Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analysere effekten av stromalceller på rekruttering av leukocytter fra Flow

Published: January 7, 2015 doi: 10.3791/52480
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

Summary

Muligheten av betent endotel å rekruttere leukocytter fra strømning reguleres av mesenchymale stromale celler. Vi beskriver to in vitro-modeller som har primære humane celler som kan brukes til å vurdere neutrofil rekruttering fra strømningen og undersøke rollen som mesenchymale stromale celler spiller i å regulere denne prosessen.

Abstract

Stromalceller regulere rekrutteringen av sirkulerende leukocytter under betennelse gjennom krysstale med nabo endotelceller. Her beskriver vi to in vitro "vaskulære" modeller for å studere rekruttering av sirkulerende nøytrofile granulocytter fra flyten av betente endotelceller. En stor fordel ved disse modellene er evnen til å analysere hvert trinn i leukocyttadhesjon kaskade i rekkefølge, som ville forekomme in vivo. Vi beskriver også hvordan begge modellene kan tilpasses for å studere rollen til stromale celler, i dette tilfellet mesenchymale stamceller (MSC), i regulering av leukocytt-rekruttering.

Primære endotelceller ble dyrket alene eller sammen med human MSC i direkte kontakt på Ibidi microslides eller på motsatte sider av en Transwell filter i 24 timer. Kulturene ble stimulert med tumornekrosefaktor alfa (TNFa) i 4 timer og innlemmet i en strømningsbasert adhesjonsanalysen. En bolus av nøytrofile ble perfusertover endotelet i 4 min. Fangst av rennende nøytrofile og deres samspill med endotelet ble visualisert ved fasekontrastmikroskopi.

I begge modellene, økt cytokin-stimulering endothelial rekruttering av strømmer nøytrofile på en doseavhengig måte. Analyse av oppførselen til rekrutteres neutrofiler viste en doseavhengig reduksjon i rullende og en doseavhengig økning i transmigrasjon gjennom endotelet. I co-kultur, MSC trykt nøytrofiladhesjon til TNFa-stimulert endotelet.

Våre flytbasert-vedheft modeller ligne de innledende fasene av leukocytt rekruttering fra sirkulasjonen. I tillegg til leukocytter, kan de anvendes til å undersøke rekrutteringen av andre celletyper, slik som terapeutisk administrerte MSC eller sirkulerende tumorceller. Våre flerlags co-kultur modeller har vist at MSC kommunisere med endotelet til å endre sin respons på proinflammatoriske cytokiner, altering rekruttering av nøytrofile. Videre forskning ved hjelp av slike modeller er nødvendig for å fullt ut forstå hvordan stromale celler fra ulike vev og betingelsene (inflammatoriske lidelser eller kreft) påvirker rekruttering av leukocytter ved betennelse.

Introduction

Betennelse er en beskyttende respons på mikrobiell infeksjon eller vevsskade som krever tett regulering av leukocytt-inngang og utgang fra det betente vevet for å tillate oppløsning 1,2. Krysstale mellom endotelceller (EC) at linjen blodkar, utegående leukocytter og vev-bosatt stromalceller er viktig for å koordinere denne prosessen tre. Men ukontrollert rekruttering av leukocytter og deres ineffektive klaring ligger til grunn for utvikling av kroniske betennelsessykdommer 4. Vår nåværende forståelse av leukocytt rekruttering i helse og sykdom er ufullstendig og mer robuste modeller for å analysere denne prosessen.

Mekanismene som støtter rekruttering av leukocytter fra blod gjennom vaskulær EC i post-kapillære venuler har blitt godt beskrevet 1,2,5. Sirkulerende leukocytter fanges opp av spesialiserte reseptorer (f.eks VCAM-1, E-selectin, P-selektinantistoffer) somer oppregulert på betent endotelet. Disse forbigående interaksjoner tillate leukocytter å samhandle med overflate bundet kjemokiner og lipid-avledet formidlere (enten endotelceller eller stromal opprinnelse) som aktiverer inte uttrykt av leukocytter 6- 11. Dette i sin tur stabiliserer adhesjon og migrasjon stasjoner over endotelet og inn i vevet 12- 15. Innenfor vev, leukocytter rekrutteres utsettes for stromal-avledet midler som påvirker deres motilitet, funksjon og overlevelse 16,17. Økende bevis tyder på at signalene som mottas på hvert trinn i rekrutteringsprosessen vilkår leukocytter for den neste. Men vår forståelse av leukocytt rekruttering er fortsatt ufullstendig og svært lite er kjent om komponentene forme leukocytt bevegelse innenfor vev.

I Birmingham har vi utviklet flere in vitro "vaskulære" modeller for å studere rekruttering av leukocytter fraflyte 9,18,19. Nå forstår vi at vaskulær EC fungere som umiddelbare regulatorer av leukocytt rekruttering ta hensyn til endringer i deres lokale mikromiljøet. Nærmere bestemt, kan vev-resident stromalceller aktivt regulere betennelsesreaksjon, blant annet ved samtale med nabo vaskulær EC til å påvirke sin rolle i rekruttering tre. Vi har tidligere vist at forskjellige stromale celler modulerer evnen av EC å støtte adhesjon og migrasjon av leukocytter i en vev-spesifikk måte, og at disse virkninger blir endret i kroniske sykdommer 13,16,20,21. Dermed stromalceller etablere vev 'adresse-koder' som definerer konteksten av hver betennelsesreaksjon 22. Mer nylig, har vi vist at benmargs avledet MSC (BMMSC) potent nedregulerer responsen av EC til cytokiner, fører til en reduksjon i rekruttering av både neutrofiler og lymfocytter 23.

Mekanismene governing rekruttering belyst in vitro har i stor grad brukes analyser innlemme et enkelt celletype (f.eks EF) eller protein i isolasjon. Men disse studier ikke ta hensyn til virkningene av lokale vev miljø (dvs. tilstedeværelse av stromale celler) på rekrutteringen av leukocytter og deres påfølgende migrasjon inn i vevet. Her beskriver vi to strømningsbaserte metoder hvor stromalceller, spesielt mesenchymale stamceller (MSC), er co-kultivert med EC 23. Slike modeller tillate oss å undersøke effekten av stromal celle på endotelceller svar, spesielt deres evne til å støtte leukocytt rekruttering fra flyt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering og Culture of Primary humane endotelceller og stamceller

  1. Isolasjon og kultur av menneskelige navleveneendotel celler (HUVEC):
    1. Sett navlestreng på et brett med tørkepapir og spray med 70% etanol. Plassere i en vev kultur hette. Identifisere venen og cannulate i begge ender. Plasser en strips rundt cannulated slutt å sikre det.
    2. Vask med venøst ​​blod med PBS ved anvendelse av en sprøyte. Fyll sprøyten med luft og passerer gjennom venen å ta bort den gjenværende PBS.
    3. Tine 10 mg / ml kollagenase type Ia og fortynnet 1:10 i PBS (med kalsium og magnesium klorid) til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml. Passere kollagenaseoppløsning i venen før begge kanyler er fylt. Lukke klemmer på kanyler i begge ender.
    4. Dekk brettet med vev og spray med 70% etanol. Plasser ledningen til en inkubator i 20 min ved 37 ° C og 5% CO 2.
    5. Ta ledningen utav inkubatoren og stramme strips. Masser ledningen forsiktig i 1 min. Spyle ut cellesuspensjonen med 10 ml PBS og samles i et 50 ml sentrifugerør.
    6. Fylle sprøyten med luft og passerer gjennom venen for å fjerne eventuelle gjenværende PBS to ganger, oppsamling av PBS i et 50 ml sentrifugerør som brukes i trinn 1.1.5. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved RT.
    7. Aspirer supernatanten og resuspender pellet i en ml komplett EC middels. EC-mediet består av M199 supplert med 35 ug / ml gentamicin sulfat, 10 ng / ml human epidermal vekstfaktor, 1 ug / ml hydrokortison, 2,5 ug / ml amfotericin B og 20% ​​føtalt kalveserum.
    8. Tilsett 4 ml EC medium og EU suspensjonen til en 25 cm 2 kolbe. Endre medium på neste dag, og deretter hver 2. dag.
    9. EC utviser en brostein lignende morfologi (Figur 1Ai). For vedheft analyser, er EC generelt seedet når de når 100% samløpet (se punkt 1.4
  2. Isolering av Wharton gelé mesenchymale stamceller (WJMSC) fra humane navlestrengskabler:
    1. Isolere Wharton gelé-avledet MSC (WJMSC) fra ferske navlestrenger eller fra ledninger som allerede har blitt brukt til å isolere EC. Skjær navlestreng til 5 cm lange biter. Skjær hver brikke i lengderetningen for å avsløre blodårer (2 arterier [hvite, stive] og en vene [gul, oppblåst]).
    2. Ved å bruke steril saks og pinsett fjerne blodkar og kast. Skjær alt vevet inn i 2 - 3 mm 3 stk. Ved hjelp av pinsett sted 2 - 3 mm 3 stykker inn i et 50 ml sentrifugerør.
    3. Tine 100 mg / ml stam kollagenase type II og fortynnet 1: 100 i 10 ml PBS til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml. Tine 20.000 U / ml stam hyaluronidase og fortynnet 1: 400 til en sluttkonsentrasjon på 50 U / ml kollagenase i løsningen.
    4. Legg enzymatisk cocktail til sentrifugerør som inneholder vev fragmenter. Inkuber vev fragments i 5 timer ved 37 ° C på en rotator langsom.
    5. Fortynn cellesuspensjonen 1: 5 i PBS. Plasser en 100 pm pore-filter over i et nytt 50 ml sentrifugerør. Hell cellesuspensjonen på 100 um pore-filter.
      MERK: Gjenværende vevfragmenter vil bli holdt tilbake på filteret, og cellene vil bli oppsamlet i 50 ml sentrifugerør.
    6. Kast filteret. Sentrifugere cellesuspensjonen ved 400 xg i 10 min ved RT. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten WJMSC i 12 ml komplett WJMSC kulturmedium (DMEM lav glukose, 10% FCS og 100 U / ml penicillin + 100 ug / ml streptomycin blanding).
    7. Seed alle celler i en 75 cm2 vevskulturkolbe. Endre medium etter 24 timer med 12 ml komplett WJMSC kultur medium. Erstatte medium hver 2 - 3 dager. Cellene skal nå 70 - 80% samløpet innen 2 uker. Passasje når WJMSC nå 70 - 80% samløpet (se punkt 1.4).
  3. Utvidelse av benmarg-avledet MSC (BMMSC): Isolere human benmarg-avledede MSC (BMMSC) som tidligere beskrevet 24. Tilsett 10 ml forvarmet MSC vekstmedium (MSCGM) inn i et 15 ml sentrifugerør.
  4. Tine en ampulle med p2 BMMSC ved å plassere i en 37 ° C vannbad i 2 min. Tilsett BMMSC suspensjonen til sentrifugerør som inneholdt MSCGM. Bland godt ved pipettering.
  5. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved RT. Aspirer supernatanten helt.
  6. Resuspender celler i 1 ml MSCGM og telle celler ved hjelp av et hemocytometer eller et digitalt celleteller, for eksempel en cellometer.
  7. Seed celler i 75 cm 2 kulturflasker ved en tetthet på 5000 - 6000 celler per cm2 i 12 ml MSCGM. Endre medium etter 24 timer med 12 ml MSCGM. Fôr celler med 12 ml MSCGM hver 2 - 3 dager.
  8. Passasje når BMMSC nå 70 - 80% samløpet (se punkt 1.4). Celler utviser en fibroblastisk morfologi (Figur 1Aii).
  • Avløsning av EF og MSC: Aspirer medium fra 25 cm to kulturflasker. Tilsett 2 ml 0,02% EDTA i omtrent 2 min. Aspirer EDTA og tilsett 2 ml trypsin (2,5 mg / ml). Vis under mikroskopet før cellene blir runde.
  • Pek på kolben for å løsne cellene. Inaktivere trypsin ved tilsetning av 8 ml kulturmedium (avhengig av celletype; EC medium for HUVEC, DMEM LG for WJMSC og MSCGM for BMMSC) til kulturkolben og overføre suspensjonen til et 15 ml sentrifugerør.
  • Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved RT. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten som beskrevet nedenfor.
    1. For aging av MSC, resuspender pelleten i 3 ml kulturmedium. Legg 11 ml kulturmedium i tre separate 75 cm 2 kulturflasker. Tilsett 1 ml cellesuspensjon til hver kulturkolbe (1: 3-splitt). Passasje WJMSC og BMMSC 3 ganger (P3) før bruk i co-kultur analyser.
    2. For seeding EC eller MSC i vedheft analyser - se punkt 2 og 3.
  • Frysing MSC:
    1. Ved passering 3 løsne MSC som beskrevet i punkt 1.4. Aspirer supernatanten og resuspender i 3 ml iskald CryoSFM. Pipette 1 ml mengder av cellesuspensjonen inn 1,5 ml iskald cryovials. Sett cryovials i en frysebeholder.
    2. Oppbevar beholderen ved -80 ° CO / N. Overføring til flytende nitrogen. Tine hetteglass med MSC (følg trinn 1.3.1 - 1.3.6). Resuspender MSC i 5 ml dyrkningsmedium (velg passende medium for WJMSC eller BMMSC) og frø i en 25 cm 2 kolbe.

    • 2. Etablering endothelial-mesenchymale Stem Cell Co-kulturer på Ibidi Microslides

    1. Trypsineres en konfluent 25 cm 2 kolbe av EF (~ 1,5 x 10 6 celler, som punkt 1.4). Resuspender EC i 380 mL MSCGM (1 x 25 cm 2 kolbe vil seede to 6-kanals Ibidi microslides (~ 1,25 x 10 5 / kanal), for vedheft analyser alle celle types dyrkes i MSCGM). Legg 30 mL av EC suspensjon til hver kanal (dette vil dekke veksten området gjennom Kapillarkrefter). Inkuber Ibidi microslide ved 37 ° C og 5% CO2 i 1 time.
    2. Legg 140 mL MSCGM til hver kanal og deretter aspirer den av. Gjentas to ganger for totalt 3 vasker. Legg 140 mL MSCGM og plass i inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 i 24 timer.
    3. For co-kulturer løsne MSC (punkt 1.4). Utfør en celletall ved hjelp av en hemocytometer eller en cellometer. Juster konsentrasjonen av MSC til 1,5 x 10 5 celler / ml.
    4. Aspirer skytende medium fra Ibidi kanaler (slik at bare vekstområdet av kanalen i medium). Legg 30 fil MSC suspensjon til Ibidi kanaler. Aspirer mediet som ble kastet ut fra vekstområde av kanalen og legge ytterligere 30 mL av MSC suspensjon. Gjenta en gang til og deretter plassere Ibidi microslide i inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 </ Sub> i 1 time.
    5. Legg 140 mL MSCGM til hver kanal og deretter aspirer den av. Gjentas to ganger for totalt 3 vasker. Legg til et sluttvolum på 140 ul MSCGM til hver kanal og plasseres i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
    6. Tine 1 x 10 5 U / ml lager TNFa og fortynnet 1: 1000 i MSCGM til en sluttkonsentrasjon på 100 U / ml (ekvivalent med ~ 10 ng / ml). Utføre en seriell fortynning ved å fortynne 100 U / ml TNFa ved 1:10 i MSCGM å oppnå 10 U / ml. Fortynn 10 U / ml TNFa ved 1:10 i MSCGM å oppnå en U / ml.
    7. Behandle kanaler med TNFa ved 37 ° C i 4 timer før analysen. Temperatursvingninger i løpet av cytokin behandling vil endre mønstre av nøytrofile rekruttering observert. Legg frisk MSCGM til ubehandlede kanaler.

    3. Etablering endothelial-Mesenchymale Stem Cell Co-kulturer på Filter

    1. Løsrive WJ eller BMMSC som beskrevet i punkt 1.4. Resuspender pelleteni 1 ml MSCGM. Utfør et celler celler ved hjelp av en hemocytometer eller en cellometer.
    2. Juster volumet, slik at sluttkonsentrasjonen er 5 x 10 5 MSC i 500 ul av MSCGM.
    3. Ved hjelp av steril tang invertere 6-vel, 0,4 mikrometer PET Transwell filtre og sted i en steril boks.
    4. Seed 5 x 10 5 MSC på den ytre overflate av filtrene. Inkubere filtrene ved 37 ° C og 5% CO2 i 1 time.
    5. Samle materiale fra den ytre overflaten av filteret. Telle antall ikke-klebende MSC i media. Re-invertere filtre bruker steril tang og plasser i en matchende seks-brønns plate som inneholder 3 ml MSCGM.
    6. Tilsett 2 ml MSCGM på den indre overflaten av filteret (figur 1B). Plasser i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 i 24 timer. Trypsineres en konfluent 25 cm 2 kolbe av EF (figur 1Ai, som punkt 1.4).
    7. Suspender EC i 8 ml MSCGM (1 x 25cm 2 kolbe will frø fire seks-brønns filtre; ~ 5 x 10 5 EC / filter). Aspirer medium fra toppen og bunnen av de porøse filtrene. Tilsett 3 ml frisk MSCGM inn i det nedre kammer (på undersiden av filteret). Tilsett 2 ml EC suspensjonen til den indre overflate av hvert filter. Inkuber i 1 time ved 37 ° C og 5% CO2.
    8. Sug medium for å vaske av ikke-klebende EC og erstatte med frisk MSCGM. Sett opp parallelle EC mono-kultur filtre ved såing celler på den indre overflate uten først seeding MSC. Inkuber O / N ved 37 ° C og 5% CO2.
    9. Sjekk at EC monolayer er konfluent og inneholder ingen hull. Sub-konfluente monolag kan ikke brukes for adhesjons-analyser (figur 1B).
    10. Behandle de øvre og nedre kamre av filtrene med 1, 10 eller 100 U / ml TNFa (ekvivalent med ~ 10 ng / ml) ved 37 ° C i 4 timer før analysen (beskrevet i avsnitt 2).

    4. Isolering av Leukocytter

    1. Ta venøsblod fra friske frivillige og delmengde umiddelbart inn EDTA-rør. Inverter rør forsiktig for å blande.
    2. Lag 2,5 ml Histopaque 1077 over på 2,5 ml Histopaque 1119 i en 10 ml rundbunnet rør. Lag 5 ml fullblod på Histopaque gradient. Sentrifuger ved 800 xg i 40 min ved RT.
    3. Feie perifere polymorfonukleære neutrofiler (PMN) ved grenseflaten av Histopaque 1077 og 1119 (ovenfor erytrocytt lag). Plasser i en 10 ml rundbunnet rør og fyll opp til 10 ml med PBSA. Snu røret og sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved RT.
    4. Fortynn 7,5% BSA-løsning 1:50 i 100 ml PBS (med kalsium og magnesium klorid) til en sluttkonsentrasjon på 0,15% (w / v; PBSA). Aspirer supernatanten og resuspender i 10 ml PBSA. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved RT.
    5. Suspender i 1 ml PBSA. Ta en 20 ul alikvot av cellesuspensjonen og tilsett 380 pl PBSA (1:20 fortynning). Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en cellometer. Fortynne til ønsket concentration (1 x 10 6 / ml for Transwell filtre og Ibidi microslide) i PBSA. Oppretthold nøytrofil suspensjon ved romtemperatur helt til analysen.

    5. Montering av Flow System

    1. Sette opp strømningssystemet som vist i figur 1C. Slå på ovnen og satt til 37 ° C. Fest en 20 ml sprøyte (fjerne stempelet) og en 5 ml sprøyte til en 3-veis kran. Fest springen til pleksiglass kammeret ved hjelp Micropore tape.
    2. Måle og kutte en lang stykke silisium 2/4 mm (tykk) rør som er omtrent avstanden mellom ventilen og 3-veis kran. Skjær et 8-10 mm langt stykke på 1/3 mm (tynn) rør og sette inn i en ende av det tykke røret. Fest den tykke slangen side på 3-veis kran.
    3. Koble den tynne slangen slutten på en port av det elektroniske 3-veis microvalve. Dette er den "vaskereservoaret". Skjær en 6 - 8 mm lang stykke tykt og tynt rør.
    4. Sett tynn slange inn i en ende av det tykke røret. AttACH den tykke rør ender på en 2 ml sprøyte (fjerne stempelet).
    5. Å forbinde den tynne rør ende av 2 ml sprøyte til en port på den elektroniske microvalve å gjøre "prøvereservoaret". Forbinde ventilen til filterstrømningskammeret ved å måle og å skjære et langt stykke av tynn slange som er avstanden mellom microvalve og sentrum av objektbordet.
    6. For microslide modellen, feste et 8-10 mm tykt stykke av røret til enden av det tynne rør. Plassere en L-formet tilkobling til enden av det tykke røret. Dette vil koble til microslide. For filtermodell, feste en til 8 - 10 mm stykke av PORTEX blå Linje Manometer forbindelsesrøret til enden av det tynne rør.
    7. Plasser den tynne rør ende mot microvalve. Dette er den felles utgang for vask og eksempel reservoarer. Fyll reservoarer med PBSA. Prime rør ved strømmer PBSA gjennom dem for å fjerne eventuelle luftbobler.
    8. Fest Manometer slange til en 29 mm (50 ml) glass syringe. Prime sprøyten ved å fylle med 10 ml PBSA. Vend sprøyten slik at enden som er koblet til røret vender oppover og skyve ut alle luftbobler. Påfyll med 5 ml PBSA.
    9. For microslide modellen, feste en 10 - 12 mm tykt stykke av røret til enden av manometeret rør som fører til glassprøyte. Plasser en L-formet kontakt på enden av det tykke røret. Plasser glass sprøyte inn en sprøytepumpe for infusjon / uttak.
    10. Beregn refill strømningsrate (Q) som kreves for å generere den ønskede veggen skjærspenning (τ w i Pascal, Pa) på 0,1 Pa (Transwell filtre) eller 0,05 Pa (Ibidi microslides) ved hjelp av følgende formel:
      γ w = (6.Q) / (wh 2)
      τ = n.γ
      Hvor w = indre bredde og h = innvendig dybde av strømningskanalen. n = viskositet av den strømmende oppløsning; PBSA er n = 0,7 mPa.s. For parallellplatefilter strømningskammeret, er bredden (w) 4 mm og dybden (h) er 0,133 mm. Depth av kammeret kan variere litt på grunn av forskjeller i tykkelsen av Parafilm pakning benyttes. For Ibidi microslide, er bredden 3,8 mm og dybden er 0,4 mm.
      MERK: På grunn av forskjeller i dimensjonene i strømningskanalen, og fange dynamikken bruker vi forskjellige skjærspenninger for microslide modellen i forhold til filtermodellen 6.

    6. Sette opp parallell plate Flow Chamber Innlemming Filters

    1. Skjær et stykke Parafilm (samme størrelse som glass dekkglass) med en metall mal. Skjær ut et 20 x 4 mm spalte i Parafilm (for å skape strømningskanalen) ved hjelp av en metall-mal. Bruk av pakningen for å markere strømningskanalen på glass dekkglass.
    2. Rett inn kantene på 6-brønnen filter på glasset dekkglass. Sørg for at filteret dekker flyt kanalmerking. Skjær forsiktig ut filteret ved hjelp av en type 10A skalpell.
    3. Dekke filteret nøye med Parafilm pakning, slik at strømningskanalensporet er i midten av filteret (figur 1D). Bruk et stykke ren vev og presse ut noen bobler.
    4. Plassere dekkglass i fordypningen av den nedre plate av pleksiglass strømningskammeret. Plasser den øverste pleksiglass plate over toppen av pakningen og skru platene sammen (Figur 1D).
    5. Snu 3-veis kran for å la vaskebuffer (PBSA) til å flyte gjennom ventilen. Koble Manometer slange til innløps porten på toppen Persex plate. Kjør PBSA gjennom strømningskanalen slik at bobler kan passere gjennom.
    6. Koble Manometer slange fra sprøytepumpen inn i åpningen av pleksiglass plate. Still sprøytepumpen påfylling og trykk løp. Det eventuelt PBSA som har dryppet på den øvre plate av kammeret.
    7. Plasser kammer på scenen av en invert fasekontrastmikroskop. Justere fokus for å visualisere EC ovenfor filtrene (figur 1B).

    7. Sette opp Microslides for Flow </ P>

    1. Plasser microslide på scenen av en invertert fase kontrast mikroskop. Koble L-formet kontakten inn i innløpsporten i en kanal. Kjør PBSA gjennom strømningskanalen.
    2. Plasser L-formet kontakten fra sprøytepumpen inn i åpningen av kanalen. Still sprøytepumpen påfylling og trykk løp. Rense PBSA som har dryppet på microslide. Justere fokus for å visualisere EC monolayer.

    8. Perfusjons av Leukocytter Over endotelceller

    1. Satt 2 ml renset nøytrofiler inn i prøvebeholderen, og la oppvarmes i 2 min. Vask endotelet med PBSA i 2 min.
    2. Drei ventilen PÅ for å perfuse nøytrofile løpet endotelet. Lever nøytrofile bolus for 4 min. Snu kran og perfuse PBSA fra vaskebeholderen for resten av forsøket.
    3. Sørg for at luftbobler ikke passerer gjennom strømningskanalen på noe tidspunkt under analysen da dette vil forstyrre EC monolayer og årsaken avløsning av heft nøytrofile.

    9. Opptak Neutrofil Capture and Behavior

    1. Posten nøytrofile rekruttering enten under nøytrofile flyt eller post-perfusjon.
    2. Gjør alle digitale opptak av minst 5 - 10 felt i sentrum av strømningskanalen. Identifiser midten av kanalen ved å bevege objektivet til kanten av kanalen ved innløpsporten og identifisere midten av porten.
      1. For opptak i løpet av nøytrofile flyt, ta bilder av en enkelt felt hver 10 sek i 1 min. Bevege seg langs kanalen og ta opp et annet felt i 1 min. Gjenta for varigheten av bolus.
      2. For opptak av post-perfusjon, få 10 sekunder opptak av 5 - 10 felt ned i sentrum av strømningskanalen for å vurdere leukocytt-atferd (vanligvis 2 minutter etter slutten av den nøytrofile bolus). Ta bilder hvert sekund i 10 sek intervall. Dette gir tilstrekkelig tid for fangst fra flyt og oppførselen til tilhenger Neutrophils som skal analyseres.
      3. Registrere en enkelt felt inneholdende minst 10 transmigrated neutrofiler i 5 min, ta bilder hver 30 sek. Dette kan brukes til å beregne hastigheten av migrerte celler (enten over eller under endotelet).
      4. Spille inn en annen serie på 10 sek felt (typisk 9 min post-perfusjon). Dette tillater neutrofiler tid til å migrere gjennom den endoteliale monolag.
      5. Stopp sprøytepumpen og fjerne slangen. Demontere strømningskammeret og skyll prøven reservoar og rør. Gjenta for de påfølgende filtre / microslide kanaler.

    10. Analyse av Leukocyte Rekruttering og Behavior

    1. Telle antall nøytrofile i hvert felt i løpet av de 10 sek opptak på 2 min tidspunkt. Alle celler må være tilstede i den første andre felt for å bli talt. Celler som er delvis i felt på 2 sider (f.eks topp / høyre kant) av synsfeltet er inkludert itellingene, så lenge de forblir i feltet for den fulle 10 sek.
    2. Beregne det midlere antall vedhengende nøytrofile per felt. Måle lengden og bredden av den innspilte felt. Beregne arealet av feltet. Beregne hvor mange felt det er i 1 mm 2. Multiplisere gjennomsnittlig nøytrofiltall med antall felt i 1 mm 2.
    3. Beregn det totale antall neutrofiler perfusert ved å multiplisere mengden av nøytrofiler perfusert (f.eks, 2 x 10 6 / ml * Q [f.eks, 0,0999 ml / min for parallell plate strømningskammeret]) av varigheten av bolus (f.eks, 4 min ).
    4. Fordel nøytrofiltall / mm 2 ved det totale antall neutrofiler perfuserte for å bestemme det totale antall av celler som har festet (adherente celler / mm 2/10 6 perfusert).
    5. Vurdere om de heft nøytrofile ruller, fast tilhenger eller transmigrated (Supplerende Video 1 og 2).
      1. Arullende nøytrofile er fase lyse og vil sakte bevege seg langs endothelial monolayer (1 - 10 mikrometer / sek, Supplerende Video 1).
      2. Fast adherente celler er lyse fase og bundet til EF-overflaten, enten gjenværende stasjonær (dvs. ikke beveger seg under innspilling) eller har gjennomgått en formendring og migrerer over EC overflaten (figur 1Ei).
      3. En transmigrated nøytrofile er fase mørkt og under EF-lag (Figur 1Eii).
    6. Beregne hvor stor andel av heftende celler som er rullende, stasjonære og transmigrated. Alternativt kan nøytrofil oppførsel bli uttrykt som totale antall celler som viser de forskjellige virkemåter ved å anvende den samme formelen anvendes til å beregne total adhesjon (som beskrevet i trinn 10.6 til 10.7).
      1. Mark forkanten av en rullende nøytrofile. Markerer forkanten av den samme cellen ved slutten av 10 sek sekvens. Tegne en linje innsatsWeen de to punktene og måle avstanden at cellen har reist.
      2. Dividere denne verdi med varigheten av opptaket hvor cellen ruller (dvs. 10 sekunder). Prøv og velg nøytrofile som er i felten for hele 10 sek intervall.
    7. Beregne hastigheten av nøytrofile migrerer over overflaten (formet endret fase lys) eller under endotelet (fase mørk) bruke 5 min opptak (Supplementary Video 2).
      1. Tegn en skisse av migrerte celler ved begynnelsen av sekvensen og spore deres bevegelser i hele sekvensen. Gjøre oppmerksom på X- og Y-posisjonene tyngdepunktet på hver 1 min intervall for hver celle. Trekke fra verdiene av X og Y posisjon fra det første bildet av sekvensen fra verdiene i det andre bildet. Dette er basert på Pythagoras 'teorem.
      2. Trekk fra verdiene fra det andre bildet fra den tredje bilde. Gjør dette for alle bildene i sekvensen. Square than X og Y-verdiene og legge dem sammen.
      3. Kvadratrot den resulterende verdien. Beregne farten for hver celle ved gjennomsnitt hastighetene beregnet ved hvert minutt intervall. Spor 10 migrerte nøytrofile og beregne midlere hastighet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    I utgangspunktet analysert vi effekten av stimulerende EC med TNFa på rekruttering av nøytrofile fra flyt bruker Ibidi microslide modell (§ 7 - 9). I fravær av TNFa, liten eller ingen neutrofiler klebet til endotel-monolag (figur 2A). Dette var ventet, som ubehandlet / hviler EF uttrykker ikke de nødvendige adhesjonsmolekyler (selectins) eller chemokiner å støtte bindende 25,26. I motsetning til dette cytokin-stimulering betydelig økt nøytrofil adhesjon til endotel på en doseavhengig måte (figur 2A). Adhesjon forblir normalt stabil i løpet av analysen. Binding av leukocytter til endotelet ubehandlet indikerer at enten EC er aktivert (dvs. forurenset med LPS under dyrkningsprosessen) og / eller de nøytrofile celler ble aktivert i løpet av isolasjonsprosessen. Faktisk har LPS blitt vist å øke ekspresjon av E-selektin, ICAM-1 og VCAM-jan 25 til 27 på overflaten av EF, som tillater dem å binde nøytrofiler.

    Når analysere atferden til de rekrutterte nøytrofile vi vanligvis observere en doseavhengig reduksjon i andelen av nøytrofile rullende (figur 2B) med en samtidig doseavhengig økning i andelen av nøytrofile migrere gjennom endothelial monolayer (Figur 2C). Ved lavere doser av TNFa-stimulering (1 U / ml) en større andel av nøytrofiler vises fase lys som indikerer at de er festet til den apikale overflate av endotel (figur 2B). I motsetning til dette, på 10 og 100 U / ml (høyere doser) omtrent 40% av de rekrutterte neutrofiler vises fase mørkt ved 2 min indikerer at disse cellene har migrert gjennom endotelial monolaget, og er på undersiden av endotel (figur 2C). Neutrofiler er i stand til å migrere gjennom den EC innen 1 - 2 minutter, og transmigrasjon nådde maximal nivåer på ~ 10 min post-perfusjon 28. Her observerte vi en økning i nøytrofile sjelevandring fra 40% på 2 min til 60% etter 9 min post perfusjon (Figur 2C). Vi observerte ingen effekt av TNFa konsentrasjon på hastigheten av rullende (~ 3 mikrometer / sek) eller migrerer (~ 10 - 12 mikrometer / min) nøytrofile.

    I filteret basert modell økte TNFa-stimulering nøytrofil adhesjon på en doseavhengig måte i likhet med det som sees ved hjelp av Ibidi microslide modellen (figur 3A). Når det gjelder virkemåten, nøytrofil rullende var upåvirket av TNFa-dose (Figur 3B), samtidig som en doseavhengig økning i prosenttransmigrasjon ble observert (figur 3C). I denne serie eksperimenter ble det observert noen signifikant effekt av tid på nøytrofil transmigrasjon (figur 3C).

    Vi tilbyr metoder på hvordan å generere to forskjellige co-kultur konstruksjoner, hver avsom er utviklet for å svare på konkrete spørsmål. I Ibidi microslide modellen, EC og MSC blir dyrket i et enkelt monolag i direkte kontakt med hverandre. Denne modellen er nyttig for å undersøke effekten av terapeutiske injeksjon av MSC inn i blodet, og deres påfølgende integrering inn i EF-monolag. I kontrast i filterbasert modell, EC og MSC dyrkes på motsatte sider av filteret i nærheten av men ikke nødvendigvis i direkte kontakt. Denne mer ligner vevet med endotelceller som danner et monolag representerer blodkaret, og MSC befinner seg på den subendotel rommet. Dette gir oss muligheten til å undersøke effekten av vev-resident MSC på responsen fra EC til cytokin stimulering.

    Basert på våre erfaringer, ser vi at maksimal nøytrofile rekruttering og transendothelial migrasjon oppstår når EC blir stimulert med 100 U / ml TNFa. Som eksempel har vi benyttet denne konsentrasjon for å undersøke effekten av MSC samkulturpå endothelial rekruttering av nøytrofile fra flyt. Her presenterer vi data for BMMSC i co-kultur med EC bruker microslide og filter-baserte modeller kan imidlertid andre typer MSC også bli undersøkt f.eks WJMSC. I begge modellene tilstedeværelse av BMMSC betydelig redusert nøytrofiladhesjon til EF i forhold til EC kultivert alene (Figur 4A). Co-kulturen hadde ingen effekt på atferden til rekruttert nøytrofile, med tilsvarende nivåer av rullende og sjele observert på EC dyrket alene eller med MSC (Figur 4B og C). Dermed kan MSC modifisere EF respons på cytokin stimulering, som undertrykker sin evne til å støtte nøytrofile rekruttering fra flyt.

    Figur 1
    Figur 1. Etablering av EC-MSC ko-kultur og analyse av neutrofil rekruttering ved hjelp av en strømningsbasert adhesjonsanalysen. (A) (i) primær EF og (ii) passasjen 3 BMMSC dyrket på vevskulturflasker. (B) mikrofotografi av EC og MSC dyrket i 6-brønns Transwell filterinnsatser. (C) Diagram av perfusjon system som brukes til å generere strømning. (D) Skjematisk representasjon av den parallelle platen filtergjennomstrømningskammeret. (E) Micrograph av (i) fast vedheftende (FA) og (ii) transmigrated (TM) neutrofiler følgende rekruttering fra strømnings EC stimulert med 100 U / ml TNFa . Images C og D er hentet fra figur 2 og 3 i molekylærbiologiske metoder.: T-celle Trafficking, 2010, pg 53-54 28 med tillatelse fra Springer Science and Business Media Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette figur.


    . Figur 2. Neutrofil rekruttering fra strømning til TNFa-stimulerte EC ved hjelp Ibidi microslides EC ble stimulert med økende konsentrasjoner av TNFa (0-100 U / ml) i 4 timer. En 4 min bolus av nøytrofile ble perfused over EC monolayer på 0,05 Pa. (A) nøytrofiladhesjon vurdert til 2 min. ANOVA viste en signifikant effekt på TNFa-behandling på nøytrofil adhesjon, p <0,01. Neutrofil oppførsel ble bedømt ved 2 og 9 min og uttrykt som en prosentandel av adherente celler som var (b) valsing eller (C) transmigrated. ANOVA viste en signifikant effekt på TNFa-behandling på virkemåten til den adherente nøytrofiler, p <0,001. I C, ANOVA viste en betydelig tid på transmigrated nøytrofile p <0,01. Dataene er gjennomsnitt ± SEM fra n = 3 forsøk. * P <0,05 og **p <0,01 sammenlignet med ustimulerte (0 U / ml) EC kontroll ved Dunnett post-test. ## p <0,01 og ### p <0,001 sammenlignet med 1 U / ml EC på samme tidspunkt med Bonferroni post- test.

    Figur 3
    Fig. 3. Neutrofil rekruttering fra strømning til TNFa-stimulerte EC ved hjelp av filter-basert assay EC ble stimulert med økende konsentrasjoner av TNFa (0-100 U / ml) i 4 timer. En 4 min bolus av nøytrofile ble perfused over EC monolayer på 0,1 Pa. (A) nøytrofiladhesjon vurdert til 2 min. ANOVA viste en signifikant effekt på TNFa-behandling på nøytrofil adhesjon, p <0,001. Neutrofil oppførsel ble bedømt ved 2 og 9 min og uttrykt som en prosentandel av adherente celler som var (b) valsing eller (C) transmigrated. I C, ANOVA shogifte seg en signifikant effekt av tid og cytokin behandling på nøytrofile sjelevandring, p <0,05. Dataene er gjennomsnitt ± SEM fra n = 3 forsøk. ** P <0,01 og *** p <0,001 sammenlignet med ustimulerte (0 U / ml) EC kontroll ved Dunnett post-test. # P <0,05 sammenlignet med 1 U / ml EC på samme tidspunkt med Bonferroni etter -test.

    Figur 4
    Figur 4. Neutrofil rekruttering fra flyt til TNFa-stimulerte EC-BMMSC co-kulturer. BMMSC var co-kultivert med EC for 24 timer før stimulering med 100 U / ml TNFa for 4 timer. En 4 min bolus av nøytrofiler ble perfusert over EC monolag på 0,05 Pa for (A, C, E) microslides og 0,1 Pa for (B, D, F) filtre. (AB) Neutrofil adhesjon ble vurdert ved 2 min. Nøytrofile oppførsel ble vurdert ved 2 og 9 mi og uttrykt som en prosentandel av adherente celler som var (CD) valsing eller (EF) transmigrated. I C og D, ANOVA viste en signifikant effekt av dyrkningsforhold på nøytrofil rullende, p <0,05. I E og F, ANOVA viste en signifikant effekt av tid på nøytrofil transmigrasjon, p <0,05. Det ble imidlertid ingen signifikante forskjeller observert i sjelevandring mellom individuelle behandlinger etter Bonferroni post-test. Dataene er gjennomsnitt ± SEM fra n = 5 eksperimenter. * P <0,05 sammenlignet med EC monokultur av paret t-test eller Bonferroni post-test.

    Tilsetnings Video 1. Analyse av nøytrofile valsehastigheter. EC dyrket på et Transwell filter ble stimulert med 100 U / ml TNFa i 4 timer. En bolus av nøytrofile ble perfused over EC for 4min. Representative digitalisert sekvens av en enkelt 10 sek felt 2 hentetmin post-perfusjon. Endringen i stilling av en enkelt valse nøytrofil fra begynnelsen til slutten av 10 sekunders sekvensen kan brukes til å beregne hastigheten ved hvilken nøytrofile ruller.

    Tilsetnings Video 2. Analyse av nøytrofile migrasjonshastigheter. EC dyrket på et Transwell filter ble stimulert med 100 U / ml TNFa i 4 timer. En bolus av nøytrofile ble perfused over EC for 4 min. Representative digitalisert sekvens av et enkelt 5 min feltet for å spore bevegelse av transmigrated neutrofiler. Dette kan brukes til å beregne hastigheten.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Her beskriver vi to in vitro "vaskulære" modeller for å studere rekruttering av sirkulerende nøytrofile ved betent endotelet. En stor fordel ved disse modellene er evnen til å analysere hvert trinn i leukocyttadhesjon kaskade i rekkefølge, som ville forekomme in vivo. Vi har tidligere observert en doseavhengig økning i nøytrofil adhesjon til og transmigrasjon gjennom TNFa-stimulerte EC 9,29. Vi beskriver også hvordan begge modellene kan tilpasses for å studere effektene av stromale celler på leukocytt rekruttering. Her MSC ble ko-dyrket med EF i en Ibidi microslide eller på motsatte sider av et porøst filter. Dette gjør at begge celletyper for å kommunisere med hverandre, for derved å modifisere hverandres fenotype og respons. Vi har vist her, og i tidligere studier 23, at tilstedeværelsen av MSC trykkes nøytrofil adhesjon til TNFa-stimulerte EC. Dette indikerer at stromale celler modifisere EC responstil cytokiner og senere endrer rekruttering av sirkulerende leukocytter.

    I tillegg til de modeller som er beskrevet ovenfor, Cellix biochips, Bioflux plater og Glyotech parallell plate strømningskamrene er kommersielt tilgjengelige strømningskanalsystemer som gir en overflate for dyrking av endotel og observere rekruttering. I alle systemer, bør visse parametre vurderes mens etablere endothelial kulturer og utfører strømningsbaserte heft analyser, hvorav noen er uthevet nedenfor og i tidligere rapporter 30,31. Eventuelle antiinflammatoriske midler, slik som hydrokortison, som kan påvirke de cytokin responser bør sløyfes fra mediet for varigheten av kulturen og analysen 18,29. Når du bruker Ibidi microslide sikre at det ikke er luftbobler i strømningskanalen i løpet av kulturen i EC da disse vil forstyrre EC monolayer. Integriteten til endothelial monolayer må bekreftes før cytokine-behandling, som nøytrofiler vil binde seg til hullene i monolag hvor BSA er belagt microslide / filter. Det er også viktig å sikre at EC blir holdt ved 37 ° C i løpet av cytokin-stimulering fordi TNFa er temperaturfølsom, og bare har maksimal effekt ved 37 ° C. For flyten analysen selv, velges en passende vaskebuffer, vi bruker vanligvis PBSA for korte analyser (mindre enn 30 minutter) og M199 medium supplert med BSA (0,15%) for lengre analyser (1-48 t) 30,31. Endelig sikre at det ikke er luftbobler i strømningskanalen i løpet av analysen da dette forstyrrer strømningshastighet, skader EC monolayer og aktiverer tilhenger nøytrofile.

    En av de store fordelene med de flercellede in vitro-modellene som er beskrevet her er deres evne til å gjenskape in vivo interaksjoner mellom EU og stromale celler. Det er vanskelig å isolere virkningene av spesifikke stromale komponenter in vivoog å modifisere dem på en kontrollert måte. I våre modeller, kan stromalceller bli manipulert til å belyse hvordan de kommuniserer med EF og påvirke betennelsesprosessen i helse og sykdom. For eksempel bruker siRNA teknologien vi har tidligere vist at produksjonen av IL-6 av MSC under co-kultur var nødvendig for deres immundempende effekter 23. Hver modell kan brukes for å løse spesifikke spørsmål dvs. effekten av vev-resident stromale celler (filter-basert modell) eller terapeutisk administrert stromale celler (Ibidi microslides og andre kommersielt tilgjengelige systemer) på leukocytt rekruttering. I begge tilfeller har vi titrert forskjellige stromal celletyper for å sikre sin levedyktighet og for å etablere en passende forholdet mellom stromal celle til EF for å vurdere effekter på rekruttering 15,25. Tilsvarkulturmedium må være kompatibelt med hver celletype inkorporeres i modellen. I våre hender ko-kulturer blir typisk utført i det stromale celle medium 11,18,23,31.

    Ved hjelp av filter-baserte modellen har vi tidligere har vist at forskjellige stromale celler modulerer evnen av EC å støtte adhesjon og migrasjon av leukocytter i en vev-spesifikk måte, og at disse virkninger blir endret i kroniske sykdommer 3. Dette førte til konseptet at stromalceller etablere vevsspesifikke "adressekoder" som aktivt regulerer rekruttering av leukocytter til betent vev 24. Disse modellene er spesielt designet for å undersøke den innledende fasen av rekrutteringen i stor detalj, men er ikke i stand til å studere den påfølgende migrasjon innenfor subendotel plass (dvs. vekk fra endotelet i vevet). Flercellede, flerlags 3D-konstruksjoner som en statisk kollagen gel analysen 12,32 ville være mer passende for å studere disse siste fasene av rekruttering.

    Våre flytbasert heft modellene er meget allsidig. Vi har desskribert deres anvendelse i sammenheng med neutrofil rekruttering, men andre leukocytt-undersett kan undersøkes på en lignende måte. Vi har også brukt Ibidi microslide system for å undersøke rekruttering av sirkulerende MSC av EC 23, og om dette skjer gjennom den samme vedheft kaskade rapportert for leukocytter. Likeledes disse modellene kan bli brukt til å undersøke rekruttering og inkorporering av metastatiske tumorcellelinjer, og deres etterfølgende virkning på endoteliale responser og leukocytt-rekruttering. Alternativt kan filterbasert modell tilpasses til å innlemme forskjellige typer av stromale celler (f.eks, fibroblaster, podocytes, glatte muskelceller) fra friske vev 13,21 og områder av sykdommen 11,18,20. Dette ville muliggjøre studier av vevsspesifikke regulatoriske reaksjonsveier som virker på nivået av den EF og / eller leukocytter. I alle tilfeller avbrudd av normale reguleringsprosesser i en rekke sykdomstilstander kan undersøkes for å identifisere key regulatoriske mediatorer (for eksempel IL-6 og TGFp) og eventuelle nye terapeutiske mål. I sammenheng med kronisk betennelse disse midlene kan brukes til å slå av rekrutteringsprosessen, mens i kreft biologi kunne man tenke seg deres bruk for å slå på rekruttering for å målrette svulsten.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Collagenase Type Ia Sigma C2674 Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Dulbecco's PBS Sigma D8662 With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
    1X Medium M199 Gibco 31150-022 Warm in 37 °C water bath before use.
    Gentamicin sulphate Sigma G1397 Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
    Human epidermal growth factor Sigma E9644 Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Fetal calf serum (FCS) Sigma F9665 FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
    Amphotericin B Gibco 15290-026 Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Hydrocortisone Sigma H0135 Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Collagenase Type II Sigma C6885 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    Hyaluronidase Sigma H3631 Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube Scientific Lab Supplies (SLS) 352360 Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
    DMEM low glucose Biosera LM-D1102/500 Warm in 37 °C water bath before use.
    Penicillin/Streptomycin mix Sigma P4333 Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    25 cc tissue culture flask SLS 353109
    75 cc tissue culture flask SLS 353136
    Bone marrow mesenchymal stem cells vial Lonza PT-2501 Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
    Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) Lonza PT-3001 Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
    EDTA (0.02%) solution Sigma E8008 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
    Trypsin solution Sigma T4424 Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
    Cryovials Greiner bio-one 2019-02 Keep on ice before adding before adding cell suspension.
    Mr. Frosty Freezing Container Nalgene 5100-0001 Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
    Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile Ibidi IB-80606 Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
    Cell tracker green dye Life technologies C2925 Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
    Cell counting chambers Nexcelom SD-100 Alternatively a haemocytometer can be used.
    Cellometer auto T4 cell counter Nexcelom Auto T4-203-0238
    Tumor necrosis factor α (TNFα) R&D Systems 210-TA-100 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
    6-well, 0.4 µm PET Transwell filters SLS 353090
    K2-EDTA in 10ml tubes Sarstedt Store at RT.
    Histopaque 1119 Sigma 11191 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    Histopaque 1077 Sigma 10771 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    10 ml round bottomed tube Appleton Woods SC211 142 AS
    7.5% BSA Fraction V solution Life technologies 15260-037 Store at 4 °C.
    20 ml Plastipak syringes BD falcon 300613
    5 ml Plastipak syringes BD falcon 302187
    2 ml Plastipak syringes BD falcon 300185
    3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm Micropore 1530-1 Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
    Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) Fisher Scientific FB68854 Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
    Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) Fisher Scientific FB68855
    Portex Blue Line Manometer tubing Smiths 200/495/200 Tubing leading to the syringe pump.
    3-way stopcock BOC Ohmeda AB
    Glass 50 ml syringe for pump Popper Micromate 550962 Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
    Glass coverslip Raymond A Lamb 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
    Parafilm gasket American National Can Company Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
    Two perspex parallel plates Wolfson Applied Technology Laboratory Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
    Electronic 3-way microvalve with min. dead space Lee Products Ltd. LFYA1226032H Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
    Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) Harvard Apparatus 70-2001 Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
    L-shaped connector Labhut LE876 To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
    Video camera Qimaging 01-QIC-F-M-12-C Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
    Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics 41N70000-61592 For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
    Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
    2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
    3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
    4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
    5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
    6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
    7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
    8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
    9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
    10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
    11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
    12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
    13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
    14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177 (2009).
    15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
    16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
    17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
    18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
    19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
    20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
    21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
    22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
    23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
    24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
    25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
    26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
    27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
    28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
    29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
    30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

    Tags

    Immunologi Endotelceller leukocytter mesenchymal stromalceller mesenchymale stamceller co-kultur vedheft betennelse rekruttering flyt basert adhesjonsassayet Ibidi microslide nøytrofile
    Analysere effekten av stromalceller på rekruttering av leukocytter fra Flow
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G.… More

    Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp. (95), e52480, doi:10.3791/52480 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter