Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Published: January 7, 2015 doi: 10.3791/52480
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

Summary

akışından lökositleri için iltihaplı endotel kabiliyeti mezenkimal stromal hücreler tarafından düzenlenir. Biz akışından nötrofil işe değerlendirmek ve mezenkimal stromal hücreler bu süreci düzenleyen oynadığı rolü incelemek için kullanılabilir birincil insan hücreleri içeren iki in vitro model tarif.

Abstract

Stromal hücreler, komşu endotel hücreleri ile çapraz konuşma ile inflamasyon sırasında, dolaşımdaki lökositlerin işe düzenler. Burada iltihaplı endotel hücreleri tarafından akışından nötrofillerin dolaşımdaki işe okuyan iki in vitro "vasküler" modelleri açıklar. Bu modellerin önemli bir avantajı, in vivo olarak meydana gelen gibi, sırayla lökosit yapışma kademeli olarak her adımda analiz yeteneğidir. Biz de hem modeller lökosit düzenleyen, bu durumda mezenkimal kök hücrelerin (MSC) stromal hücrelerin rolü, çalışma adapte edilebilir açıklanmıştır.

Primer endotelyal hücreleri, Ibidi lamlara veya 24 saat süre ile bir Transwell filtrenin ters tarafta doğrudan temas eden insan MSC ile tek başına veya birlikte kültürlenmiştir. Kültürler, 4 saat süre ile, tümör nekroz faktörü alfa (TNFa) ile uyarılır ve bir akım bazlı yapışma deneyinde dahil edilmiştir. Nötrofil bolus serpildi4 dakika için endotel üzerinde. nötrofil ve endotel ile etkileşimlerini akan yakalama faz-kontrast mikroskobu ile görüntülendi.

Her iki modelde de, sitokin uyarım, doza bağımlı bir şekilde akan nötrofil endotel işe artmıştır. Işe nötrofillerin davranış analizi haddeleme doza bağımlı azalma, endotelyum içinden geçişe doza bağımlı bir artış göstermiştir. Ko-kültür olarak, MSC TNFa-uyarılmış endotele nötrofil yapışma bastırdı.

Bizim akış tabanlı-yapışma modelleri dolaşımdan lökosit işe başlangıç ​​aşamalarını taklit. Lökosit ek olarak, bu tür terapötik olarak uygulandığı, MSC veya dolaşımdaki tümör hücreleri gibi diğer hücre türleri, işe incelemek için kullanılabilir. Çok katmanlı ko-kültür modelleri MSC pro-enflamatuar sitokinlerin tepkilerini değiştirmek için endotel ile iletişim göstermiştir, alterinötrofil işe ng. Bu tür modeller kullanılarak daha fazla araştırma tamamen farklı doku ve koşullar (inflamatuar bozukluklar veya kanser) için nasıl stromal hücreler anlamak enflamasyon sırasında lökositlerin etkilemek için gereklidir.

Introduction

Enflamasyon çözünürlüğü 1,2 izin vermek için, iltihaplı doku sıkı lökosit girişi düzenleme ve çıkış gerektiren mikrobik enfeksiyon veya doku yaralanmasına karşı koruyucu bir cevaptır. Endotel hücreleri (EC), bu hat, kan damarları, dolaşımdaki lökositlerin doku yerleşik stromal hücreler arasındaki çapraz konuşma Bu işlemi 3 koordine için gereklidir. Ancak, lökositlerin kontrolsüz alımı ve etkisiz boşluk kronik inflamatuar hastalıkların 4 gelişimini destekleyen. Sağlıkta ve hastalıkta lökosit işe Mevcut anlayış eksik ve daha sağlam modeller bu süreci analiz etmek gereklidir.

sonrası kılcal venüllerin vasküler EC kanın lökosit işe destek mekanizmaları iyi 1,2,5 tarif edilmiştir. Dolaşım halindeki lökositler, özel bir reseptör (örneğin, VCAM-1, E-selektin, P-selektin) tarafından çekildiğiiltihaplı endotel üzerinde yukarı-regüle edilir. Bu geçici etkileşimler lökosit yüzey bağlı kemokin ve lökositler 6- 11 tarafından ifade integrinler aktive lipit kaynaklı mediatörler (kökenli endotel veya stromal ya) ile etkileşim sağlar. Bu da endotel genelinde ve doku 12- 15 içine yapışma ve sürücüler göç dengeler. Doku içinde, lökositler kendi motilite, fonksiyon ve yaşam 16,17 etkileyen stroma türevli ajanlara maruz işe. Büyüyen kanıtlar güçlü sinyaller gelecek için işe alım süreci şartları lökositlerin her aşamasında alınan düşündürmektedir. Ancak, lökosit işe anlayışımız eksik kalır ve çok az doku içindeki bileşenler şekillendirme lökosit hareketi hakkında bilinmektedir.

Birmingham biz lökositlerin işe incelemek için in vitro "vasküler" modelleri birkaç geliştirdik9,18,19 akar. Biz şimdi lökosit işe vasküler AK hareket olarak acil regülatörleri kendi yerel mikroçevresinin değişikliklere yanıt anlıyoruz. Özellikle, doku yerleşik stromal hücreler aktif işe 3 rollerini etkilemek için komşu vasküler AT ile söyleşmek kısmen, inflamatuvar yanıtı düzenler. Daha önce çeşitli stromal hücreler, bir doku-spesifik bir şekilde yapışmasını ve lökositlerin geçişini desteklemek için AT yeteneğini modüle göstermiştir, ve bu etkiler, kronik hastalıkların 13,16,20,21 değişmiş da yol açabilir. Böylece, stromal hücreler her inflamatuar yanıt 22 bağlamı tanımlamanızı doku 'adres kodları' kurmak. Daha yakın bir zamanda, kemik iliği türevli MSC (BMMSC) potansiyel olarak her iki nötrofillerin alımına bir azalmaya yol açan, sitokinlere EC tepkisini aşağı regüle ve 23 lenfosit olduğunu göstermiştir.

mekanizmalar governing işe aydınlatmıştır in vitro ölçüde izole bir tek hücre tipi (örn, AK) veya protein içeren deneyleri kullandık. Ancak bu çalışmalar dikkate almayın lokal doku çevrenin etkileri (örneğin, stromal hücrelerin varlığı) lökositlerin ve doku içine onların sonraki göç. Burada, stromal hücreleri, spesifik olarak mezenkimal kök hücreler içinde iki akış tabanlı yöntemler (MSC) tarif EC 23 ile birlikte kültürlenmiştir. Bu modeller bize akışından lökosit işe desteklemek için özellikle kendi yeteneği endotel tepkiler üzerine stromal hücre etkisini incelemek için izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. İzolasyon ve Kültür İlköğretim İnsan endotel hücrelerinin ve Mezenkimal Kök Hücre

  1. İzolasyon ve Kültürü İnsan göbeğine yakın damar endotelial hücreleri (HUVEC):
    1. Kağıt havlu ile bir tepsi üzerinde göbek kordonunu koyun ve% 70 etanol ile sprey. Bir doku kültürü kaputu yerleştirin. Her iki ucunda ven ve cannulate belirleyin. Sabitlemek için kanüle sonuna etrafında bir kablo bağı yerleştirin.
    2. PBS bir şırınga kullanarak venöz kan yıkayın. Hava ile şırınga doldurun ve kaldırmak ve artık PBS atmak için ven geçer.
    3. Ve 10 mg / ml kollajenaz tip Ia çözülme 1 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar (bunlar kalsiyum ve magnezyum klorür) ile PBS içinde 1:10 seyreltin. Her iki kanüller dolana kadar damara kollajenaz çözümü geçirin. Her iki ucunda kanüller kelepçeler kapatın.
    4. Doku ile tepsiyi örtün ve% 70 etanol ile sprey. 37 ° C'de 20 dakika% 5 CO2 için bir kuluçka makinesi içine kablosu yerleştirin.
    5. Dışarı kablosunu çekinve inkübatör kablo bağları sıkın. 1 dakika boyunca hafifçe kablosunu masaj. 10 ml PBS ile bir hücre süspansiyonu yıkayın ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde toplayın.
    6. Hava ile şırınga doldurun ve aşama 1.1.5 kullanılan bir 50 ml santrifüj tüpüne PBS toplama iki kez, herhangi bir kalıntı PBS kaldırmak için damar içinden geçmektedir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
    7. 1 ml tam AT orta aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet. EC ortam 35 ug / ml gentamisin sülfat, 10 ng / ml insan epidermal büyüme faktörü, 1 ug / ml hidrokortizon, 2.5 ug / ml amfoterisin B, ve% 20 cenin dana serumu ile takviye edilmiş M199 oluşur.
    8. 25 cm2 şişeye AT orta ve AT süspansiyonu 4 ml ilave edilir. Ertesi gün orta ve daha sonra her 2 günde değiştirin.
    9. AK Arnavut kaldırımı gibi morfoloji (Şekil 1Ai) sergiler. Yapışma deneyleri için, AK genelde% 100 izdiham ulaştığınızda (Bölüm 1.4 bakınız numaralı seribaşı
  2. İnsan kordon Wharton jöle mezenkimal kök hücrelerin (WJMSC) İzolasyonu:
    1. Taze kordon ya da zaten EC izole etmek için kullanılmıştır kablolarından Wharton jöle-türetilmiş MSC (WJMSC) ayırın. 5 cm uzunluğunda parçalar halinde göbek kordonu kesti. Kan damarlarını ortaya çıkarmak için uzunlamasına her parça kesin (2 arterleri [beyaz, sert] ve 1 ven [sarı, şişmiş]).
    2. Steril makas ve forseps kan damarlarını çıkarın ve atın kullanma. 3 mm 3 adet - 2 içine tüm doku kesin. 50 ml'lik santrifüj tüpüne 3 mm 3 adet - forseps yerde 2 Kullanma.
    3. 100 mg / ml stok kolajenaz tip II çözülme ve 1 seyreltin: 1 mg / ml bir son konsantrasyona kadar, 10 ml PBS içinde 100. 20,000 U / ml stok hiyaluronidaz çözülme ve 1 seyreltin: 400 kolajenaz çözeltisi içinde 50 U / ml 'lik bir nihai konsantrasyona seyreltildi.
    4. Doku parçaları içeren santrifüj tüpüne enzimatik kokteyl ekleyin. Doku fragmen inkübeYavaş bir döndürücü üzerinde, 37 ° C'de 5 saat için ts.
    5. Hücre süspansiyonu 1 seyreltin: 5 PBS. Yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne 100 um gözenek filtresi yerleştirin. 100 um gözenek filtresi üzerine hücre süspansiyonu dökün.
      NOT: doku parçaları Kalan filtre üzerinde muhafaza edilecektir ve hücreler 50ml santrifüj tüpüne tahsil edilecektir.
    6. Filtreyi atın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. 12 ml tam WJMSC kültür ortamı (DMEM, düşük glukoz,% 10 FCS ve 100 U / ml penisilin + 100 ug / ml streptomisin karışımı) aspire süpernatan ve tekrar süspansiyon WJMSC pelet.
    7. 75 cm2'lik doku kültür şişesi tüm hücreleri Tohum. 12 mi tam WJMSC kültür ortamı ile, 24 saat sonra ortam değiştirin. 3 gün - her 2 orta değiştirin. 2 hafta içinde% 80 izdiham - Hücreler 70 ulaşmalıdır. Passage WJMSC 70 ulaştığınızda -% 80 izdiham (Bölüm 1.4 bakınız).
  3. Kemik iliğinden türetilen MSC (BMMSC) genişlemesi: Daha önce tarif edildiği gibi 24, insan kemik iliği kökenli MSC (BMMSC) izole edin. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine 10 ml önceden ısıtılmış MSC büyüme ortamı (MSCGM) ekleyin.
  4. 2 dakika için 37 ° C su banyosu içine yerleştirmek suretiyle p2 BMMSC bir şişe çözülme. MSCGM ihtiva eden bir santrifüj tüpüne BMMSC süspansiyonu ekleyin. Pipetleme tarafından iyice karıştırın.
  5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Aspire tamamen süpernatanlarına.
  6. 1 ml MSCGM yeniden süspanse hücreleri ve böyle bir cellometer gibi bir hemositometre veya dijital hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak.
  7. 12 mi MSCGM olarak cm2 başına 6000 hücrelerinin - 5.000 yoğunluğunda 75 cm2'lik kültür şişeleri içine tohum hücreleri. 12 ml MSCGM 24 saat sonra orta değiştirin. 12 mi MSCGM ile besleme hücreleri her 2-3 gün.
  8. Passage BMMSC 70 ulaştığınızda -% 80 izdiham (Bölüm 1.4 bakınız). Hücreler, bir fibroblastik morfolojisi (Şekil 1Aii) bulunmaktadır.
  • EC ve MSC Dekolmanı: 25 cm 2 kültür şişelerinden orta aspire. Yaklaşık 2 dakika süre ile% 0.02 EDTA 2 ml ilave edilir. Aspire EDTA ve 2 ml tripsin ilave (2.5 mg / ml) eklenmiştir. Mikroskop altında Görünüm hücreleri yuvarlak hale gelene kadar.
  • Hücreleri ayırmak için şişeyi dokunun. 8 ml kültür ortamı eklenerek tripsin inaktive, bir 15 ml santrifüj tüpüne kültür şişesine transfer süspansiyonuna (hücre tipine bağlı HUVEC, BMMSC için WJMSC ve MSCGM için DMEM LG EC ortamı).
  • Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Aşağıda tarif edildiği gibi aspire süpernatan ve topak, yeniden süspanse edin.
    1. MSC, 3 ml kültür ortamında tekrar süspansiyon pellet geçirilmesi için. Üç ayrı 75 cm2'lik kültür şişeleri içine 11 ml kültür ortamı ekleyin. (: 3 bölünmüş 1), her bir kültür şişesine 1 ml hücre süspansiyonu ekleyin. Geçiş WJMSC ve ko-kültürü deneylerinde kullanılmadan önce BMMSC 3 kez (p3).
    2. Yapışma tahlillerinde AK veya MSC tohumlama için - Bölüm 2 ve 3 bkz.
  • Donma MSC:
    1. Geçidi 3 ayırmak MSC de Bölüm 1.4 de tarif edildiği gibi. 3 ml buz gibi soğuk CryoSFM aspire süpernatan ve süspansiyon haline getirin. 1.5 ml buz gibi soğuk cryovials hücre süspansiyonu pipetle 1 ml'lik eş payları. Bir donma kapta cryovials koyun.
    2. -80 ° CO / N de kabı saklayın. Sıvı azot transfer. MSC çözülme flakon (takip 1.3.1 adımları - 1.3.6). 5 ml kültür ortamı içinde yeniden süspanse MSC 25 cm2 şişe içine ve tohum (uygun WJMSC veya BMMSC ortamını seçin).

    • 2. Ibidi lamlara üzerinde endotel-mezenkimal kök hücre Co-kültürler oluşturulması

    1. (; Bölüm 1.4 olarak ~ 1.5 x 10 6 hücre) EC bir birleşik 25 cm 2 şişesi Trypsinize. Süspanse EC 380 ul MSCGM içinde (1 x 25 cm 2 şişe yapışma deneyleri tüm cep ty için iki adet 6-kanallı Ibidi lamlara (~ 1.25 x 10 5 / kanal), tohum olacakPes) MSCGM kültürlenir. Her kanala AK süspansiyonu 30 ul ekleyin (bu kılcal eylem yoluyla büyüme alanı kapsayacak). 1 saat boyunca CO2 37 ° C'de Ibidi mikroslayd inkübe ve% 5.
    2. Her kanala 140 ul MSCGM ekleyin ve sonra aspire. 3 yıkamadan toplam iki kez tekrarlayın. 24 saat boyunca CO2 37 ° C'de inkübatör içinde 140 ul MSCGM ve yer ekleyin ve% 5.
    3. Ko-kültürler için MSC (Bölüm 1.4) ayırın. Bir hemositometre veya cellometer kullanarak bir hücre sayımı yapın. 1.5 x 10 5 hücre / ml olacak şekilde MSC konsantrasyonunu ayarlayın.
    4. (Orta kanalın sadece büyüme alanını terk) Ibidi kanallardan aspire aşırı ortam. Ibidi kanal MSC süspansiyon 30ul ekleyin. Kanalın büyüme alanı çıkartıldı, orta aspire ve MSC süspansiyon bir 30 ul ekle. Bir kez daha tekrar ve daha sonra 37 ° C ve% 5 CO2 <kuvöz Ibidi mikroslayd yer1 saat / sub>.
    5. Her kanala 140 ul MSCGM ekleyin ve sonra aspire. 3 yıkamadan toplam iki kez tekrarlayın. 24 saat boyunca CO2 37 ° C'de inkübatör içinde her bir kanalın ve yerine 140 ul MSCGM bir son hacim ekleme ve% 5.
    6. 1 x 10, 5 U / ml stok TNFa çözülme ve 1 seyreltin: 100 U / ml 'lik bir nihai konsantrasyona (eşdeğer ± 10 ng / ml) MSCGM ise 1.000. 10 U / ml elde etmek üzere MSCGM olarak 1:10 ile 100 U / ml TNFa seyreltilmesi ile bir seri seyreltme yapın. 1 U / ml elde etmek üzere MSCGM olarak 1:10 ile 10 U / ml TNFa seyreltin.
    7. Tahlilden önce 4 saat boyunca 37 ° C'de, TNFa ile kanal tedavi edin. Sitokin tedavisi sırasında sıcaklık dalgalanmaları gözlenen nötrofil işe kalıplarını değiştirecektir. Muamele edilmemiş kanallara taze MSCGM ekleyin.

    3. Endotel-Mezenkimal Filtreler hücre Co-kültürler Kök kurulması

    1. Bölüm 1.4 de tarif edildiği gibi WJ veya BMMSC çıkarın. Pelletini1 mi MSCGM de. Bir hemositometre veya cellometer kullanarak bir hücre sayımı hücreleri gerçekleştirin.
    2. Son konsantrasyon MSCGM 500 ul 5 x 10 5 MSC şekilde ses seviyesini ayarlayın.
    3. Kullanımı steril forseps steril bir kutuda 6-kuyu, 0.4 mikron PET Transwell filtreleri ve yer ters.
    4. Filtrelerin dış yüzeyi üzerine Tohum, 5 x 10 5 MSC. 1 saat boyunca CO2, 37 ° C'de filtre inkübe ve% 5.
    5. Filtrenin dış yüzeyinden ortamı toplayın. Medyada yapışmaz MSC sayısını. 3 ml MSCGM içeren eşleşen 6 plaka steril forseps ve yer kullanarak yeniden invert filtreler.
    6. Filtre (Şekil 1B) iç yüzeyi üzerine MSCGM 2 ml ilave edilir. 24 saat boyunca CO2 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin ve% 5. (; Bölüm 1.4 Şekil 1Ai) AT bir birleşik 25 cm 2 şişesi Trypsinize.
    7. 8 ml MSCGM içinde AK süspanse (1 x 25cm 2 şişe will tohumu dört 6-kuyu filtreleri; ~ 5 x 10 5 EC / filtre). Gözenekli filtrelerin üst ve alt orta aspire. (Filtre altında) alt odasına 3 ml taze MSCGM ekleyin. Her filtrenin iç yüzeyine 2 mi AT süspansiyonu ekleyin. 37 ° C'de 1 saat ve% 5 CO2 inkübe edin.
    8. Aspire orta yapışmayan EC yıkayın ve taze MSCGM ile değiştirmek için. İlk tohumlama MSC olmadan iç yüzeyinde hücreleri tohumlama yoluyla paralel AK mono-kültür filtreleri ayarlayın. 37 ° C'de O / N inkübe ve% 5 CO2.
    9. AK tek tabakalı birleşen ve hiçbir boşluk içerdiğini kontrol edin. Alt-konfluen mono tabakalar yapışma tahlilleri (Şekil 1B) için kullanılamaz.
    10. 1, 10 veya 100 U / ml TNFa filtrelerin üst ve alt bölmeleri tedavi (eşdeğer ± 10 ng / ml) ile 4 saat boyunca 37 ° C 'de (Bölüm 2'de anlatıldığı gibi) deneyin öncesine.

    Lökositlerde 4. İzolasyonu

    1. Venöz alSağlıklı gönüllüler ve alikosunadn hemen EDTA tüpleri içine kan. Haricindekileri tüpleri hafifçe karıştırın.
    2. 10 ml 2.5 mi Histopaque 1119 üzerine 1077 Histopaque tabaka 2.5 ml'lik yuvarlak dipli tüp. Katman 5 ml Histopaque degrade üzerine tam kan. Oda sıcaklığında 40 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
    3. (Eritrosit katman üzerinde) Histopaque 1077 ve 1119 arayüzünde Hasat periferik polimorfonükleer nötrofil (PMN). Yuvarlak tüp dipli bir 10 ml yerleştirin ve albümin ile 10 ml makyaj. Yavaşça oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj tüpü ve ters.
    4. (; PBSA ile yıkandı w / v)% 0.15 nihai konsantrasyona (kalsiyum ve magnezyum klorür) ile, 100 ml PBS içerisinde% 7.5 BSA çözeltisi 1:50 seyreltin. 10 ml albümin aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
    5. 1 ml albümin süspanse. Hücre süspansiyonu 20 ul bir kısım almak ve 380 ul PBSA (1:20 seyreltme) ekleyin. Bir hemositometre veya cellometer kullanarak hücreleri saymak. Gerekli conce seyreltinntration albümin (Transwell filtre ve Ibidi mikroslayd 1 x 10 6 / ml). Deneye kadar oda sıcaklığında nötrofil süspansiyon muhafaza edin.

    5. Akış Sistemi Montaj

    1. Şekil 1C gösterildiği gibi akış sistemi kurun. Isıtıcı açın ve 37 ° C'ye ayarlanır. 3-yollu bir musluğa bir 20 ml şırınga (piston kaldırmak) ve 5 ml şırınga takın. Micropore bandı kullanarak Perspex odasına musluğu takın.
    2. Tedbir ve yaklaşık vana ve 3-yollu musluk arasındaki mesafedir silisyum 2/4 mm (kalın) boru uzun bir parça kesti. 03/01 mm (ince) boru, 10 mm uzunluğunda bir parça ve kalın hortumun bir ucuna yerleştirin - 8 kesin. 3-yollu musluğa üzerine kalın boru tarafı takın.
    3. Elektronik 3-yollu Mikrovalf bir liman üzerine ince boru ucunu. Bu "yıkama rezervuar" dir. Kalın ve ince boru 8 mm uzunluğunda bir parça - 6 kesti.
    4. Kalın hortumun bir ucunu ince boru yerleştirin. Avkalın boru 2 ml şırınga üzerine sona ach (pistonu çıkartın).
    5. "Örnek rezervuar" yapmak için elektronik Mikrovalf bir liman üzerine 2 ml şırınga ince boru ucunu. Ölçülmesi ve Mikrovalf ve mikroskop kademesinin merkezi arasındaki mesafedir ince borunun uzun bir parça kesilerek filtre akış odacığına valfi bağlayın.
    6. İnce boru ucuna kalın boru, 10 mm bir parçası - mikroslayd modelinde, 8 ekleyin. Kalın boru sonuna konektörü şeklinde bir L yerleştirin. Bu mikroslayd bağlanacaktır. İnce boru sonuna boru bağlantı Portex Blue Line Manometre 10 mm parça - filtre modeli için, bir 8 ekleyin.
    7. Mikrovalf üzerine ince boru ucunu yerleştirin. Bu yıkama ve örnek rezervuarlar için ortak çıkış. Albümin ile rezervuarları doldurun. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için onları aracılığıyla PBSA akan Başbakan boru.
    8. 29 mm'lik (50 ml) bir cam s manometre boru takınyringe. 10 ml albümin ile doldurarak Başbakan şırınga. Boru bağlı uç yukarı bakacak şekilde şırınga ters çevirin ve tüm hava kabarcıklarını dışarı itmek. 5 ml albümin ile doldurun.
    9. Cam şırınga giden Manometre hortumunun ucuna kalın boru 12 mm'lik bir parçası - sadece mikroslayd modelinde, 10 ekleyin. Kalın boru ucuna konnektör şeklinde bir L yerleştirin. Enfüzyon / geri çekilmesi için, bir şırınga pompası içine cam şırınga yerleştirin.
    10. 0.1 Pa (Transwell filtreler) ya da 0.05 Pa (Ibidi lamlara) aşağıdaki formüller kullanılarak istenen duvar kesme stresini üretmek için gerekli yeniden doldurma akış hızı (Q), (τ Pascal w, PA) hesaplayın:
      γ W = (6.Q) / (WH 2)
      τ = n.γ
      W = iç genişlik ve akış kanalı h = iç derinliğe sahiptir. n = akan çözelti viskozitesi; PBSA ile yıkandı, n = 0.7 mPa.s. Paralel plaka filtre akış bölmesi için, genişlik (w), 4 mm ve derinliği (h) 0.133 mm'dir. dOdanın epth nedeniyle kullanılan Parafilm conta kalınlığı farklılıklar biraz değişebilir. Ibidi mikroslayd için, genişlik 3.8 mm ve derinlik 0.4 mm 'dir.
      NOT: akış kanalı boyutları ve yakalama dinamikleri farklılıklar biz filtre modeli 6 kıyasla mikroslayd modeli için farklı kesme gerilmeleri kullanmak nedeniyle.

    6. Filtreler birleştirilerek Paralel Plate Akış Odası Kurma

    1. Metal şablonu kullanarak Parafilm bir parça (cam lamel aynı boyut) kesin. Bir metal şablonu kullanarak (akış kanalı oluşturmak için) Parafilm bir 20 x 4 mm yuvası kesin. Cam lamel akış kanalı işaretlemek için conta kullanın.
    2. Cam lamel 6-kuyu filtre kenarlarını hizalayın. Filtre akış kanalı işaretler kapsar emin olun. Dikkatlice tipi 10A neşter kullanılarak filtre kesip.
    3. Dikkatle sağlanması, bir Parafilm conta ile filtre kapsayan akış kanalıyuva filtresi (Şekil 1D) ortasında. Temiz bir doku parçası kullanın ve herhangi bir kabarcıkları dışarı itmek.
    4. Perspex akış odasının alt plaka girinti içinde lamel yerleştirin. Conta üstünden üst Perspex plakasını yerleştirin ve birlikte plakaları (Şekil 1D) vida.
    5. Yıkama tamponu (PBSA) vana akmasına izin vermek için 3-yollu musluğu çevirin. Üst Persex plakanın giriş portuna Manometre boru bağlayın. Baloncuklarının geçmesine izin vermek için akış kanalı yoluyla, albümin çalıştırın.
    6. Perspex plaka çıkış portuna şırınga pompası Manometre hortumunu bağlayın. Dolum ve basın çalıştırmak için şırınga pompası ayarlayın. Odanın üst plaka üzerine damladı herhangi bir PBSA temizleyin.
    7. Bir ters faz-kontrast mikroskop sahnede odasına yerleştirin. Üstü filtreler AK (Şekil 1B) görselleştirmek için odağı ayarlayın.

    7. Akış <için lamlara Kurma/ P>

    1. Bir ters faz kontrast mikroskop sahneye mikroslayd yerleştirin. Bir kanalın giriş portuna L şeklinde konnektörünü bağlayın. Akış kanalı ile, albümin çalıştırın.
    2. Kanalın çıkış portuna şırınga pompası konnektörü şeklinde L yerleştirin. Dolum ve basın çalıştırmak için şırınga pompası ayarlayın. Mikroslayd üzerine damladı herhangi bir PBSA temizleyin. AK tek tabaka görselleştirmek için odağı ayarlayın.

    Lökositler üzerinde Endotel Hücreleri 8. Perfüzyon

    1. Örnek haznesine saflaştırılmış nötrofillerin 2 ml koyun ve 2 dakika boyunca ısınmaya bırakın. 2 dakika boyunca, albümin ile endotel yıkayın.
    2. Endotele üzerinde nötrofillerin serpmek için AÇIK vanayı çevirin. 4 dakika nötrofil bolus sunun. Valf kapatın ve deney kalanı için yıkama haznesindeki PBSA serpmek.
    3. Bu AK monolay bozacak gibi kabarcıklar tahlil sırasında herhangi bir noktada akış kanalından geçemiyor hava oluner ve yapışık nötrofil nedeni müfrezesi.

    9. Kayıt Nötrofil Yakalama ve Davranış

    1. Kayıt nötrofil işe ya nötrofil akışı veya post-perfüzyon sırasında.
    2. Akış kanalının merkezinde 10 alanları - en az 5, tüm dijital kayıt edin. Giriş limanında kanalın kenarına hedefi hareketli ve limanın orta belirleyerek kanalın merkezini belirleyin.
      1. Nötrofil akışı sırasında kayıt için, 1 dakika boyunca tek bir alanda her 10 sn görüntüleri çekmek. Kanal boyunca hareket ettirin ve 1 dakika boyunca başka alan kaydedin. Bolus süresince tekrarlayın.
      2. (Nötrofil bolus bittikten sonra genellikle 2 dk) lökosit davranışını değerlendirmek için akış kanalının merkezinde aşağı 10 alanlar - post-perfüzyon kayıt için, 5 10 sn kayıt olun. Görüntüleri 10 sn aralığında her saniye sürer. Bu akışından yakalama ve yapışık Neutro davranışı için yeterli zaman tanırPhil'ler analiz edilmesi.
      3. Görüntüleri her 30 saniyede bir alan, 5 dakika boyunca en az 10 transmigrant nötrofilleri içeren tek bir alan kaydedin. Bu (yukarıdaki veya endotel altına ya da) geçirilmiş hücrelerin hızını hesaplamak için kullanılabilir.
      4. 10 sn alanları (genellikle 9 dakika sonrası perfüzyon) başka dizi kaydedin. Bu nötrofiller zaman endotel tek tabaka ile göç sağlar.
      5. Şırınga pompası durdurun ve tüp çıkarın. Akış odasına sökün ve örnek rezervuar ve tüp durulayın. Sonraki filtreler / mikroslayd kanallar için tekrarlayın.

    Lökosit İşe Alım ve Davranış 10. Analizi

    1. 2 dakika zaman noktasında 10 saniye kayıtları sırasında her alanda nötrofil sayısını. Tüm hücreler sayılır için birinci, ikinci alanda mevcut olmalıdır. Görüş alanı 2 taraftan (örneğin, üst / sağ sınır) ile alanında kısmen hücreler dahildirsayımları, sürece tam 10 saniye sahada kalır gibi.
    2. Alan başına yapışık nötrofil ortalama sayısını hesaplayın. Kaydedilen alanın uzunluğunu ve genişliğini ölçün. Alan alanını hesaplayın. 1 mm 2 kaç alanlar var hesaplayın. 1 mm 2 alanların sayısına göre ortalama nötrofil sayımı çarpın.
    3. Perfüze nötrofil miktarı çarpılarak perfüze nötrofillerin toplam sayısını hesaplayın (örneğin, 2 x 10 6 / ml * Q [örneğin, paralel plaka akış odası için 0,0999 ml / dak]) bolus süresine göre (örneğin, 4 dakika ).
    4. Yapışmış hücrelerinin toplam sayısını (hem yapışık hücre / mm perfüze 10/02 6) belirlenmesi için perfüze nötrofillerin sayısı ile nötrofil sayısı / mm 2 bölün.
    5. Yapışık nötrofiller sıkıca yapışık veya (Ek Video 1 ve 2) transmigrant, haddeleme olup olmadığını değerlendirin.
      1. Birnötrofil haddeleme faz parlak ve yavaş yavaş endotel tek tabaka boyunca hareket edecek (1 - 10 mm / sn; Ek Video 1).
      2. Sıkıca yapışık hücreler ya (yani, kayıt sırasında hareket etmiyor) veya şekil değişikliği geçirmiş ve AK yüzeyi (Şekil 1Ei) üzerinden göç etmekte sabit kalan, AK yüzeye faz aydınlık ve bağlı bulunmaktadır.
      3. Bir transmigrant nötrofil karanlık ve AK tabakası (Şekil 1Eii) altında aşamasıdır.
    6. Sabit ve transmigrant, haddeleme yapışık hücre yüzdesini hesaplayın. Seçenek olarak ise, nötrofil davranışı (- 10.7 adımda 10.6 tarif edildiği gibi) toplam yapışma hesaplamak için kullanılan aynı formül uygulanarak, farklı davranışlar sergileyen toplam hücre sayısı olarak ifade edilebilir.
      1. Mark haddeleme nötrofil öncü. 10 sn dizisinin sonunda aynı hücrenin ön kenarını işaretleyin. Bir çizgi çizin bahis2 puan ween ve hücre seyahat etti mesafeyi ölçün.
      2. Hücre haddeleme olduğu kayıt (yani, 10 sn) süresine göre bu değeri bölün. Deneyin ve tüm 10 sn aralığı için alanında bulunmaktadır nötrofiller seçin.
    7. Yüzeyi (şekilli değiştirilen faz parlak) veya endotel (faz karanlıkta) altında üzerinde göç nötrofil hızını hesaplamak için (Ek video 2) kayıt 5 dk kullanın.
      1. Dizisinin başında göç hücrelerin bir taslağını çizin ve dizi boyunca hareketlerini izleyebilirsiniz. Her hücrenin her 1 dk aralığında sentroid X ve Y pozisyonları not edin. İkinci görüntüde değerlerden dizisinin ilk görüntüden X ve Y pozisyon değerlerini çıkarın. Bu Pisagor teoremi dayanmaktadır.
      2. Üçüncü görüntüde ikinci resimdeki değerleri çıkarın. Dizideki tüm görüntüler için bunu yapın. Kare tO X ve Y değerleri ve bunları birbirine ekleyin.
      3. Karekök elde edilen değer. Her dakika aralıklarla hesaplanan hızları ortalaması alınarak her bir hücre için hız hesaplayın. Parça 10 nötrofil göç ve ortalama hızı hesaplar.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Başlangıçta, biz Ibidi mikroslayd modeli (- 9 Bölüm 7) kullanılarak akışından nötrofillerin istihdamı TNFa ile AK uyarıcı etkisi analiz. TNFa, herhangi bir nötrofiller endotel tek tabaka yapıştırılır eğer biraz (Şekil 2A) yokluğunda. Bu 25,26 bağlayıcı desteklemek için gerekli yapışma molekülleri (selektinler) veya kemokinleri ifade etmeyen AK dinlenme / işlenmemiş olarak, bekleniyordu. Bunun aksine, sitokin uyarım önemli bir doza bağlı bir şekilde (Şekil 2A) 'de endotelyuma nötrofil yapışmasını artırmıştır. Yapışma deneyi normal boyunca sabit kalır. Muamele edilmemiş endotelyuma lökosit bağlanması, AT aktive edilir ya da (yani, kültür işlemi sırasında LPS ile kirlenmiş) ve / veya nötrofil izolasyon işlemi sırasında aktif hale belirtir. Gerçekten de, LPS, ICAM-1 ve VC, E-selektin ekspresyonunu artırmak için gösterilmiştirAM-1, onları nötrofil bağlanmasına izin vermek üzere EC yüzeyi üzerinde 25-27.

    Işe nötrofillerin davranışlarını analiz biz, tipik olarak endotel tek tabakalı (Şekil 2C) geçerek göç nötrofillerin yüzdesi eşlik eden bir doz bağımlı bir artış ile (Şekil 2B), haddeleme nötrofillerin yüzdesinde bir doza bağımlı azalma dikkate alınmalıdır. TNFa stimülasyon (1 U / mL), nötrofil daha büyük bir oranda daha düşük dozlarda da endotel (Şekil 2B) apikal yüzeyine bağlı olduğunu gösteren faz parlak görünür. Buna karşılık, 10 ila 100 U / ml (yüksek doz) ile işe nötrofillerin yaklaşık% 40, bu hücreler, endotelyal tek tabaka göç yoluyla endotel (Şekil 2C) altında olan olduğunu göstermektedir 2 dakika faz koyu görünür. Âlemden ulaşan m, 2 dakika - Nötrofiller 1 içinde AB ile göç etmek mümkün~ 10 dk sonrası perfüzyon 28. aximal seviyeleri. Burada 9 dakika sonrası perfüzyon (Şekil 2C) tarafından% 60 2 dakikada 40 ila% nötrofil göçü bir artış gözlendi. Nötrofiller - Biz (~ 3 mm / sn) haddeleme veya (12 mm / dak ~ 10) göç hızına TNFa konsantrasyonunun etkisi olmadığı saptanmıştır.

    Filtre göre modelde, TNFa uyarma Ibidi mikroslayd modeli (Şekil 3A) ile görülene benzer, doza bağımlı bir şekilde, nötrofil yapışmasını artırmıştır. Yüzde göçünde de, doza bağımlı bir artış (Şekil 3C) gözlenmiştir iken davranışı açısından, nötrofil haddeleme, TNFa doz (Şekil 3B) tarafından etkilenmemiştir. Bu deney serisinde, nötrofil göçü (Şekil 3C), zaman içinde önemli bir etkisi görülmektedir.

    Biz iki farklı ko-kültür yapıları oluşturmak için nasıl yöntemler, her sağlamakhangi özel sorulara cevap için icat edilmiştir. Ibidi mikroslayd modelinde, AT ve MSC birbirleri ile doğrudan temas halinde olan bir tek tek tabakalı kültürü yapılır. Bu model, kana MSC terapötik enjeksiyonunun etkisini EC tek tabaka içine daha sonra entegre incelenmesi için yararlıdır. Filtre tabanlı modelinde aksine, AT ve MSC yakın filtrenin karşıt taraflarında kültürlenmiş ama mutlaka doğrudan temas içindedir. Bu daha yakından endotel hücreleri, kan damarı temsil eden bir tek tabaka oluşturan, ve MSC subendotelyal bölmesinde ikamet eden, doku benzer. Bu sitokin uyarılmasına AK cevabına doku yerleşik MSC etkilerini incelemek için bize izin verir.

    Bizim deneyimlerine dayanarak, biz AK 100 U / ml TNFa ile uyarılan zaman maksimum nötrofil işe ve transendoteliyal göç meydana geldiğini görüyoruz. Bu nedenle, biz MSC ko-kültür etkisini incelemek için bu konsantrasyon kullanmışakışından nötrofillerin endotel istihdamı. Burada, AT, ancak, MSC diğer türleri de kontrol edilebilir, örneğin WJMSC mikroslayd ve filtre bazlı modeller kullanılarak ko-kültür BMMSC için veriler sunulmuştur. EC yalnız kültür (Şekil 4A) göre, her iki modelde de BMMSC varlığı önemli ölçüde EC nötrofil yapışma azalır. Ko-kültür EC yalnız veya MSC (Şekil 4B ve C) ile kültüre gözlenen haddeleme ve göçü benzer düzeyleri ile işe nötrofillerin davranışı üzerinde hiçbir etkisi vardı. Böylece, MSC akışından nötrofil işe desteklemek için kendi yeteneğini bastırır sitokin stimülasyonu, AT yanıtı değiştirebilirsiniz.

    Şekil 1,
    Şekil 1. AT-MSC ko-kültür oluşturulması ve bir akış tabanlı yapışma testi kullanılarak nötrofil işe analiz. (A) (i) önce AT ve (ii) geçit 3 BMMSC güçlü> mikrograf doku kültürü şişelerinde büyütülmüştür. 6 oyuklu Transwell filtre ekler AT ve MSC (B) Mikrografik kültürlendi. perfüzyon sistemine (C) Şema oluşturmak için kullanılan (i) sıkı bir şekilde yapışkan (FA) ve (ii) 'transmigrant (TM) nötrofiller EC'ye akışından işe aşağıdakilerden akışı. (D) paralel plaka filtre akış bölmesinin şematik bir temsilidir. (E) mikrograf 100 U / ml TNFa ile uyarılan . Görüntüler C ve D Moleküler Biyoloji Yöntemleri Şekil 2 ve 3 alınmıştır:. T-hücresi Ticareti, 2010, Springer Bilim ve İş Media tür izni ile pg 53-54 28 Bu büyük halini görmek için buraya tıklayınız rakam.


    . 4 saat - (100 U / ml 0) Ibidi Lamlar kullanarak TNFa ile uyarılan EC'ye akışından Şekil 2. Nötrofil alımları AT TNFa artan konsantrasyonları ile uyarılmıştır. Nötrofil 4 dk hap 2 dk değerlendirildi 0.05 Pa. (A) Nötrofil yapışma EC tek tabaka üzerinde perfüze edildi. ANOVA nötrofil yapışma, p <0.01 tarihinde TNFa tedavisinin önemli bir etki gösterdi. Nötrofil davranışı 2 ve 9 dakikada ölçüldü ve (B) silindir veya (C) transmigrant edildi yapışan hücrelerin yüzdesi olarak ifade edildi. ANOVA yapışık nötrofiller, p <0.001 davranışları üzerindeki TNFa tedavisinin önemli bir etki gösterdi. C ANOVA transmigrant nötrofiller p <0.01 ile önemli bir zaman göstermiştir. Veriler, n = 3 deney için ortalama ± SEM olarak. * P <0.05 ve **Dunnett post-testi ile uyarılmamış (0 U / ml), EC kontrol ile karşılaştırıldığında p <0.01. ## p <0.01 ve ### Bonferroni Direk- aynı zaman noktasında 1 U / ml AB ile karşılaştırıldığında p <0,001 Test.

    Şekil 3,
    . 4 saat - (100 U / ml 0) filtre tabanlı tahlil kullanılarak TNFa ile uyarılan EC'ye akışından Şekil 3. nötrofil çoğalması AT TNFa artan konsantrasyonları ile uyarılmıştır. Nötrofil 4 dk hap 2 dakikada değerlendirildi 0.1 Pa. (A) Nötrofil yapışma EC tek tabaka üzerinde perfüze edildi. ANOVA nötrofil yapışma, p <0.001 tarihinde TNFa tedavisinin önemli bir etki gösterdi. Nötrofil davranışı 2 ve 9 dakikada ölçüldü ve (B) silindir veya (C) transmigrant edildi yapışan hücrelerin yüzdesi olarak ifade edildi. C, ANOVA shonötrofil göçü, p <0.05 zaman ve sitokin tedavisi önemli bir etkisi evlenmek. Veriler, n = 3 deney için ortalama ± SEM olarak. ** P <0.01 ve *** p <Bonferroni posta yoluyla aynı zaman noktasında 1 U / ml EC kıyasla Dunnett test sonrası. # P <0.05 ile uyarılmamış (0 U / ml) AT kontrole göre 0.001 -testi.

    Şekil 4,
    TNFa ile uyarılan AT-BMMSC ko-kültürler akışından Şekil 4. nötrofil çoğalması. BMMSC önce, 4 saat için 100 U / ml TNFa ile uyarılmaya, 24 saat için AT ile birlikte kültürlenmiştir. Nötrofil 4 dakika hap (A, C, E) lamlara 0.05 Pa ve (B, D, F) filtreleri 0.1 Pa EC tek tabaka üzerinde perfüze edildi. (AB), nötrofil adhezyonunun 2 dakika değerlendirildi. Nötrofil davranışı 2 ve 9 m değerlendirildive (CD), haddeleme ya da transmigrant (EF) olan yapışkan hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir. C ve D'de, varyans analizi nötrofil haddeleme, p <0.05 ile kültür koşulları önemli bir etki gösterdi. E ve F olarak, varyans analizi nötrofil göçü, p <0.05 zaman önemli bir etki gösterdi. Ancak, herhangi bir anlamlı farklılık Bonferroni post-testi ile bireysel tedaviler arasında geçişe gözlenmiştir. Veriler, n = 5 deneyden ± SEM. * P <0.05 eşleştirilmiş t-testi veya Bonferroni post-testi ile AK monokültür göre.

    Nötrofil haddeleme hızları Ek video 1. Analiz., Bir Transwell filtre üzerinde kültürlenmiş AT 4 saat süre ile 100 U / ml TNFa ile stimüle edildi. Nötrofil bolus 4 dakika için AB üzerinde perfüze edildi. Tek bir 10 sn alanının Temsilcisi sayısallaştırılmış dizisi 2 alındığıdk sonrası perfüzyon. 10 sn dizisinin başlangıcından sonuna kadar tek bir silindir nötrofil konum değişikliği nötrofil haddeleme edildiği hız hesaplamak için kullanılabilir.

    Nötrofil göçü hızlarının ek video 2. Analiz. AK bir Transwell filtre üzerinde kültüre 4 saat süre ile 100 U / ml TNFa ile stimüle edildi. Nötrofil bolus, 4 dakika için EC üzerinde perfüze edildi. Tek bir 5 dk alanının Temsilcisi sayısallaştırılmış dizisi transmigrant nötrofillerin hareketini izlemek için. Bu hız hesaplamak için kullanılabilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Burada iltihaplı endoteli tarafından nötrofillerin dolaşımdaki işe okuyan iki in vitro "vasküler" modelleri açıklar. Bu modellerin önemli bir avantajı, in vivo olarak meydana gelen gibi, sırayla lökosit yapışma kademeli olarak her adımda analiz yeteneğidir. Daha önce TNFa ile uyarılan EC 9,29 ile doza bağlı, nötrofil adhezyonunun artış ve transmigrasyonun gözlemledik. Biz de hem modeller lökosit işe üzerindeki stromal hücrelerin etkilerini incelemek için adapte edilebilir açıklanmıştır. Burada MSC bir Ibidi mikroslayd ya da bir gözenekli filtre karşıt taraflarında AT ile birlikte kültürlenmiştir. Bu iki hücre tipleri, böylece birbirlerinin fenotip ve yanıtı değiştirerek, birbirleri ile iletişim kurmasını sağlar. Biz MSC varlığı TNFa-uyarılmış EC nötrofil yapışma bastırılmış ki, burada gösterilen ve önceki çalışmalarda 23 oylandı. Bu stromal hücreler AK yanıtı değiştirmek olduğunu gösterirdaha sonra sitokin ve dolaşımdaki lökositlerin işe değiştirir.

    Yukarıda tarif edilen modellerde ek olarak, Cellix Biochipler, Bioflux plakaları ve Glyotech paralel plaka akış odası, ticari olarak endotel kültürlenmesi ve alım gözlemlemek için bir yüzey temin veriler akış kanalı sistemleridir. Bütün sistemlerde, belirli parametrelerin endotel kültürleri oluşturulması ve altında ve daha önceki raporlarda 30,31 vurgulanır bazıları akış tabanlı yapışma deneyleri, performans sırasında göz önüne alınmalıdır. Sitokin yanıtlarını etkileyebilir hidrokortizon gibi herhangi bir anti-enflamatuar maddeler, kültür ve tahlil 18,29 süresince ortamından çıkarılmalıdır. Bu AK tek tabaka bozacak gibi EC kültür sırasında akış kanalı mevcut hava kabarcıkları vardır emin mikroslayd Ibidi kullanırken. cytoki endotel tek tabaka bütünlüğü teyit edilmelidir öncene-tedavi, nötrofiller BSA mikroslayd / filtre kaplı olan tek tabaka boşluklar bağlamak gibi. Bu TNFa sıcaklığa duyarlı ve sadece 37 ° C 'de en fazla etkiye sahiptir, çünkü AT sitokin uyarım boyunca 37 ° C sıcaklıkta muhafaza edilmiştir sağlamak için de gereklidir. (- 48 saat 1) 30,31 akış deneyinde kendisi için uygun bir yıkama tamponu seçmek biz tipik olarak daha uzun deneyleri için BSA (% 0.15) ile takviye edilmiş, kısa deneyleri (en az 30 dakika) ve M199 medyumu için, albümin kullanın. Sonunda bu akış hızı, zararları AK tek tabaka bozar ve yapışık nötrofil aktive olarak tahlil sırasında akış kanalı mevcut hava kabarcıkları vardır emin olun.

    Burada tarif edilen çoklu-hücre, in vitro modellerde önemli avantajlarından biri, EC ve stromal hücreleri arasında in vivo olarak etkileşimleri çoğaltmak yetenekleridir. Bu, in vivo olarak belirli bir stroma bileşenlerin etkilerini izole etmek güçtürve kontrollü bir şekilde bunları değiştirmek. Bizim modellerde, stromal hücreler AT ile iletişim ve sağlık ve hastalık inflamatuar süreci nasıl etkilediği aydınlatmak için manipüle edilebilir. Örneğin, siRNA teknolojisi kullanılarak daha önce bunların immünosupresif etkilerine 23 için ortak-kültür esnasında MSC gerekli IL-6 üretimlerinin edildi göstermiştir. Her model, yani özel sorular, lökosit işe üzerindeki doku yerleşik stromal hücreler (filtre-tabanlı model) ya da terapötik stromal hücreler (Ibidi lamlara ve piyasada mevcut diğer sistemlerin) etkisini gidermek için kullanılır. Her iki durumda da biz onların canlılığı sağlamak ve işe 15,25 üzerindeki etkileri değerlendirmek için AK'ye stromal hücre uygun bir oranını kurmak için farklı stromal hücre tipleri titre var. Benzer şekilde kültür ortamı modeline dahil her hücre tipi ile uyumlu olması gerekir. Bizim ellerde ortak kültürler genellikle stromal hücre m yapılmaktadıredium 11,18,23,31.

    Filtre tabanlı modeli kullanarak, daha önce çeşitli stromal hücreler, bir doku-spesifik bir şekilde yapışmasını ve lökositlerin geçişini desteklemek için AT yeteneğini modüle eden ve bu etkiler, kronik hastalıkların 3, değiştirilmiş haline göstermiştir. Bu stromal hücreler aktif iltihaplı dokuya 24 lökositlerin işe düzenleyen doku-spesifik "adres kodları" kurmak kavramına yol açtı. Bu modeller özellikle büyük detaylı işe ilk aşamalarını incelemek için tasarlanmış ancak (doku içine uzakta endotel, yani) subendotelyal alanı içinde sonraki göç incelemek için edemiyoruz vardır. Böyle bir statik kollajen jel tahlil 12,32 gibi çok hücresel, çok katmanlı 3D yapıları işe bu son evrelerini incelemek için daha uygun olacaktır.

    Bizim akış tabanlı yapışma modelleri oldukça çok yönlü. Biz des varnötrofil göçünü bağlamında kullanımını açıklanan şekilde, ancak diğer lökosit alt-kümeleri benzer bir şekilde araştırılabilir. Biz de EC 23 ile MSC dolaşımdaki işe araştırmak için Ibidi mikroslayd sistemi kullanılmış, ve bu aynı yapışma kaskad ile oluşup lökositler için bildirmiştir. Benzer şekilde, bu modeller işe ve metastatik tümör hücre çizgileri dahil edilmesini, ve endotelyal yanıtları ve lökosit göçünün üzerindeki sonraki etkisini incelemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, filtre tabanlı bir model, sağlıklı dokuların 13,21 ve hastalık 11,18,20 sitelerden stromal hücreler (örneğin, fibroblastlar, Podositler, yumuşak kas hücreleri) farklı birleştirmek için adapte edilebilir. Bu EC ve / veya lökosit düzeyinde etkili dokuya özel düzenleyici yollardan çalışma sağlayacaktır. Tüm durumlarda, hastalık durumlarının bir dizi normal düzenleyici işlemlerin bozulması ke belirlemek için incelenebilirve potansiyel yeni tedavi yaklaşımları (örneğin, IL-6 ve TGFβ olarak) y-düzenleyici aracılar. Kronik inflamasyon bağlamında bu maddeler, kanser biyolojisinde bir tümörü hedef işe açmak için kullanımını düşünebiliriz ederken, işe alım sürecini kapatmak için kullanılmış olabilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Collagenase Type Ia Sigma C2674 Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Dulbecco's PBS Sigma D8662 With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
    1X Medium M199 Gibco 31150-022 Warm in 37 °C water bath before use.
    Gentamicin sulphate Sigma G1397 Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
    Human epidermal growth factor Sigma E9644 Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Fetal calf serum (FCS) Sigma F9665 FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
    Amphotericin B Gibco 15290-026 Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Hydrocortisone Sigma H0135 Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Collagenase Type II Sigma C6885 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    Hyaluronidase Sigma H3631 Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube Scientific Lab Supplies (SLS) 352360 Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
    DMEM low glucose Biosera LM-D1102/500 Warm in 37 °C water bath before use.
    Penicillin/Streptomycin mix Sigma P4333 Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    25 cc tissue culture flask SLS 353109
    75 cc tissue culture flask SLS 353136
    Bone marrow mesenchymal stem cells vial Lonza PT-2501 Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
    Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) Lonza PT-3001 Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
    EDTA (0.02%) solution Sigma E8008 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
    Trypsin solution Sigma T4424 Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
    Cryovials Greiner bio-one 2019-02 Keep on ice before adding before adding cell suspension.
    Mr. Frosty Freezing Container Nalgene 5100-0001 Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
    Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile Ibidi IB-80606 Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
    Cell tracker green dye Life technologies C2925 Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
    Cell counting chambers Nexcelom SD-100 Alternatively a haemocytometer can be used.
    Cellometer auto T4 cell counter Nexcelom Auto T4-203-0238
    Tumor necrosis factor α (TNFα) R&D Systems 210-TA-100 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
    6-well, 0.4 µm PET Transwell filters SLS 353090
    K2-EDTA in 10ml tubes Sarstedt Store at RT.
    Histopaque 1119 Sigma 11191 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    Histopaque 1077 Sigma 10771 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    10 ml round bottomed tube Appleton Woods SC211 142 AS
    7.5% BSA Fraction V solution Life technologies 15260-037 Store at 4 °C.
    20 ml Plastipak syringes BD falcon 300613
    5 ml Plastipak syringes BD falcon 302187
    2 ml Plastipak syringes BD falcon 300185
    3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm Micropore 1530-1 Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
    Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) Fisher Scientific FB68854 Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
    Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) Fisher Scientific FB68855
    Portex Blue Line Manometer tubing Smiths 200/495/200 Tubing leading to the syringe pump.
    3-way stopcock BOC Ohmeda AB
    Glass 50 ml syringe for pump Popper Micromate 550962 Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
    Glass coverslip Raymond A Lamb 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
    Parafilm gasket American National Can Company Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
    Two perspex parallel plates Wolfson Applied Technology Laboratory Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
    Electronic 3-way microvalve with min. dead space Lee Products Ltd. LFYA1226032H Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
    Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) Harvard Apparatus 70-2001 Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
    L-shaped connector Labhut LE876 To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
    Video camera Qimaging 01-QIC-F-M-12-C Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
    Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics 41N70000-61592 For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
    Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
    2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
    3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
    4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
    5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
    6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
    7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
    8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
    9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
    10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
    11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
    12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
    13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
    14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177 (2009).
    15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
    16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
    17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
    18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
    19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
    20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
    21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
    22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
    23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
    24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
    25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
    26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
    27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
    28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
    29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
    30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

    Tags

    Immunology Sayı 95 endotel hücreleri lökositler mezenkimal stromal hücreleri mezenkimal stem hücreleri ko-kültür yapışma enflamasyon alımları göre yapışma deneyi akış Ibidi mikroslayd nötrofil
    Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G.… More

    Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp. (95), e52480, doi:10.3791/52480 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter