

    1. לספור את מספר הנויטרופילים בכל תחום במהלך הקלטות שניות 10 בנקודת הזמן 2 דקות. כל התאים חייבים להיות נוכחים בשדה השני הראשון כדי לספור. תאים שבאופן חלקי בתחום על 2 צדדים (לדוגמא, ראש / יד גבול ימני) של שדה הראייה כלולים בהספירה, כל עוד הם נשארים בתחום למלא 10 שניות.
    2. לחשב את המספר הממוצע של נויטרופילים חסיד לכל שדה. מדוד את האורך ורוחב של השדה שנרשם. לחשב את השטח של השדה. לחשב כמה שדות יש ב1 מ"מ 2. הכפל את ספירת נויטרופילים הממוצעת במספר תחומים ב1 מ"מ 2.
    3. לחשב את המספר הכולל של נויטרופילים perfused על ידי הכפלת הסכום של נויטרופילים perfused (למשל, 2 x 10 6 / ml Q * [למשל, .0999 מיליליטר / דקה לתא זרימת צלחת מקבילה]) על ידי משך בולוס (למשל, 4 דקות ).
    4. מחלקים את הספירה / מ"מ נויטרופילים 2 במספר הכולל של נויטרופילים perfused כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים שדבקו (תאים / מ"מ חסיד 2/10 6 perfused).
    5. להעריך אם נויטרופילים חסיד מתגלגלים, חסיד או transmigrated (וידאו משלים 1 ו -2) בתוקף.
      1. מתגלגל נויטרופילים הוא שלב בהיר ויעבור לאט לאורך monolayer האנדותל (1 - 10 מיקרומטר / sec; משלים וידאו 1).
      2. תאים היטב חסיד הם שלב בהיר וכבול אל פני השטח EC, או שנותרו נייח (כלומר, לא זז בעת הקלטה) או שעבר שינוי צורה והם נודדים על פני EC (איור 1Ei).
      3. נויטרופילים transmigrated הוא השלב כהה ומתחת לשכבת EC (איור 1Eii).
    6. לחשב את אחוז התאים חסיד שמתגלגלים, נייח וtransmigrated. לחלופין, התנהגות נויטרופילים יכול לבוא לידי ביטוי במספרים סלולריים כולל שמפגינים התנהגויות השונות על ידי החלת באותה הנוסחה המשמשת לחישוב הידבקות מוחלטת (כפי שמתואר בצעדים 10.6-10.7).
      1. סמן את הקצה המוביל של נויטרופילים מתגלגלים. סמן את הקצה המוביל של אותו התא בסוף רצף 10 שניות. לצייר קו הימורWeen 2 נקודות ולמדוד את המרחק שהתאים נסע.
      2. לחלק ערך זה על ידי משך ההקלטה שבתא הוא גלגול (כלומר, 10 שניות). נסה ובחר נויטרופילים שנמצאים בתחום כבר 10 שניות המרווח כולו.
    7. כדי לחשב את המהירות של נויטרופילים הנודדים מעל פני השטח (בהיר שלב שהשתנה בצורה) או מתחת לאנדותל (כהה שלב) להשתמש 5 דקות הקלטה (וידאו משלים 2).
      1. לצייר קווי המתאר של תאים נדדו בתחילת הרצף ולעקוב אחר תנועותיהם לאורך הרצף. רשמו את עמדות X ו- Y של centroid בכל מרווח דקות 1 לכל תא. לחסר ערכים של X ו- Y עמדה מהתמונה הראשונה של הרצף מהערכים בתמונה השנייה. זה מבוסס על משפט פיתגורס.
      2. הפחת את הערכים מהתמונה השנייה מהתמונה השלישית. לעשות את זה עבור כל התמונות ברצף. t כיכרהוא X וערכי Y ולהוסיף אותם יחד.
      3. שורש הריבועי ערך וכתוצאה מכך. לחשב את המהירות עבור כל תא על ידי חישוב ממוצע המהירויות יחושבו לכל מרווח דקות. מסלול 10 היגר נויטרופילים ולחשב את ממוצע המהירות.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    בתחילה, נתחנו את ההשפעה של גירוי EC עם TNFα על הגיוס של נויטרופילים מזרימה באמצעות מודל Ibidi microslide (סעיף 7 - 9). בהעדר TNFα, מעט אם בכלל נויטרופילים דבקו monolayer האנדותל (איור 2 א). זה היה צפוי, שכלא טופל / המנוחה EC אינו מבטא את המולקולות הדרושות הידבקות (selectins) או כמוקינים לתמוך מחייב 25,26. בניגוד לכך, ציטוקינים גירוי גדל באופן משמעותי הידבקות נויטרופילים לאנדותל באופן תלוי-מינון (איור 2 א). הדבקה בדרך כלל נותרת יציבה במהלך assay. הכריכה של לויקוציטים להאנדותל שלא טופל מצביעה על כך שגם EC מופעל (כלומר, מזוהם עם LPS במהלך תהליך התרבות) ו / או נויטרופילים הופעלו במהלך תהליך הבידוד. ואכן, LPS הוכח להגדיל את הביטוי של E-selectin, ICAM-1 וVCAM-25-27 ינואר על פני השטח של EC, המאפשרים להם להיקשר נויטרופילים.

    כאשר מנתח את ההתנהגות של נויטרופילים גויסו בדרך כלל אנו רואים ירידה תלויה-מינון בשיעור של נויטרופילים מתגלגלים (איור 2) עם גדלה מקבילה מינון תלויה בשיעור של נויטרופילים הנודדים דרך monolayer האנדותל (איור 2 ג). במינונים נמוכים יותר של TNFα גירוי (1 U / ml) שיעור גבוה יותר של נויטרופילים מופיעים בהיר שלב מצביע על כך שהם מחוברים למשטח הפסגה של האנדותל (איור 2). בניגוד לכך, בשעה 10 בו -100 U / ml (מינונים גבוהים יותר) כ -40% מנויטרופילים גויסו להופיע כהים שלב ב -2 דקות מצביעים על כך שהתאים אלה היגרו דרך monolayer האנדותל והם מתחת לאנדותל (איור 2 ג). נויטרופילים יכולים להעביר דרך EC בתוך 1 - 2 דקות, עם מ 'הגיע גלגולרמות aximal ב ~ 10min הפוסט-זלוף 28. כאן אנו נצפו עלייה בגלגול נויטרופילים מ -40% ב -2 דקות עד 60% על ידי 9 דקות שלאחר זלוף (איור 2 ג). המחקר שלנו לא השפעה של ריכוז TNFα במהירות של גלגול (~ 3 מיקרומטר / sec) או נודדים (~ 10 - / min מיקרומטר 12) נויטרופילים.

    במודל המבוסס מסנן, TNFα גירוי מוגבר הידבקות נויטרופילים באופן תלוי-מינון דומה לזה שראה תוך שימוש במודל Ibidi microslide (איור 3 א). במונחים של התנהגות, מתגלגל נויטרופילים היה מושפע ממינון TNFα (איור 3), תוך עלייה תלויה-מינון בגלגול אחוז נצפתה (איור 3 ג). בסדרה זו של ניסויים שנצפינו השפעה משמעותית של זמן על גלגול נויטרופילים (איור 3 ג).

    אנו מספקים שיטות על איך ליצור שני מבני שיתוף תרבות שונים, כל אחד מאשר המציא כדי לענות על שאלות ספציפיות. במודל microslide Ibidi, EC וMSC בתרבית בשכבה יחידה בקשר ישיר אחד עם השני. מודל זה שימושי לבחינת ההשפעה של הזרקה הטיפולית של MSC לדם והאינטגרציה הבאה שלהם לתוך monolayer EC. בניגוד לכך במודל המבוסס על המסנן, EC וMSC בתרבית בצדדים מנוגדים של המסנן בקרבה אך לא בהכרח בקשר ישיר. זה דומה יותר לרקמה, עם תאי אנדותל ויוצרים monolayer המייצג את כלי הדם, וMSC המתגורר בתא subendothelial. זה מאפשר לנו לבחון את ההשפעות של MSC רקמה-תושב בתגובה של EC לגירוי ציטוקינים.

    המבוסס על החוויות שלנו, אנו צופים כי גיוס נויטרופילים מקסימאלי וההגירה Transendothelial מתרחש כאשר EC מומרץ עם 100 U / ml TNFα. ככזה, יש לנו להשתמש בריכוז הזה כדי לבחון את ההשפעה של התרבות המשותפת MSCעל גיוס האנדותל של נויטרופילים מזרימה. כאן, אנו מציגים נתונים עבור BMMSC בשיתוף התרבות עם EC באמצעות microslide ומודלים מבוססי מסנן למשל עם זאת, יכולים להיות גם בדקו סוגים אחרים של MSC, WJMSC. בשני המודלים הנוכחות של BMMSC מופחת באופן משמעותי הידבקות נויטרופילים לEC בהשוואה לEC (איור 4 א) בתרבית לבד. הייתה התרבות משותפת אין כל השפעה על ההתנהגות של נויטרופילים גויסו, עם רמות דומות של גלגול וגלגול נצפה על EC תרבית לבד או עם MSC (איור 4 ו- C). לפיכך, MSC יכול לשנות את התגובה לגירוי EC ציטוקינים, המדכא את היכולת שלהם לתמוך בגיוס נויטרופילים מזרימה.

    איור 1
    איור 1. הקמת שיתוף תרבות EC-MSC וניתוח גיוס נויטרופילים באמצעות assay הידבקות מבוסס זרימה. () strong> מיקרוסקופ של (i) EC הראשוני ו( ii) קטע 3 BMMSC גדל על צלוחיות תרבית רקמה. (ב) מיקרוסקופ של EC וMSC בתרבית על 6 גם מוסיף מסנן Transwell. (C) תרשים של מערכת זלוף המשמש לייצור מיקרוסקופ זרימה. ייצוג סכמטי של זרימת מסנן צלחת הקאמרית המקבילה (D). (ה) (i) חסיד בתוקף (FA) ו- (ii) נויטרופילים transmigrated (TM) הבאים גיוס מזרימה לEC מגורה עם 100 U / ml TNFα . C ו- D תמונות לקוחים מאיורים 2 ו -3 בשיטות בביולוגיה מולקולרית:. סחר T-cell, 2010, עמ '53-54 28 באישור סוג שמפרינגר מדע ועסקי מדיה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

    gether.within-page = "תמיד"> איור 2
    . איור 2. גיוס נויטרופילים מזרימה לEC מגורה-TNFα באמצעות microslides Ibidi EC היה מגורה עם ריכוז גדל והולך של TNFα (0 - 100 U / ml) במשך 4 שעות. בולוס 4 דקות של נויטרופילים היה perfused מעל monolayer EC ב0.05 Pa. הידבקות () נויטרופילים הוערכה ב -2 דקות. ANOVA הראה השפעה משמעותית של טיפול TNFα על הידבקות נויטרופילים, p <0.01. נויטרופילים התנהגות הוערכה ב 2 ו 9 דקות ומבוטאות באחוזים של תאים חסיד שהיו מתגלגלים (ב) או (ג) transmigrated. ANOVA הראה השפעה משמעותית של טיפול TNFα על ההתנהגות של נויטרופילים חסיד, p <0.001. בC, ANOVA הראה משמעותי של הזמן בעמ 'נויטרופילים transmigrated <0.01. הנתונים הם ממוצעים ± SEM מ n = 3 ניסויים. * P <0.05 ו**p <0.01 בהשוואה ל( 0 / מיליליטר U) שליטת EC unstimulated ידי לאחר בדיקת Dunnett. ## p <0.01 ו### p <0.001 לעומת 1 U / EC מיליליטר באותה הנקודה בפוסט Bonferroni הזמן מבחן.

    איור 3
    . איור 3. גיוס נויטרופילים מזרימה לEC מגורה-TNFα באמצעות assay מבוסס מסנן EC היה מגורה עם ריכוז גדל והולך של TNFα (0 - 100 U / ml) במשך 4 שעות. בולוס 4 דקות של נויטרופילים היה perfused מעל monolayer EC על 0.1 Pa. הידבקות () נויטרופילים הוערכה ב -2 דקות. ANOVA הראה השפעה משמעותית של טיפול TNFα על הידבקות נויטרופילים, p <0.001. נויטרופילים התנהגות הוערכה ב 2 ו 9 דקות ומבוטאות באחוזים של תאים חסיד שהיו מתגלגלים (ב) או (ג) transmigrated. בC, sho ANOVAנישא השפעה משמעותית של זמן וטיפול ציטוקינים בגלגול נויטרופילים, p <0.05. הנתונים הם ממוצעים ± SEM מ n = 3 ניסויים. ** P <0.01 ו*** p <0.001 לעומת (0 / מיליליטר U) שליטת unstimulated EC על ידי Dunnett לאחר בדיקה. P # <0.05 בהשוואה לEC 1 U / ml באותה הנקודה בדואר Bonferroni הזמן -test.

    איור 4
    איור 4. גיוס נויטרופילים מזרימה לשיתוף תרבויות EC-BMMSC מגורה-TNFα. BMMSC היה שיתוף תרבותי עם EC למשך 24 שעות לפני גירוי עם 100 U TNFα מיליליטר / 4 שעה. בולוס 4 דקות של נויטרופילים היה perfused מעל monolayer EC ב0.05 אבא ל( A, C, E) וmicroslides 0.1 אבא ל( B, D, F) מסננים. ההידבקות (AB) נויטרופילים הוערכה ב -2 דקות. נויטרופילים התנהגות הוערכה ב 2 ו 9 מ 'ובמבוטא באחוזים של תאים חסיד שהיו מתגלגל (CD) או (EF) transmigrated. בC ו- D, ANOVA הראה השפעה משמעותית של תנאי תרבות בגלגול נויטרופילים, p <0.05. בE ו- F, ANOVA הראה השפעה משמעותית של זמן בגלגול נויטרופילים, p <0.05. עם זאת, לא נמצא הבדלים משמעותיים נצפו בגלגול בין טיפולים הפרטניים על ידי לאחר בדיקת Bonferroni. הנתונים הם ממוצעים ± SEM מ n = 5 ניסויים. * P <0.05 בהשוואה לmonoculture EC על ידי מבחן t מזווג או Bonferroni פוסט-מבחן.

    וידאו משלים 1. ניתוח של מהירויות מתגלגלות נויטרופילים. EC תרבית על מסנן Transwell היה מגורה עם 100 U / ml TNFα במשך 4 שעות. בולוס של נויטרופילים היה perfused מעל EC ל4min. רצף דיגיטציה נציג שדה 10 שניות בודדות נלקח 2לאחר זלוף דקות. השינוי בעמדתו של נויטרופילים מתגלגלים אחת מההתחלה ועד סוף את רצף 10 שניות יכול לשמש כדי לחשב את המהירות שבה נויטרופילים מתגלגל.

    וידאו משלים 2. ניתוח של מהירויות הגירת נויטרופילים. EC תרבית על מסנן Transwell היה מגורה עם 100 U / ml TNFα במשך 4 שעות. בולוס של נויטרופילים היה perfused מעל EC למשך 4 דקות. רצף דיגיטציה נציג של שדה 5 דקות בודדות כדי לעקוב אחר התנועה של נויטרופילים transmigrated. זה יכול לשמש כדי לחשב את המהירות.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    כאן אנו מתארים שני מודלים במבחנה "כלי דם" ללימוד הגיוס של מחזורי נויטרופילים ידי האנדותל מודלק. יתרון עיקרי של מודלים אלה הוא היכולת לנתח כל צעד במפל ההידבקות לויקוציטים במטרה, כפי שהיה קורה בvivo. יש לנו שנצפה קודם לכן עלייה תלויה-מינון בהידבקות נויטרופילים ולגלגול דרך מגורה TNFα EC 9,29. אנו גם מתארים כיצד ניתן להתאים את שני המודלים כדי לחקור את ההשפעות של תאי סטרומה בגיוס לויקוציטים. כאן, MSC היה שיתוף תרבותי עם בר בmicroslide Ibidi או בצדדים מנוגדים של מסנן נקבובי. זה מאפשר שני סוגי התאים לתקשר אחד עם השני, ובכך שינוי פנוטיפ ותגובתו של זה. יש לנו מוצגים כאן, וגם במחקרים קודמים 23, כי הנוכחות של MSC מודחק הידבקות נויטרופילים לEC מגורה-TNFα. זה מצביע על כך תאי סטרומה לשנות את תגובת ECלציטוקינים ולאחר מכן משנה את הגיוס במחזור לויקוציטים.

