Summary
La capacidad del endotelio inflamado para reclutar leucocitos de flujo se regula por las células estromales mesenquimales. Se describen dos modelos in vitro que incorporan células humanas primarias que se pueden utilizar para evaluar el reclutamiento de neutrófilos de flujo y examinar el papel que las células estromales mesenquimales desempeñan en la regulación de este proceso.
Abstract
Las células del estroma regulan el reclutamiento de leucocitos circulantes durante la inflamación a través de la diafonía con células endoteliales vecinas. Aquí se describen los dos modelos "in vitro" en vasculares para estudiar el reclutamiento de neutrófilos circulantes de flujo por las células endoteliales inflamadas. Una gran ventaja de estos modelos es la capacidad de analizar cada paso en la cascada de adhesión de leucocitos en orden, como ocurriría in vivo. También describimos cómo ambos modelos se pueden adaptar para estudiar el papel de las células del estroma, en este caso las células madre mesenquimales (MSC), en la regulación de reclutamiento de leucocitos.
Células endoteliales primarias se cultivaron solas o junto con MSC humano en contacto directo en microportaobjetos ibidi o en lados opuestos de un filtro Transwell durante 24 horas. Los cultivos se estimularon con factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) durante 4 horas y se incorporan en un ensayo de adherencia basado en el flujo. Un bolo de neutrófilos se perfundiósobre el endotelio durante 4 min. La captura de fluir neutrófilos y sus interacciones con el endotelio fue visualizado por microscopía de contraste de fase.
En ambos modelos, la estimulación de citoquinas-aumento del reclutamiento de neutrófilos endotelial que fluyen de una manera dependiente de la dosis. Análisis del comportamiento de los neutrófilos reclutados mostró una disminución dependiente de la dosis en la rodadura y un aumento dependiente de la dosis en la transmigración a través del endotelio. En co-cultivo, MSC suprimida la adhesión de neutrófilos al endotelio TNF estimulada.
Nuestros modelos de adhesión basados en el flujo imitan las fases iniciales de reclutamiento de leucocitos de la circulación. Además de leucocitos, pueden usarse para examinar el reclutamiento de otros tipos de células, como las células tumorales circulantes MSC o administrados terapéuticamente. Nuestros modelos de co-cultivo de varias capas han demostrado que el MSC se comunica con el endotelio de modificar su respuesta a las citoquinas pro-inflamatorias, Altering el reclutamiento de neutrófilos. Se requiere investigación adicional utilizando dichos modelos para entender completamente las células estromales de la forma de diferentes tejidos y condiciones (trastornos inflamatorios o cáncer) influyen en el reclutamiento de leucocitos durante la inflamación.
Introduction
La inflamación es una respuesta protectora a la infección microbiana o la lesión del tejido que requiere una estrecha regulación de la entrada de leucocitos y salida de el tejido inflamado para permitir la resolución 1,2. Cross-talk entre las células endoteliales (CE) que los vasos sanguíneos línea, leucocitos circulantes y las células del estroma residente de tejidos es esencial para coordinar este proceso 3. Sin embargo, la contratación incontrolado de leucocitos y su limpieza ineficaz de apuntalan el desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas 4. Nuestra comprensión actual de reclutamiento de leucocitos en la salud y la enfermedad es incompleta y se necesitan modelos más robustos para analizar este proceso.
Los mecanismos de apoyo el reclutamiento de leucocitos de la sangre a través de CE vascular en las vénulas post-capilares han sido bien descritos 1,2,5. Leucocitos circulantes son capturados por los receptores especializados (por ejemplo, VCAM-1, E-selectina, P-selectina), queestán reguladas por el endotelio inflamado. Estas interacciones transitorias permiten leucocitos interactuar con quimiocinas unidas a la superficie y mediadores derivados de lípidos (ya sea endoteliales o estroma en origen) que activan las integrinas expresadas por los leucocitos 6- 11. Esto a su vez estabiliza la adhesión y la migración de las unidades a través del endotelio y en el tejido 12- 15. Dentro del tejido, reclutados leucocitos se someten a los agentes derivado del estroma que influyen en su motilidad, la función y supervivencia 16,17. La creciente evidencia sugiere que las señales recibidas en cada etapa de las condiciones del proceso de reclutamiento de leucocitos para la próxima. Sin embargo, nuestra comprensión de reclutamiento de leucocitos sigue siendo incompleta y muy poco se sabe sobre el movimiento de leucocitos componentes conformación dentro del tejido.
En Birmingham hemos desarrollado varios modelos in vitro "vasculares" para estudiar el reclutamiento de leucocitos defluir 9,18,19. Ahora entendemos que vascular acto CE reguladores como inmediatos de reclutamiento de leucocitos en respuesta a los cambios en su microambiente local. Específicamente, las células del estroma de tejido residente pueden regular activamente la respuesta inflamatoria, en parte por conversar con vecinos CE vascular para influir en su papel en el reclutamiento 3. Hemos demostrado anteriormente que las diversas células del estroma modulan la capacidad de CE para apoyar la adhesión y migración de leucocitos en un tejido de manera específica, y que estos efectos se vuelven alterada en enfermedades crónicas 13,16,20,21. Así, las células del estroma de tejido establecen 'de direcciones códigos' que definen el contexto de cada respuesta inflamatoria 22. Más recientemente, hemos demostrado que la médula ósea derivada MSC (BMMSC) potentemente regular a la baja la respuesta de la CE a las citoquinas, lo que lleva a una reducción en el reclutamiento de neutrófilos y linfocitos 23.
Los mecanismos govreclutamiento sejo de dilucidado in vitro han utilizado en gran medida ensayos que incorporan un solo tipo de células (por ejemplo, CE) o la proteína aislada. Sin embargo, estos estudios no tienen en cuenta los efectos del entorno local de los tejidos (es decir, la presencia de células del estroma) en el reclutamiento de leucocitos y su posterior migración en el tejido. Aquí se describen dos métodos basados en el flujo en el que las células del estroma, específicamente las células madre mesenquimales (MSC), somos co-cultivadas con CE 23. Estos modelos nos permiten examinar el efecto de las células del estroma en las respuestas endoteliales, en particular su capacidad para apoyar el reclutamiento de leucocitos de flujo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias humanos y células madre mesenquimales
- Celdas de aislamiento y cultivo de humanos umbilicales endoteliales de la vena (HUVEC):
- Ponga el cordón umbilical en una bandeja con papel de cocina y rocíe con etanol al 70%. Colocar en una campana de cultivo de tejidos. Identificar la vena y canular en ambos extremos. Coloque un cable de sujeción alrededor del extremo canulado para asegurarlo.
- Lavar la sangre venosa con PBS utilizando una jeringa. Llene la jeringa con aire y pasar a través de la vena de retirar y desechar el PBS residual.
- Descongelar 10 mg / ml de colagenasa tipo Ia y diluir 1:10 en PBS (con el calcio y cloruro de magnesio) a una concentración final de 1 mg / ml. Pase solución de colagenasa en la vena hasta que se cubran las dos cánulas. Cierre las abrazaderas en cánulas en ambos extremos.
- Cubra la bandeja con el tejido y rociar con etanol al 70%. Coloque el cable en una incubadora durante 20 minutos a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Tome el cable de salidade la incubadora y apriete las ataduras de cables. Masajear el cordón suavemente durante 1 min. Lave la suspensión celular con 10 ml de PBS y recoger en un tubo de centrífuga de 50 ml.
- Llene la jeringa con aire y pasar a través de la vena para eliminar cualquier PBS residual dos veces, recogiendo el PBS en un tubo de centrífuga de 50 ml usado en la etapa 1.1.5. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA.
- Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 1 ml de medio completo CE. Medio CE consiste en M199 suplementado con 35 g / ml de sulfato de gentamicina, 10 ng / factor de crecimiento epidérmico humano ml, 1 mg / ml de hidrocortisona, 2,5 mg / ml de anfotericina B, y 20% de suero de ternera fetal.
- Añadir 4 ml de medio de CE y la suspensión CE a un matraz de 25 cm 2. Cambie el medio al día siguiente y luego cada 2 días.
- CE presenta una morfología de adoquines como (Figura 1Ai). Para los ensayos de adhesión, EC generalmente se sembró cuando alcanzan el 100% de confluencia (véase la Sección 1.4
- Aislamiento de células madre mesenquimales gelatina de Wharton (WJMSC) de cordones umbilicales humanos:
- Aislar jalea derivado de MSC de Wharton (WJMSC) a partir de cordones umbilicales frescas o de los cables que ya han sido usados para aislar CE. Cortar el cordón umbilical en 5 cm piezas largas. Cortar cada pieza longitudinalmente para revelar los vasos sanguíneos (arterias 2 [blancos, rígida] y 1 vena [amarillo, distendido]).
- El uso de tijeras y pinzas estériles eliminar los vasos sanguíneos y descartan. Cortar todo el tejido poner el 2 - 3 mm 3 piezas. Con unas pinzas lugar 2-3 mm 3 piezas en un tubo de centrífuga de 50 ml.
- Descongelar 100 mg / ml de colagenasa tipo de stock II y diluir 1: 100 en 10 ml de PBS a una concentración final de 1 mg / ml. Descongelar 20000 U / ml de stock hialuronidasa y diluir 1: 400 a una concentración final de 50 U / ml en la solución de colagenasa.
- Añadir cóctel enzimático para el tubo de centrífuga que contiene los fragmentos de tejido. Incubar los fragmentación del tejidots de 5 horas a 37 ° C en un rotador lento.
- Diluir la suspensión de células 1: 5 en PBS. Colocar un filtro de 100 micras de poro en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Verter la suspensión de células en el filtro de poro 100 micras.
NOTA: fragmentos de tejido restante será retenido en el filtro y las células se recogerá en el tubo de centrífuga de 50 ml. - Deseche el filtro. Centrifugar la suspensión de células a 400 xg durante 10 min a TA. Aspirar el sobrenadante y pellet WJMSC resuspender en 12 ml de medio de cultivo WJMSC completo (DMEM bajo de glucosa, 10% de FCS y 100 U / ml de penicilina + 100 mg / ml de estreptomicina) de mezcla.
- Semillas todas las células en un 75 cm 2 frasco de cultivo de tejidos. Cambie el medio después de 24 horas con 12 ml de medio de cultivo WJMSC completa. Reemplace medio cada 2-3 días. Las células deben llegar al 70 - 80% de confluencia dentro de 2 semanas. Pasaje cuando WJMSC alcanzar 70-80% de confluencia (ver sección 1.4).
- La expansión de MSC derivada de la médula ósea (BMMSC):
- Descongelar un vial de p2 BMMSC colocando en un 37 ° C baño de agua durante 2 min. Añadir la suspensión BMMSC al tubo de centrífuga que contiene MSCGM. Mezclar bien con la pipeta.
- Centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA. Aspirar el sobrenadante por completo.
- Resuspender las células en 1 ml MSCGM y cuentan las células utilizando un hemocitómetro o un contador celular digital, como un cellometer.
- Sembrar las células en frascos de cultivo de 75 cm 2 a una densidad de 5000 - 6000 células por cm 2 en 12 ml MSCGM. Cambie el medio después de 24 horas con 12 ml MSCGM. Células de alimentación con 12 ml MSCGM cada 2 - 3 días.
- Pasaje cuando BMMSC alcanzar 70-80% de confluencia (ver sección 1.4). Las células exhiben una morfología fibroblástica (Figura 1Aii).
- Para pases de MSC, pellet se resuspende en medio de cultivo de 3 ml. Añadir 11 ml de medio de cultivo en tres matraces de cultivo de 75 cm 2 separadas. Añadir 1 ml de suspensión celular a cada frasco de cultivo (1: 3 split). WJMSC Pasaje y BMMSC 3 veces (p3) antes de su uso en ensayos de co-cultivo.
- Para la siembra de la CE o MSC en los ensayos de adhesión - ver las secciones 2 y 3.
- En el paso 3 detach MSC como se describe en la Sección 1.4. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 3 ml CryoSFM enfriado con hielo. Pipeta alícuotas de 1 ml de suspensión de células en 1,5 ml crioviales heladas. Ponga crioviales en un recipiente de congelación.
- Guarde el recipiente a -80 ° CO / N. Traslado al nitrógeno líquido. Descongele vial de MSC (siga los pasos 1.3.1 - 1.3.6). Resuspender MSC en 5 ml de medio de cultivo (elegir medio apropiado para WJMSC o BMMSC) y semilla en un matraz de 25 cm2.
2. Establecimiento de Células Madre Co-culturas endotelial-mesenquimales en ibidi microportaobjetos
- Tripsinizar un cm 2 matraz confluente 25 de la CE (~ 1.5 x 10 6 células; como la Sección 1.4). Resuspender CE en 380 l MSCGM (1 x 25 cm 2 frasco sembrará dos microportaobjetos 6 canales ibidi (~ 1,25 x 10 5 / canal), para los ensayos de adhesión de todo ty celularpes se cultivan en MSCGM). Añadir 30 l de suspensión CE en cada canal (esto cubrirá el área de crecimiento a través de la acción capilar). Incubar ibidi microportaobjetos a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 1 hora.
- Añadir 140 l MSCGM a cada canal y luego aspirar apagado. Repetir dos veces para un total de 3 lavados. Añadir 140 l MSCGM y lugar en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 24 horas.
- Para co-cultivos separar MSC (Sección 1.4). Realizar un recuento de células utilizando un hemocitómetro o un cellometer. Ajustar la concentración de MSC a 1,5 x 10 5 células / ml.
- Aspirar el exceso de medio de los canales de ibidi (dejando sólo el área de crecimiento del canal en el medio). Añadir 30μl de MSC suspensión a los canales ibidi. Aspirar el medio que fue expulsado de la zona de crecimiento del canal y añadir otros 30 l de MSC suspensión. Repetir una vez más y luego colocar el microportaobjetos ibidi en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 </ Sub> durante 1 hora.
- Añadir 140 l MSCGM a cada canal y luego aspirar apagado. Repetir dos veces para un total de 3 lavados. Añadir un volumen final de 140 l MSCGM a cada canal y el lugar en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 24 horas.
- Descongelar 1 x 10 5 U / ml TNF y diluir 1: 1000 en MSCGM a una concentración final de 100 U / ml (equivalente a ~ 10 ng / ml). Realizar una dilución en serie mediante la dilución de 100 U / ml por TNFa 1:10 en MSCGM para obtener 10 U / ml. Diluir 10 U / ml por TNFa 01:10 en MSCGM para obtener 1 U / ml.
- Tratar canales con TNFa a 37 ° C durante 4 horas antes del ensayo. Las fluctuaciones de temperatura durante el tratamiento con citocinas alterarán los patrones de reclutamiento de neutrófilos observados. Añadir MSCGM fresco a los canales no tratados.
3. Establecer endotelial-mesenquimales Células Madre Co-culturas de Filtros
- Separe WJ o BMMSC como se describe en la Sección 1.4. Resuspender el precipitadoen 1 ml MSCGM. Realizar unas células recuento de células utilizando un hemocitómetro o un cellometer.
- Ajuste el volumen de forma que la concentración final es de 5 x 10 5 MSC en 500 l de MSCGM.
- Usando una pinza estéril invierten 6-bien, 0.4 micras filtros PET Transwell y colocar en una caja estéril.
- Semilla de 5 x 10 5 MSC sobre la superficie exterior de los filtros. Incubar filtros a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 1 hora.
- Recoger los medios de comunicación desde la superficie exterior del filtro. Cuente el número de no-adherente MSC en los medios de comunicación. Re-invertido filtros utilizando una pinza estéril y colocar en una placa de 6 pocillos a juego contiene 3 ml MSCGM.
- Añadir 2 ml de MSCGM sobre la superficie interior del filtro (Figura 1B). Coloque en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 24 horas. Tripsinizar un cm 2 matraz confluente 25 de la CE (Figura 1Ai; como la Sección 1.4).
- Resuspender CE en 8 ml MSCGM (1 x 25 cm 2 frasco will semilla cuatro filtros de 6 pocillos; ~ 5 x 10 5 CE / filtro). Aspirar medio de la parte superior e inferior de los filtros porosos. Añadir 3 ml MSCGM fresco en la cámara inferior (debajo del filtro). Añadir 2 ml de suspensión CE a la superficie interior de cada filtro. Incubar durante 1 hora a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Aspirar a medio lavar CE no adherente y reemplazar con fresco MSCGM. Configurar filtros de monocultivo paralelas CE por la siembra de células en la superficie interior sin primero MSC siembra. Incubar O / N a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Compruebe que la monocapa CE es confluente y no contiene lagunas. Monocapas confluentes Sub-no se pueden utilizar para ensayos de adhesión (Figura 1B).
- Tratar las cámaras superior e inferior de los filtros con 1, 10, o 100 U / ml TNF (equivalente a ~ 10 ng / ml) a 37 ° C durante 4 h antes del ensayo (descrito en la Sección 2).
4. Aislamiento de leucocitos
- Tome venosasangre de voluntarios sanos y alícuota inmediatamente en tubos de EDTA. Tubos Invertir suavemente para mezclar.
- Capa de 2,5 ml Histopaque 1077 Onto 2,5 ml Histopaque 1119 en unos 10 ml de fondo redondo tubo. Capa 5 ml de sangre entera en el gradiente Histopaque. Centrifugar a 800 xg durante 40 min a TA.
- Neutrófilos periféricos Cosecha polimorfonucleares (PMN) en la interfaz de Histopaque 1077 y 1119 (por encima de la capa de eritrocitos). Colocar en un tubo redondo de 10 ml de fondo y completar hasta 10 ml con PBSA. Invertir suavemente el tubo y centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA.
- Diluir solución de BSA 7,5% 1:50 en 100 ml de PBS (con calcio y cloruro de magnesio) a una concentración final de 0,15% (w / v; PBSA). Aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 ml PBSA. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA.
- Volver a suspender en 1 ml PBSA. Tomar una alícuota de 20 l de la suspensión celular y añadir a 380 l PBSA (dilución 1:20). Contar las células utilizando un hemocitómetro o un cellometer. Diluir a la conce requeridontration (1 x 10 6 / ml para los filtros Transwell y ibidi MicroSlide) en PBSA. Mantener la suspensión de neutrófilos a TA hasta el ensayo.
5. Montaje del sistema de flujo
- Establecer el sistema de flujo como se muestra en la Figura 1C. Encienda el calentador y se puso a 37 ° C. Conecte una jeringa de 20 ml (quitar el émbolo) y una jeringa de 5 ml a un grifo de 3 vías. Coloque el grifo a la cámara de plexiglás utilizando cinta Micropore.
- Mida y corte un pedazo largo de silicio 4.2 mm (grosor) de tubos que es aproximadamente la distancia entre la válvula y el 3 vías grifo. Cortar un 8-10 mm de largo pedazo de 1/3 mm tubo (fina) y se insertan en un extremo de la tubería de espesor. Coloque el lado de tubos de espesor en la de 3 vías del grifo.
- Conecte el extremo del tubo delgado en un puerto de la 3-forma electrónica microválvula. Este es el "depósito de lavado". Corte un 6 - pedazo largo de 8 mm de tubo grueso y delgado.
- Introduzca el tubo delgado en un extremo de la tubería de espesor. AttACH termina el tubo de espesor sobre una jeringa de 2 ml (quitar el émbolo).
- Conectar el extremo delgado tubo de la jeringa 2 ml en un puerto en la microválvula electrónica para hacer que el "depósito de muestras". Conectar la válvula a la cámara de flujo de filtro mediante la medición y corte de una pieza larga de tubo delgado que es la distancia entre la microválvula y el centro de la platina del microscopio.
- Para el modelo MicroSlide, adjuntar un 8 - mm de espesor trozo de tubo 10 hasta el final de la tubería delgada. Publicar un conector en forma hasta el final de la tubería de espesor L. Este se conectará a la microportaobjetos. Para el modelo de filtro, adjuntar un 8 - mm pieza de Portex Blue Line Manómetro 10 la conexión de tubos hasta el final de la tubería delgada.
- Coloque el extremo delgado tubo sobre la microválvula. Esta es la salida común para los depósitos de lavado y de muestra. Llene los depósitos con PBSA. Primer tubo haciendo fluir a través de ellos PBSA para eliminar las burbujas de aire.
- Conecte el tubo del manómetro a un 29 mm (50 ml) s vidrioyringe. Prepare la jeringa rellenando con 10 ml PBSA. Invertir la jeringa de modo que el extremo conectado a la tubería orientada hacia arriba y empujar hacia fuera todas las burbujas de aire. Rellene con 5 ml PBSA.
- Para el modelo MicroSlide solamente, adjuntar un 10 - pieza de 12 mm de tubo grueso para el extremo del tubo del manómetro que conduce a la jeringa de vidrio. Publicar un conector en forma en el extremo de la tubería de espesor L. Coloque la jeringa de vidrio en una bomba de jeringa para infusión / retirada.
- Calcular el caudal de recarga (Q) que se requieren para generar la tensión de cizallamiento deseada (τ w en Pascal, Pa) de 0,1 (filtros Transwell) Pa o 0,05 (microportaobjetos ibidi) Pa utilizando las siguientes fórmulas:
γ w = (6.Q) / (wh 2)
τ = n.γ
Donde w = anchura interna y h = profundidad interna del canal de flujo. n = viscosidad de la solución que fluye; PBSA es n = 0,7 mPa.s. Para la cámara de flujo del filtro de placas paralelas, la anchura (w) es de 4 mm y la profundidad (h) es 0,133 mm. El depth de la cámara puede variar ligeramente debido a diferencias en el espesor de la junta de Parafilm utilizado. Para el MicroSlide ibidi, la anchura es de 3,8 mm y la profundidad es de 0,4 mm.
NOTA: Debido a las diferencias en las dimensiones del canal de flujo, y la dinámica de captura se utilizan diferentes tensiones de cizallamiento para el modelo MicroSlide en comparación con el modelo de filtro 6.
6. Instalación de la placa de la cámara de flujo paralelo incorporación de filtros
- Cortar un trozo de Parafilm (el mismo tamaño que el cubreobjetos de vidrio) utilizando una plantilla de metal. Cortar una ranura de 20 x 4 mm en el Parafilm (para crear el canal de flujo) usando una plantilla de metal. Utilice la junta para marcar el canal de flujo en el portaobjetos de vidrio.
- Alinear los bordes del filtro de 6 pocillos en el cubreobjetos de vidrio. Asegúrese de que el filtro abarca las marcas de canales de flujo. Extraer con cuidado el filtro con un bisturí tipo 10A.
- Cubrir cuidadosamente el filtro con una junta de Parafilm, asegurando que el canal de flujoranura está en el medio del filtro (Figura 1D). Use un pedazo de pañuelo de papel limpio y empuje las burbujas.
- Coloque el cubreobjetos en el rebaje de la placa inferior de la cámara de flujo Perspex. Coloque la placa de plexiglás superior sobre la parte superior de la junta y atornillar las placas juntos (Figura 1D).
- Gire el grifo de 3 vías para permitir la solución de lavado (PBSA) fluya a través de la válvula. Conectar tubo del manómetro al puerto de entrada de la placa de Persex parte superior. Ejecutar PBSA a través del canal de flujo para permitir que las burbujas pasen a través.
- Conectar el tubo del manómetro de la bomba de jeringa en el orificio de salida de la placa de Perspex. Ajuste la bomba de jeringa para rellenar y pulse run. Limpie cualquier PBSA que ha goteado sobre la placa superior de la cámara.
- Coloque la cámara en el escenario de un microscopio invertido de contraste de fases. Ajuste el enfoque para visualizar la CE por encima de los filtros (Figura 1B).
7. Configuración microportaobjetos para Flujo </ P>
- Coloque el microportaobjetos en el escenario de un microscopio de contraste de fase invertida. Conecte el conector en forma de L en el puerto de entrada de un canal. Ejecutar PBSA a través del canal de flujo.
- Coloque el conector en forma de la bomba de jeringa en el orificio de salida del canal L. Ajuste la bomba de jeringa para rellenar y pulse run. Limpie cualquier PBSA que ha goteado sobre la microportaobjetos. Ajuste el enfoque de visualizar la monocapa CE.
8. La perfusión de células endoteliales Leucocitos Over
- Poner 2 ml de neutrófilos purificadas en el depósito de la muestra y dejar calentar durante 2 minutos. Lave el endotelio con PBSA durante 2 min.
- Abra la válvula para perfundir los neutrófilos sobre el endotelio. Entregar el bolo de neutrófilos durante 4 min. Desconectar la válvula y perfundir PBSA desde el depósito de lavado durante el resto del experimento.
- Asegúrese de que el aire burbujas no pasan a través del canal de flujo en cualquier punto durante el ensayo, ya que esto interrumpir el monolay CEer y causa el desprendimiento de los neutrófilos adherentes.
9. Grabación de neutrófilos Captura y Comportamiento
- Neutrófilos reclutamiento Record ya sea durante el flujo de neutrófilos o post-perfusión.
- Hacer todas las grabaciones digitales de al menos de 5 - 10 campos en el centro del canal de flujo. Identificar el centro del canal moviendo el objetivo hasta el borde del canal en el puerto de entrada y la identificación de la mitad del puerto.
- Para la grabación durante el flujo de neutrófilos, tomar imágenes de un solo campo cada 10 seg durante 1 min. Mover a lo largo del canal y grabar otro campo durante 1 min. Repita el procedimiento para la duración del bolo.
- Para la grabación de post-perfusión, hacer 10 seg de grabación de 5 - 10 campos por el centro del canal de flujo para evaluar el comportamiento de leucocitos (típicamente 2 min después del final del bolo de neutrófilos). Tome imágenes cada segundo dentro del intervalo de 10 seg. Esto permite tiempo suficiente para la captura de flujo y el comportamiento de neutro adherentephils para ser analizados.
- Grabar un solo campo que contiene al menos 10 transmigrados neutrófilos durante 5 min, tomando imágenes cada 30 seg. Esto se puede utilizar para calcular la velocidad de células migradas (ya sea por encima o por debajo del endotelio).
- Registre otra serie de 10 campos seg (típicamente 9 minutos después de la perfusión). Esto permite tiempo para los neutrófilos migran a través de la monocapa endotelial.
- Pare la bomba de jeringa y retire el tubo. Desmontar la cámara de flujo y enjuagar el depósito de muestras y el tubo. Repita para filtros posteriores / canales MicroSlide.
10. Análisis de reclutamiento de leucocitos y Comportamiento
- Cuente el número de neutrófilos en cada campo durante los 10 grabaciones SEC en el punto de tiempo de 2 min. Todas las células deben estar presentes en el primer segundo campo con el fin de ser contados. Las células que son parcialmente en el campo en los 2 lados (por ejemplo, superior / fronterizas mano derecha) del campo de visión se incluyen enlos recuentos, siempre y cuando se mantengan en el campo para el 10 sec completa.
- Calcular la media del número de neutrófilos por campo adherente. Medir la longitud y la anchura del campo de grabado. Calcular el área del campo. Calcular cuántos campos hay en 1 mm 2. Multiplicar el recuento medio de neutrófilos por el número de campos en 1 mm 2.
- Calcular el número total de neutrófilos perfundidos multiplicando la cantidad de neutrófilos perfundido (por ejemplo, 2 x 10 6 / ml * Q [por ejemplo, 0,0999 ml / min para la cámara de flujo de placas paralelas]) por la duración del bolo (por ejemplo, 4 min ).
- Divida el recuento de neutrófilos / mm 2 por el número total de neutrófilos perfundidos para determinar el número total de células que se han adherido (adherente células / mm 2/10 6 perfundido).
- Evaluar si los neutrófilos adherentes están rodando, firmemente adherente o transmigrado (Video suplementario 1 y 2).
- Laneutrófilos rodadura es de fase brillante y se moverá lentamente a lo largo de la monocapa endotelial (1 - 10 m / seg; vídeo complementario 1).
- Células firmemente adherentes son de fase brillante y unido a la superficie CE, ya sea restante estacionaria (es decir, no se mueve durante la grabación) o han sido sometidos a cambiar de forma y están migrando sobre la superficie CE (Figura 1Ei).
- Un neutrófilo es transmigrado fase oscura y por debajo de la capa de la CE (Figura 1Eii).
- Calcular el porcentaje de células adherentes que están rodando, papelería y transmigrado. Alternativamente, el comportamiento de neutrófilos puede ser expresado como número total de células que muestran los diferentes comportamientos mediante la aplicación de la misma fórmula utilizada para calcular la adherencia total (como se describe en los pasos 10.6 a 10.7).
- Marque el borde delantero de una neutrófilos rodadura. Marcan el borde delantero de la misma célula en el extremo de la secuencia de 10 seg. Dibuja una línea de apuestaween los 2 puntos y medir la distancia que ha viajado la célula.
- Divida este valor por la duración de la grabación en el que la célula está rodando (es decir, 10 segundos). Trate de seleccionar los neutrófilos que están en el campo durante todo el intervalo de 10 seg.
- Para calcular la velocidad de neutrófilos que migran sobre la superficie (en forma brillante fase cambiada) o por debajo del endotelio (oscuro fase) utilizar la grabación (Video complementaria 2) 5 min.
- Dibuje un esquema de células que migraron al principio de la secuencia y el seguimiento de sus movimientos a lo largo de la secuencia. Tome nota de las posiciones X e Y del centroide en cada intervalo de 1 min para cada celda. Restar valores de la posición X e Y de la primera imagen de la secuencia de los valores de la segunda imagen. Esto se basa en el teorema de Pitágoras.
- Resta los valores de la segunda imagen de la tercera imagen. Haga esto para todas las imágenes de la secuencia. T Plazaél valores X e Y y sumarlos.
- La raíz cuadrada del valor resultante. Calcular la velocidad para cada celda promediando las velocidades calculadas en cada intervalo de minutos. Track 10 emigró neutrófilos y calcular la velocidad media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inicialmente, se analizó el efecto de estimular la CE con TNFa en el reclutamiento de neutrófilos de flujo utilizando el modelo microportaobjetos ibidi (Sección 7-9). En ausencia de TNF, poco o ningún neutrófilos se adhirieron a la monocapa endotelial (Figura 2A). Esto se esperaba, ya que sin tratar / descansando CE no expresan las moléculas necesarias de adhesión (selectinas) o quimiocinas para apoyar la unión 25,26. En contraste, la estimulación por citoquinas aumentó significativamente la adhesión de neutrófilos al endotelio de una manera dependiente de la dosis (Figura 2A). Adhesión normalmente se mantiene estable en el transcurso del ensayo. La unión de los leucocitos al endotelio sin tratar indica que o bien la CE se activan (es decir, contaminado con LPS durante el proceso de cultivo) y / o los neutrófilos se activaron durante el proceso de aislamiento. De hecho, LPS se ha demostrado que aumenta la expresión de E-selectina, ICAM-1 y VCAM-en 25 a 27 en la superficie de CE, que les permite unirse neutrófilos.
Al analizar el comportamiento de los neutrófilos reclutados que normalmente se observa una disminución dependiente de la dosis en el porcentaje de neutrófilos rodantes (Figura 2B) con un aumento dependiente de la dosis concomitante en el porcentaje de neutrófilos que migran a través de la monocapa endotelial (Figura 2C). A las dosis más bajas de TNF-estimulación (1 U / ml) una mayor proporción de neutrófilos aparecerá fase brillante que indica que están unidos a la superficie apical del endotelio (Figura 2B). En contraste, a los 10 y 100 U / ml (dosis superiores) aproximadamente el 40% de los neutrófilos reclutados aparece oscuro de fase en 2 min lo que indica que estas células han emigrado a través de la monocapa endotelial y son debajo del endotelio (Figura 2C). Los neutrófilos son capaces de migrar a través de la CE dentro de 1 - 2 min, con la transmigración de alcanzar mniveles aximal en ~ 10 minutos después de la perfusión 28. Aquí se observó un aumento en la transmigración de neutrófilos a partir de 40% en 2 min a 60% en 9 minutos después de la perfusión (Figura 2C). Se observó ningún efecto de la concentración de TNF en la velocidad de rodadura (~ 3 m / seg) o migración (~ 10 - 12 micras / min) neutrófilos.
En el modelo basado en filtro, TNF-estimulación aumenta la adhesión de neutrófilos de una manera dependiente de la dosis similar a la observada utilizando el modelo MicroSlide ibidi (Figura 3A). En términos de comportamiento, neutrófilos rodadura no se vio afectada por la dosis de TNF (Figura 3B), mientras que se observó un aumento dependiente de la dosis en el porcentaje de la transmigración (Figura 3C). En esta serie de experimentos se observó ningún efecto significativo de tiempo en la transmigración de neutrófilos (Figura 3C).
Proporcionamos métodos sobre cómo generar dos construcciones de co-cultivo diferentes, cada uno deque se idearon para responder a preguntas específicas. En el modelo de MicroSlide ibidi, CE y MSC son cultivadas en una sola monocapa en contacto directo uno con el otro. Este modelo es útil para examinar el efecto de la inyección terapéutica de MSC en la sangre y su posterior integración en la monocapa CE. En contraste en el modelo basado en filtro, CE y MSC se cultivan en lados opuestos del filtro en estrecha proximidad, pero no necesariamente en contacto directo. Esto se asemeja más estrechamente tejido, con las células endoteliales que forman una monocapa que representa el vaso sanguíneo, y el MSC que reside en el compartimento subendotelial. Esto nos permite examinar los efectos de MSC residente de tejido sobre la respuesta de la CE a la estimulación de citoquinas.
Basándonos en nuestra experiencia, se observa que el reclutamiento de neutrófilos máxima y la migración transendotelial ocurre cuando la CE se estimulan con 100 U / ml TNFa. Como tal, hemos utilizado esta concentración para examinar el efecto de MSC de co-cultivoen la contratación endotelial de los neutrófilos de flujo. A continuación, presentamos los datos para BMMSC en co-cultivo con CE mediante el microportaobjetos y modelos basados en filtros por ejemplo, sin embargo, otros tipos de MSC también se pueden examinar, WJMSC. En ambos modelos la presencia de BMMSC redujo significativamente la adhesión de neutrófilos a la CE en comparación con EC cultivadas solas (Figura 4A). Co-cultura no tuvo ningún efecto sobre el comportamiento de los neutrófilos reclutados, con niveles similares de rodadura y la transmigración observada en CE cultivado solo o con MSC (Figura 4 B y C). Por lo tanto, el MSC puede modificar la respuesta de las CE a la estimulación de citoquinas, que suprime su capacidad de apoyar el reclutamiento de neutrófilos de flujo.
Figura 1. Establecer EC-MSC co-cultivo y análisis de reclutamiento de neutrófilos mediante un ensayo de adhesión basado en el flujo. (A) (i) primaria CE y (ii) el paso 3 BMMSC cultiva en frascos de cultivo de tejidos. (B) Micrografía de CE y MSC cultivadas en 6 pocillos insertos Transwell de filtro. (C) Diagrama del sistema de perfusión utilizado para generar de flujo. (D) Representación esquemática de la cámara de flujo del filtro de placas paralelas. (E) Micrografía de (i) firmemente adherente (FA) y (ii) transmigrados (TM) neutrófilos siguiente a la contratación de flujo para CE estimulado con 100 U / ml TNF . Imágenes C y D se toman de las figuras 2 y 3 en Methods in Molecular Biology:. Trata de células T, 2010, pg 53-54 28 con el permiso de Springer Science and Business Media Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 2. neutrófilos reclutamiento de flujo para CE estimulada por TNF usando microportaobjetos ibidi CE se estimularon con concentraciones crecientes de TNF (0 - 100 U / ml) durante 4 h. Un bolo de 4 min de neutrófilos fue perfundido sobre la monocapa CE en 0,05 Pa. Adherencia (A) de neutrófilos evaluados en 2 min. ANOVA mostró un efecto significativo del tratamiento con TNF en la adhesión de neutrófilos, p <0,01. Comportamiento de neutrófilos se evaluó a las 2 y 9 min y se expresó como un porcentaje de células adherentes que eran (B) de laminación o (C) transmigrado. ANOVA mostró un efecto significativo del tratamiento con TNF en el comportamiento de los neutrófilos adherentes, p <0,001. En C, ANOVA mostró una significativa de tiempo en transmigrado neutrófilos p <0,01. Los datos son la media ± SEM de n = 3 experimentos. * P <0,05 y **p <0,01 en comparación con la no estimulada (0 U / ml) de control CE, por Dunnett post-test. ## p <0,01 y ### p <0,001 en comparación con el 1 U / ml CE en el mismo punto de tiempo por Bonferroni post- prueba.
. Figura 3. neutrófilos reclutamiento de flujo para CE estimulada por TNF usando un ensayo basado en filtro CE se estimularon con concentraciones crecientes de TNF (0 - 100 U / ml) durante 4 h. Un bolo de 4 min de neutrófilos fue perfundido sobre la monocapa CE a 0,1 Pa. Adherencia (A) de neutrófilos evaluados en 2 min. ANOVA mostró un efecto significativo del tratamiento con TNF en la adhesión de neutrófilos, p <0,001. Comportamiento de neutrófilos se evaluó a las 2 y 9 min y se expresó como un porcentaje de células adherentes que eran (B) de laminación o (C) transmigrado. En C, ANOVA shocasarse con un efecto significativo de tiempo y el tratamiento de citoquinas en la transmigración de neutrófilos, p <0,05. Los datos son la media ± SEM de n = 3 experimentos. ** P <0,01 y *** p <0,001 en comparación con la no estimulada (0 U / ml) de control CE, por Dunnett post-test. # P <0,05 en comparación con el CE 1 U / ml en el mismo punto de tiempo por el poste de Bonferroni -test.
Figura 4. neutrófilos reclutamiento de flujo para EC-BMMSC co-cultivos estimulados con TNF. BMMSC fueron co-cultivadas con EC durante 24 horas antes de la estimulación con 100 U / ml TNF durante 4 horas. Un bolo de 4 min de neutrófilos fue perfundido sobre la monocapa CE en 0,05 Pa durante (A, C, E) microportaobjetos y 0,1 Pa para (B, D, F) Filtros. (AB) de neutrófilos adherencia se evaluó a 2 min. El comportamiento de los neutrófilos se evaluó a los 2 y 9 men y expresado como un porcentaje de células adherentes que eran (CD) de laminación o (EF) transmigrado. En C y D, ANOVA mostró un efecto significativo de condiciones de cultivo sobre la rodadura de neutrófilos, p <0,05. En E y F, ANOVA mostró un efecto significativo de tiempo en la transmigración de neutrófilos, p <0,05. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en la transmigración entre los tratamientos individuales por Bonferroni post-test. Los datos son la media ± SEM de n = 5 experimentos. * P <0,05 en comparación con el monocultivo CE por la prueba t pareada o Bonferroni post-test.
Vídeo suplementario 1. Análisis de neutrófilos velocidades de laminación. CE cultivaron en un filtro Transwell fueron estimulados con 100 U / ml TNF durante 4 horas. Un bolo de neutrófilos fue perfundido sobre la CE para 4min. Representante secuencia digitalizada de un solo campo 10 seg toma 2minutos después de la perfusión. El cambio de posición de un solo neutrófilos rodadura desde el principio hasta el final de la secuencia de 10 seg se puede utilizar para calcular la velocidad a la que el neutrófilo está rodando.
Vídeo complementario 2. Análisis de velocidades de migración de neutrófilos. CE cultivó en un filtro Transwell fueron estimulados con 100 U / ml TNF durante 4 horas. Un bolo de neutrófilos fue perfundido sobre la CE durante 4 min. Representante secuencia digitalizada de un solo campo 5 min para rastrear el movimiento de los neutrófilos transmigradas. Esto se puede utilizar para calcular la velocidad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí se describen los dos modelos "in vitro" en vasculares para estudiar el reclutamiento de neutrófilos circulantes por endotelio inflamado. Una gran ventaja de estos modelos es la capacidad de analizar cada paso en la cascada de adhesión de leucocitos en orden, como ocurriría in vivo. Hemos observado anteriormente un aumento dependiente de la dosis en la adhesión de neutrófilos y la transmigración a través de TNF estimulada CE 9,29. También describimos cómo ambos modelos se pueden adaptar para estudiar los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos. Aquí, MSC fueron co-cultivadas con CE en una MicroSlide ibidi o en lados opuestos de un filtro poroso. Esto permite que ambos tipos de células que se comunican entre sí, modificando de este modo el fenotipo y la respuesta de cada uno. Hemos demostrado aquí, y en estudios previos 23, que la presencia de MSC suprime la adhesión de neutrófilos a CE estimulada por TNF. Esto indica que las células estromales modifican la respuesta de la CEa las citoquinas y posteriormente altera el reclutamiento de leucocitos circulantes.
Además de los modelos descritos anteriormente, Biochips Cellix, placas BioFlux y Glyotech cámaras de flujo de placas paralelas están comercialmente sistemas de canales de flujo disponibles que proporcionan una superficie para el cultivo de endotelio y la observación de reclutamiento. En todos los sistemas, ciertos parámetros deben ser considerados al mismo tiempo el establecimiento de cultivos endoteliales y la realización de los ensayos de adhesión basados en el flujo, algunas de las cuales se destacan a continuación y en los informes anteriores 30,31. Cualquier agentes anti-inflamatorios, como la hidrocortisona, que pueden afectar a las respuestas de citoquinas pueden faltar en el medio de la duración de la cultura y el ensayo de 18,29. Cuando se utiliza el ibidi MicroSlide garantizar que no haya burbujas de aire presentes en el canal de flujo durante la cultura de la CE ya que estos perturbar la monocapa CE. La integridad de la monocapa endotelial se debe confirmar antes de cytokine-tratamiento, como los neutrófilos se unirán a las lagunas en la monocapa donde la BSA ha revestido la microportaobjetos / filtro. También es esencial para asegurar que la CE se mantiene a 37 ° C en toda la citoquina TNF-estimulación, porque es sensible a la temperatura y sólo tiene el efecto máximo a 37 ° C. Para el ensayo de flujo en sí, seleccionar un tampón de lavado adecuado, normalmente utilizamos PBSA para ensayos cortos (menos de 30 minutos) y medio M199 suplementado con BSA (0,15%) para los ensayos más largos (1-48 hr) 30,31. Finalmente asegúrese de que no haya burbujas de aire presentes en el canal de flujo durante el ensayo, ya que esto altera el caudal, daña la monocapa CE y activa neutrófilos adherentes.
Una de las principales ventajas de los modelos multi-celulares in vitro descritos aquí es su capacidad para replicar las interacciones in vivo entre CE y células del estroma. Es difícil aislar los efectos de los componentes específicos del estroma in vivoy para modificar de una manera controlada. En nuestros modelos, las células estromales se pueden manipular para dilucidar cómo se comunican con CE e influyen en el proceso inflamatorio en la salud y la enfermedad. Por ejemplo, el uso de la tecnología siRNA ya hemos demostrado que la producción de IL-6 por el MSC en co-cultivo era necesario que sus efectos inmunosupresores 23. Cada modelo puede ser utilizado para hacer frente a cuestiones específicas, es decir, el efecto de las células residentes del tejido del estroma (modelo basado en filtros) o células del estroma administrados terapéuticamente (microportaobjetos ibidi y otros sistemas disponibles en el mercado) en el reclutamiento de leucocitos. En ambos casos hemos valorado diferentes tipos de células del estroma para asegurar su viabilidad y establecer una relación adecuada de células estromales de la CE para la evaluación de los efectos sobre el reclutamiento 15,25. Del mismo modo el medio de cultivo debe ser compatible con cada tipo de célula incorporado en el modelo. En nuestras manos co-cultivos se realizan típicamente en la célula estromal medio 11,18,23,31.
Usando el modelo basado en filtro, hemos demostrado previamente que diversas células del estroma modulan la capacidad de CE para apoyar la adhesión y migración de leucocitos en un tejido de manera específica y que estos efectos se vuelven alterada en enfermedades crónicas 3. Esto condujo a la idea de que las células del estroma establecen "códigos de dirección" específicos de tejido que regulan activamente el reclutamiento de leucocitos al tejido inflamado 24. Estos modelos están diseñados específicamente para examinar las etapas iniciales de reclutamiento en gran detalle pero son incapaces de estudiar la migración posterior dentro del espacio subendotelial (es decir, lejos del endotelio en el tejido). Construcciones 3D multi-celulares, de varias capas, como un ensayo de gel de colágeno estática 12,32 serían más apropiados para el estudio de estas últimas fases de la contratación.
Nuestros modelos de adhesión basados en el flujo son muy versátiles. Tenemos descrito su uso en el contexto de reclutamiento de neutrófilos, pero otros subconjuntos de leucocitos pueden ser investigados de una manera similar. También hemos utilizado el sistema microportaobjetos ibidi para investigar el reclutamiento de circular MSC por la CE 23, y si esto ocurre a través de la misma cascada de adhesión reportado para los leucocitos. Asimismo estos modelos podrían utilizarse para examinar el reclutamiento y la incorporación de líneas de células tumorales metastásicas, y sus consiguientes efectos en las respuestas endoteliales y el reclutamiento de leucocitos. Alternativamente, el modelo basado en filtro podría ser adaptada para incorporar diferentes tipos de células del estroma (por ejemplo, fibroblastos, podocitos, células de músculo liso) a partir de tejidos sanos 13,21 y sitios de la enfermedad 11,18,20. Esto permitiría al estudio de las vías reguladoras específicas de tejido que actúan a nivel de la CE sobre y / o leucocitos. En todos los casos, la interrupción de los procesos reguladores normales en una gama de condiciones de enfermedad puede ser examinada para identificar kemediadores de regulación Y (tales como IL-6 y TGF) y potenciales nuevas dianas terapéuticas. En el contexto de la inflamación crónica de estos agentes pueden ser utilizados para apagar el proceso de contratación, mientras que en la biología del cáncer se podría imaginar su uso para activar el reclutamiento para atacar el tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type Ia | Sigma | C2674 | Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots. |
| Dulbecco's PBS | Sigma | D8662 | With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT. |
| 1X Medium M199 | Gibco | 31150-022 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Gentamicin sulphate | Sigma | G1397 | Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle. |
| Human epidermal growth factor | Sigma | E9644 | Store at -20 °C in 10 µl aliquots. |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma | F9665 | FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C. |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0135 | Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots. |
| Collagenase Type II | Sigma | C6885 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots. |
| Hyaluronidase | Sigma | H3631 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots. |
| 100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used. |
| DMEM low glucose | Biosera | LM-D1102/500 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Penicillin/Streptomycin mix | Sigma | P4333 | Store at -20 °C in 1 ml aliquots. |
| 25 cc tissue culture flask | SLS | 353109 | |
| 75 cc tissue culture flask | SLS | 353136 | |
| Bone marrow mesenchymal stem cells vial | Lonza | PT-2501 | Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use. |
| Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS. |
| EDTA (0.02%) solution | Sigma | E8008 | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| Trypsin solution | Sigma | T4424 | Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately. |
| Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | Keep on ice before adding before adding cell suspension. |
| Mr. Frosty Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen. |
| Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile | Ibidi | IB-80606 | Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html). |
| Cell tracker green dye | Life technologies | C2925 | Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM. |
| Cell counting chambers | Nexcelom | SD-100 | Alternatively a haemocytometer can be used. |
| Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
| Tumor necrosis factor α (TNFα) | R&D Systems | 210-TA-100 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots. |
| 6-well, 0.4 µm PET Transwell filters | SLS | 353090 | |
| K2-EDTA in 10ml tubes | Sarstedt | Store at RT. | |
| Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Store at 4 °C. Warm to RT before use. |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Store at 4 °C. Warm to RT before use. |
| 10 ml round bottomed tube | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
| 7.5% BSA Fraction V solution | Life technologies | 15260-037 | Store at 4 °C. |
| 20 ml Plastipak syringes | BD falcon | 300613 | |
| 5 ml Plastipak syringes | BD falcon | 302187 | |
| 2 ml Plastipak syringes | BD falcon | 300185 | |
| 3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm | Micropore | 1530-1 | Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber. |
| Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) | Fisher Scientific | FB68854 | Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin. |
| Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) | Fisher Scientific | FB68855 | |
| Portex Blue Line Manometer tubing | Smiths | 200/495/200 | Tubing leading to the syringe pump. |
| 3-way stopcock | BOC Ohmeda AB | ||
| Glass 50 ml syringe for pump | Popper Micromate | 550962 | Must be primed prior to use by removing any air bubbles. |
| Glass coverslip | Raymond A Lamb | 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980. | |
| Parafilm gasket | American National Can Company | Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm. | |
| Two perspex parallel plates | Wolfson Applied Technology Laboratory | Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel. | |
| Electronic 3-way microvalve with min. dead space | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | Electronically connected to a 12 volt DC power supply. |
| Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate. |
| L-shaped connector | Labhut | LE876 | To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel. |
| Video camera | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded. |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities. |
| Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here. | |||
References
- Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
- Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
- Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
- Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
- Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
- Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
- McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
- McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
- Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177 (2009).
- Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
- Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
- Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
- Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
- Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
- Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
- Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
- Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
- Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
- Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
- Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
- Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
- Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
- Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).