    בנוסף לדגמים שתוארו לעיל, biochips Cellix, צלחות Bioflux וזרימת תאי צלחת מקבילה Glyotech באופן מסחרי מערכות זרימת ערוץ זמינות המספקות משטח לculturing האנדותל והתבוננות גיוס. בכל המערכות, יש לשקול פרמטרים מסוימים תוך הקמת תרבויות אנדותל וביצוע מבחני הידבקות מבוססת זרימה, אשר חלקם מודגשים להלן ובדוחות קודמים 30,31. כל חומרים אנטי-דלקתיים, כגון הידרוקורטיזון, שעשוי להשפיע על תגובות ציטוקינים יש להשמיט מהמדיום לתקופת התרבות וassay 18,29. בעת השימוש בIbidi microslide להבטיח שאין בועות אוויר הנוכחיות בערוץ הזרימה בתרבות של EC כמו אלה לשבש את monolayer EC. שלמות monolayer האנדותל צריכה להיות מאושרת לפני cytokine-טיפול, כמו נויטרופילים יהיו לאגד את הפערים בשכבה שבי BSA יש מצופה microslide / המסנן. היא גם חיונית כדי להבטיח שEC נשמרים על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל ציטוקינים גירוי בגלל TNFα הוא טמפרטורה רגישה ורק יש אפקט המקסימאלי על 37 מעלות צלזיוס. לזרימת assay עצמו, בחר חיץ לשטוף מתאים, אנחנו בדרך כלל להשתמש PBSA עבור מבחני קצרים (פחות מ 30 דקות) ובינוני M199 בתוספת BSA (0.15%) למבחנים ארוכים יותר (1-48 שעות) 30,31. לבסוף לוודא שאין בועות אוויר הנוכחיות בערוץ הזרימה במהלך assay כמו זה משבש את קצב הזרימה, נזקי monolayer EC ומפעיל נויטרופילים חסיד.

    אחד היתרונות הגדולים של במבחנה המודלים רב-התאיים שתוארו כאן הוא היכולת שלהם כדי לשכפל את in vivo האינטראקציות בין EC ותאי סטרומה. קשה לבודד את ההשפעות של רכיבי סטרומה הספציפיים in vivoולשנות אותם באופן מבוקר. במודלים שלנו, ניתן להשפיע על תאי סטרומה להבהיר כיצד הם מתקשרים עם EC ולהשפיע על התהליך הדלקתי בבריאות ובחוליים. לדוגמא, השימוש בטכנולוגית siRNA הראה בעבר כי ייצור של IL-6 בMSC בשיתוף התרבות היה הכרחי להשפעות המדכאות החיסון שלהם 23. כל דגם ניתן להשתמש כדי לענות על שאלות ספציפיות כלומר, ההשפעה של תאי רקמה-תושב סטרומה (מודל המבוסס על מסנן) או תאי סטרומה מנוהלים טיפולי (microslides Ibidi ומערכות זמינות מסחרי אחרות) על גיוס לויקוציטים. בשני המקרים יש לנו טיטרציה סוגי תאים שונים סטרומה כדי להבטיח יכולת הקיום שלהם ולהקים יחס מתאים של תא סטרומה לEC להערכת השפעות על גיוס 15,25. באופן דומה מדיום התרבות חייב להיות תואם לכל סוג תא שולב במודל. בידיים שלנו שיתוף תרבויות מבוצעות בדרך כלל במ 'תא סטרומהedium 11,18,23,31.

    שימוש במודל המבוסס על המסנן, שהראינו בעבר כי תאי סטרומה שונים לווסת את היכולת של EC לתמוך הידבקות והגירה של לויקוציטים באופן רקמות ספציפיות, וכי ההשפעות אלה הופכים שינו במחלות כרוניות 3. זה הוביל לרעיון שתאי סטרומה להקים "קודי כתובת" רקמות ספציפיות אשר באופן פעיל להסדיר את הגיוס של לויקוציטים לרקמה דלקתית 24. מודלים אלה תוכננו במיוחד כדי לבחון את השלבים הראשונים של גיוס בפירוט רב, אך אינם מסוגלים ללמוד את ההגירה שלאחר מכן במרחב subendothelial (כלומר, במרחק של האנדותל לתוך הרקמה). מבנים רב-תאיים, רב-שכבתיים 3D כגון assay ג'ל קולגן סטטי 12,32 יהיו מתאימים יותר ללימוד השלבים האחרונים אלה של גיוס.

    המודלים ההידבקות מבוסס הזרימה שלנו הם תכליתיים מאוד. יש לנו described השימוש בם בהקשר של גיוס נויטרופילים, אבל יכול להיחקר תת ויקוציטים אחרים באופן דומה. יש לנו להשתמש גם במערכת microslide Ibidi לחקור את הגיוס של מחזורי MSC על ידי EC 23, ואם זה קורה דרך אותו מפל ההידבקות דווח לויקוציטים. כמו כן מודלים אלה יכולים לשמש כדי לבחון את הגיוס ושילוב של שורות תאי גידול גרורתי, ואת ההשפעות הבאות שלהם על תגובות אנדותל וגיוס לויקוציטים. לחלופין, המודל המבוסס על המסנן יכול להיות מותאם לשלב סוגים שונים של תאי סטרומה (למשל, fibroblasts, podocytes, תאי שריר חלק) מרקמות בריאות 13,21 ואתרים של מחלה 11,18,20. זה יאפשר המחקר של מסלולי רגולציה רקמות ספציפיות הפועלים ברמה של על EC ו / או כדוריות דם לבנות. בכל המקרים שיבוש תהליכי רגולציה נורמלים במגוון של תנאי מחלה ניתן לבדוק לזהות keמתווכי y רגולציה (כגון IL-6 וTGFβ) ומטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות. בהקשר של דלקת כרונית סוכנים אלה עשויים לשמש כדי לכבות את תהליך הגיוס, ואילו בביולוגיה של סרטן אחד יכול לדמיין את השימוש בם כדי להפעיל גיוס למקד את הגידול.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Collagenase Type Ia Sigma C2674 Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Dulbecco's PBS Sigma D8662 With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
    1X Medium M199 Gibco 31150-022 Warm in 37 °C water bath before use.
    Gentamicin sulphate Sigma G1397 Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
    Human epidermal growth factor Sigma E9644 Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Fetal calf serum (FCS) Sigma F9665 FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
    Amphotericin B Gibco 15290-026 Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Hydrocortisone Sigma H0135 Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Collagenase Type II Sigma C6885 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    Hyaluronidase Sigma H3631 Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube Scientific Lab Supplies (SLS) 352360 Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
    DMEM low glucose Biosera LM-D1102/500 Warm in 37 °C water bath before use.
    Penicillin/Streptomycin mix Sigma P4333 Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    25 cc tissue culture flask SLS 353109
    75 cc tissue culture flask SLS 353136
    Bone marrow mesenchymal stem cells vial Lonza PT-2501 Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
    Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) Lonza PT-3001 Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
    EDTA (0.02%) solution Sigma E8008 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
    Trypsin solution Sigma T4424 Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
    Cryovials Greiner bio-one 2019-02 Keep on ice before adding before adding cell suspension.
    Mr. Frosty Freezing Container Nalgene 5100-0001 Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
    Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile Ibidi IB-80606 Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
    Cell tracker green dye Life technologies C2925 Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
    Cell counting chambers Nexcelom SD-100 Alternatively a haemocytometer can be used.
    Cellometer auto T4 cell counter Nexcelom Auto T4-203-0238
    Tumor necrosis factor α (TNFα) R&D Systems 210-TA-100 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
    6-well, 0.4 µm PET Transwell filters SLS 353090
    K2-EDTA in 10ml tubes Sarstedt Store at RT.
    Histopaque 1119 Sigma 11191 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    Histopaque 1077 Sigma 10771 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    10 ml round bottomed tube Appleton Woods SC211 142 AS
    7.5% BSA Fraction V solution Life technologies 15260-037 Store at 4 °C.
    20 ml Plastipak syringes BD falcon 300613
    5 ml Plastipak syringes BD falcon 302187
    2 ml Plastipak syringes BD falcon 300185
    3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm Micropore 1530-1 Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
    Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) Fisher Scientific FB68854 Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
    Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) Fisher Scientific FB68855
    Portex Blue Line Manometer tubing Smiths 200/495/200 Tubing leading to the syringe pump.
    3-way stopcock BOC Ohmeda AB
    Glass 50 ml syringe for pump Popper Micromate 550962 Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
    Glass coverslip Raymond A Lamb 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
    Parafilm gasket American National Can Company Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
    Two perspex parallel plates Wolfson Applied Technology Laboratory Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
    Electronic 3-way microvalve with min. dead space Lee Products Ltd. LFYA1226032H Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
    Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) Harvard Apparatus 70-2001 Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
    L-shaped connector Labhut LE876 To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
    Video camera Qimaging 01-QIC-F-M-12-C Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
    Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics 41N70000-61592 For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
    Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
    2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
    3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
    4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
    5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
    6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
    7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
    8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
    9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
    10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
    11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
    12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
    13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
    14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177 (2009).
    15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
    16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
    17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
    18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
    19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
    20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
    21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
    22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
    23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
    24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
    25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
    26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
    27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
    28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
    29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
    30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

    Tags

    אימונולוגיה גיליון 95 תאי האנדותל כדוריות דם לבנות תאי סטרומה mesenchymal תאי גזע mesenchymal התרבות משותפת הדבקה דלקת גיוס לזרום assay הידבקות מבוסס microslide Ibidi נויטרופילים
    ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G.… More

    Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp. (95), e52480, doi:10.3791/52480 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter