Summary
Эта рукопись описывает обнаружение SUMOylation и убиквитинирование кинетохорных белков, Ndc10 и Ndc80, в многообещающий дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE.
Abstract
Посттрансляционных модификаций (PTMs), такие как фосфорилирование, метилирование, ацетилирование, убиквитинирования и SUMOylation, регулируют клеточную функцию многих белков. PTMs из кинетохорных белков, которые связывают с центромерной ДНК посредником верный сегрегации хромосом для поддержания стабильности генома. Биохимические подходы, такие как масс-спектрометрии и западной блот-анализа наиболее часто используется для идентификации PTMs. Здесь способ очистки белка описано, что позволяет обнаруживать как SUMOylation и убиквитинирования из кинетохорных белков, Ndc10 и Ndc80, в Saccharomyces CEREVISIAE. Штамм, который выражает полигистидином Флаг-тегами Smt3 (ВЧ-Smt3) и Мус-меченый Ndc10 или Ndc80 был построен и используется для наших исследований. Для обнаружения SUMOylation, мы разработали протокол аффинной очистки His-меткой sumoylated белки с помощью никелевых шарики и используется Вестерн-блоттинга с анти-Myc антитела для выявления sumoylated Ndc10 Aй Ndc80. Для обнаружения убиквитинирования, мы разработали протокол для иммунопреципитации Мус-меченных белков и используется Вестерн-блоттинга с анти-Ub антитела, чтобы показать, что Ndc10 и Ndc80 которые убиквитинируется. Наши результаты показывают, что эпитоп тегами интерес белок в Его-Flag помечены штамм Smt3 облегчает обнаружение нескольких PTMs. Будущие исследования должны позволить эксплуатации этой техники, чтобы определить и охарактеризовать белковые взаимодействия, которые зависят от конкретного ПТМ.
Introduction
Убиквитинирование и сумоилирования позволяют сопряжение убиквитином и Малый Убиквитин-как модификатора (SUMO; Smt3 в S.cerevisiae, 1) к белку-мишени, соответственно. PTMs из кинетохорных белков влияют на их клеточном уровнях и белок-белковых взаимодействий на различных этапах клеточного цикла, чтобы обеспечить точное сегрегации хромосом. Например, сотовые уровни Cse4 / CENP-A и внешний белка кинетохор Dsn1 регулируются убиквитин-опосредованной протеолиза для обеспечения стабильности генома 2-5. Дестабилизация неправильных кинетохорных микротрубочек вложений требует B киназы Ipl1 / Aurora, который фосфорилирует Dam1 и Ndc80 комплексы, которые непосредственно взаимодействуют с микротрубочками 6-8. Несмотря на выявление более семидесяти кинетохорных белков, существует очень мало исследований, которые исследуют изменения этих белков с PTMs, например, убиквитином и сумо. Основным ограничением является способность сохранять PTMс во время очистки и нехваткой таможенных антител для обнаружения PTMs, таких как SUMOylation, фосфорилирования, метилирования, и другие. Характеристика sumoylated кинетохорных белков Ndc10, Cep3, Bir1 и Ndc80 используется пользовательский антитела 9. Кроме того, Ndc10 был вовлечен в качестве субстрата для убиквитинирования 10. Человек Hec1 (Ndc80 в S.cerevisiae,) также субстратом для убиквитинирования, регулируется APC / C-hCdh1 E3 лигазы 11. Таким образом, Ndc10 и Ndc80 являются хорошими кандидатами для оптимизации протокола для выявления как SUMOylation и убиквитинирование в S. Cerevisiae.
Для облегчения идентификации SUMOylation, мы построили штаммов, которые выражают HF-Smt3 и Мус-меченый Ndc10 или Ndc80. Использование эпитопные метки (HF: His6-Flag) сводит к минимуму фон из-за перекрестной реактивности, что часто наблюдается в поликлональной сывороткой, выработанном против белок-кандидат. Мы разработали протокол к близостиочистить ВЧ-Smt3 конъюгатов, а затем использовали коммерческий анти-Flag и анти-Myc антитела для обнаружения присутствия sumolyated Ndc10 и Ndc80 в очищенный препарат Smt3. Для убиквитинирования, мы разработали модифицированный протокол иммунопреципитации, который сохраняет убиквитинирование из Мус-меченых белков кинетохорных и осуществляется вестерн-блот анализ с коммерческой анти-Ub антитела для выявления убиквитинирование Ndc10 и Ndc80.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Рост клеток дрожжей
- Посев клеток дрожжей в 30 мл YPD (таблица 1) в небольшую колбу. Выдержите на 30 ° С в течение ночи при встряхивании.
- Развести клетки к оптической плотности 0,2 при 600 нм (OD 600 = 0,2) в 50 мл YPD и инкубируют при 30 ° C при встряхивании.
- Выращивают культуру до оптической плотности 1,0 при 600 нм (OD 600 = 1,0).
- Центрифуга клетки в течение 5 мин при 2000 мкг и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в 40 мл стерильной воды и центрифуги в течение 5 мин при 2000 мкг мыть клетки. Жидкость над осадком сливают и хранят осадок клеток при -20 ° С.
2. Добыча белков
- Ресуспендируют клеток в 0,5 мл охлажденного льдом буфера гуанидина (таблица 1) для выпадающего анализе с использованием Ni-NTA Superflow шарики или буфер А (таблица 1) для иммунопреципитации. Держите труб на льду во все времена.
- Трансфер до 2 мл винтовой крышкой трубки.
- Добавить такой же объем стеклянных шариков (Таблица материалов).
- Бисера-бить клеток в мини борта колотушки (табл материалов) в течение 2 мин при комнатной температуре, затем поместить на льду в течение 2-3 мин. Повторите это три раза.
- Вихревой на высокой скорости при 4 ° С в течение 30-60 мин. Проверка клетки от визуализации под микроскопом, чтобы гарантировать, что клетки лизируют.
Примечание: лизированных клеток будет выглядеть как темные призраки и отсутствие границу или определенную форму. Оптимально, по меньшей мере 80% клеток должны быть лизированы. - Прокол отверстие в нижней части трубы с помощью канцелярской кнопки и место в коллекции 15 мл коническую трубку (винтовая крышка должна быть свободной).
- Центрифуга при 1000 х г в течение 1 мин, чтобы собрать лизата.
- Передача лизата в микро трубки центрифуги.
- Центрифуга при 15000 х г в течение 30 мин при 4 ° С для сбора извлеченные белки.
- Измерить концентрацию извлеченных белков с использованием белка ASSAу комплект (Таблица материалов) и нормализуют все экстракты содержат одинаковое количество белка. Довести общий объем до 1 мл соответствующего буфера.
Примечание: Около 5 мг общего белка получают из 50 OD 600 клеток. - Сохранить 50 мкл (250 мкг белка, если общий белок экстрагируют из шаг 2.10 составляет 5 мг) в виде экстракта цельных клеток (WCE). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца (Таблица 1) и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Нагрузка 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
3. Очистка ВЧ-Smt3 конъюгатов
- Получите Superflow бусы Ni-NTA (табл материалов), необходимых для экспериментов (100 мкл из бисера на пробу) по низкоскоростным центрифугированием (800-1500 мкг в) в течение 1 мин. Удалить супернатант.
- Бисер Вымойте 5x 1 мл PBS (табл материалов): Обратить топ-over-Нижняя, пока шарики не ресуспендировали, собирать шарики от низкой скорости центрифугирования и удаления супернатанта.
- Приостановка бусины в 1 мл буфера гуанидина (Таблица 1) и аликвоту их в количестве труб, соответствующих образцов, подлежащих обработке. Соберите бусы низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант. Смешайте бисер также путем обращения топ-над нижней.
Примечание: Смешайте бисер также путем обращения топ-над дном. - Для каждого образца, добавить 950 мкл оставшейся WCE (с шага 2.11: экстракция белков) в 100 мкл Ni-NTA Superflow бисера.
- Инкубировать на платформе-качалке при 4 ° С в течение по меньшей мере 4 ч или в течение ночи.
- Центрифуга при 800-1500 мкг в течение 1 мин при 4 ° С.
- Сохранить 50 мкл супернатанта в качестве (SUP). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Нагрузка 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (раздел 5: Вестерн-блот анальныйлиз).
- Бусины Промывают один раз 1 мл буфера гуанидина в течение 5-10 мин на качающейся платформе.
- Бусины Wash 5x 1 мл буфера нарушение (таблица 1) в течение 5-10 мин на качающейся платформе.
- Ресуспендируют бусины в 90 мкл 2x буфера Лэммли образца.
- Добавьте 10 мкл 1 М имидазола.
Примечание: Имидазол помогает отделить Его-меченый белок из бисера Ni-NTA-за конкурирующего взаимодействия между имидазола и бисером. - Инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин.
- Вихрь, затем центрифуги при 13000 мкг в течение 30 сек. Передача супернатант в новую пробирку.
- Нагрузка 10-20 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
Примечание: 10-20 мкл соответствует 0,5-1,0 мг ввода, если 5 мг ЗЦЕ используется.
4. Иммунопреципитация Мус-меченых белков кинетохор
- Получить анти-с-Myc агарозном геле сродства апtibody (табл материалов), необходимых для экспериментов (25 мкл смолы на образце) по низкоскоростным центрифугированием (800-1500 XG). Удалить супернатант.
- Мойка смолы 5x 1 мл буфера А: Инверсия верхнего над дном до смолу повторно суспендируют, собирают смолу низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант.
- Приостановка смолы в 1 мл буфера А и аликвоту их в количестве труб, соответствующих образцов, подлежащих обработке. Сбор смолы с низкой скоростью центрифугирования и удаления супернатанта.
Примечание: Смешайте смолу и обращением топ-над-дно. - Добавить 950 мкл оставшейся WCE (с шага 2.11: экстракция белков) в 25 мкл смолы.
- Инкубировать на платформе-качалке при 4 ° С в течение ночи.
- Центрифуга при 800-1500 мкг в течение 1 мин при 4 ° С.
- Сохранить 50 мкл супернатанта в качестве (SUP). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Вотобъявления по 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
- Мойка смолы 5x 1 мл буфера А: Инверсия верхнего над дном до смолу повторно суспендируют, собирают смолу низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант.
- Ресуспендируют смолы в 100 мкл образца буфера SUMEB (Таблица 1).
Примечание: образец SUMEB буфер содержит 8 M мочевину и 1% SDS (сильное условие денатурации). - Инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин.
- Вихрь, затем центрифуги при 13000 мкг в течение 30 сек. Передача супернатант в новую пробирку.
- Нагрузка 10-20 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
Примечание: 10-20 мкл соответствует 0,5-1,0 мг ввода, если 5 мг ЗЦЕ используется.
5. Вестерн-блот анализ
- Загрузите белковых экстрактов на 4-12% Бис-Трис гели (табл материалов) и перфорацияORM электрофорез при 120 V в течение 90 мин (Запуск буфер: Таблица материалов).
- Передача белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану (табл материалов) с использованием аппарата переноса при 30 В в течение 90 мин (буфер передачи: Таблица материалов).
- Блок мембраны в 5% молоке / TBST 1x (Table1) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубируйте мембрану с первичными антителами (таблица материалов) в 5% молоке / TBST 1x в течение ночи при 4 ° C. Для первичных антител, использовать разведение 1: 1000 (анти-Flag и анти-UB антитела) или 1: 5000 (анти-Мус антител).
- Вымойте мембраны 3 раза в течение 10 мин каждого с 1x TBST.
- Инкубируйте мембраны с вторичным антителом (таблица материалов) в 5% молока / 1x TBST в течение 1 часа при комнатной температуре. Используйте в разведении 1: 5000 вторичных антител.
- Вымойте мембраны 3 раза в течение 10 мин каждого с 1x TBST.
- Выдержите мембраны с ECL WorkiРаствор нг (табл материалов) в течение 5 мин.
- Expose мембрану к синему чувствительной рентгеновской пленки (табл материалов) и развивать с помощью автоматического разработчика (табл материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для обнаружения SUMOylation из кинетохор белков Ndc80 и Ndc10, штаммы с ВЧ-Smt3 и Мус-меченых белков кинетохорных (Ndc80 или Ndc10) были построены (таблица 2), как описано ранее 9,12. ВЧ-Smt3 конъюгаты очищали с использованием аффинной бусы Ni-NTA. Вестерн-блот-анализ очищенного HF-Smt3 с анти-Flag антител позволило обнаружения sumoylated форм SUMO субстратов, которые отсутствовали в контрольном штамме без ВЧ-Smt3 (фиг.1А и 1В, левая панель). Как и ожидалось, несколько форм сумо субстратов были обнаружены в штамме ВЧ-Smt3. Затем мы определяли при Ndc80 и Ndc10 присутствуют в очищенной ВЧ-Smt3 конъюгата, делая Вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Myc. Несколько групп, которые были более высокой молекулярной массой, чем у Ndc80 или Ndc10 были четко обнаружить (фиг.1А и 1В, справа). Кроме того, несколько полос как Ndc80 и Ndc10были снижены в клетках, обработанных нокодазолом (рис 1с и 1d). Эти результаты показывают, что очистка белка и вестерн-блот анализ, описанный здесь позволяет обнаруживать SUMOylation из Ndc80 и Ndc10, как описано выше 9.
Для обнаружения убиквитинирование Ndc80 и Ndc10, Мус-меченый Ndc80 или Ndc10 иммунопреципитировали (IP) и Вестерн-блоттинга выполняли с анти-Myc и анти-UB антитела (рис 2). Анализ цельных клеточных экстрактов (WCE) и супернатант (ИСП) подтвердил экспрессию Ndc80-Myc и Ndc10-Myc (2А). Нижние молекулярные полосы вес на ЗЦЕ может представлять продукты распада. Образцы IP испытанные с анти-Myc показала множественные высокие полосы молекулярным весом, предполагая, что Ndc80 и Ndc10 содержать PTMs. Лэддеринг шаблон образцов исследуемых IP анти-Ub антитела показали, что Ndc80 и Ndc10 которые убиквитинируется (2А, α-UB), Лэддеринг модель Ndc80 и Ndc10 были расширены путем обработки ингибитором протеасом MG132 () (рис 2B, α-UB), далее, подтверждающие, что эти полосы представляют поли-ubiqutination. Представительные результаты показывают, что оба Ndc80 и Ndc10 являются субстратами для SUMOylation и убиквитинирования в S. CEREVISIAE и что описанные способы очистки белка можно использовать для обнаружения PTMs таких как SUMOylation и убиквитинирования. По нашей информации, это первый доклад, что Ndc80 в S. CEREVISIAE является субстратом для убиквитинирования, хотя убиквитин опосредованного протеолиза человеческого гомолога Hec1 была ранее опубликована 11.
Рисунок 1: Очистка sumolyated субстратов позволяет идентифицировать белки кинетохор Ndc80 и Ndc10 как SUMO субстратов Pr.oteins были извлечены и ВЧ-Smt3 были получены конъюгаты и анализировали с помощью вестерн-блоттинга после отделения SDS-PAGE. (А и Б) Ndc80 и Ndc10 которые sumoylated. Белки были извлечены из логарифмически растущие клетки в YPD. Левая панель: Всего SUMO субстраты были обнаружены с помощью антитела анти-Flag. Справа: Sumoylated Ndc80 или Ndc10 был обнаружен в конъюгатах ВЧ-Smt3 при зондировании антитела анти-Myc. (С и D), SUMOylation из Ndc80 и Ndc10 уменьшается нокодазол обработанных клеток. Логарифмически растущие клетки в YPD обрабатывали ДМСО (-) или ДМСО + 20 мкг / мл нокодазолом (+) в течение 2 ч при 30 ° С. ВЧ-Smt3 конъюгаты были проанализированы с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием анти-Myc антитела. Изогенных штаммов дрожжей, используемых в (А и С) YPH1800 (Ndc80-Мус), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Мус) и (Б и Г) YPH1734 (Ndc10-Мус), YMB7867 (His-FlAG-SMT3 Ndc10-Мус).
Рисунок 2:. Убиквитинирование из кинетохор белков Ndc80 и Ndc10 Добыча белка и иммунопреципитации проводили, как описано в протоколе. () Ndc80 и Ndc10 которые убиквитинируется. Белки были извлечены из логарифмически растущие клетки в YPD. Экстракт Цельноклеточные (WCE), супернатант (SUP), и иммунопреципитации (IP) фракции подвергали SDS-PAGE. Вестернблоты были использованы для выявления Myc-метками и убиквитинированного белки с анти-Myc и анти-Ub антител, соответственно. (Б) убиквитинирование Ndc80 и Ndc10 усиливается в клетках, обработанных ингибитором протеасомы MG132. Логарифмически растущие клетки в YPD обрабатывали ДМСО (-) или ДМСО + 50 мкМ MG132 (+) в присутствии 0,003% ДСН в течение 3 часов при 30 ° С, как описано ранее 13
| Решение | Компоненты |
| YPD | 1% дрожжевого экстракта, 2% Васто-пептон, 2% глюкозы |
| Гуанидин буфер | 0,1 М Трис-HCl, рН 8,0, 6 М гуанидин-хлорида, 0,5 М NaCl |
| Буфер | 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 0,2% Тритон Х-100, ингибиторы протеазы 1x |
| Главные буфер | 0,1 М Трис-HCl, рН 8,0, 20% глицерина, 1 мМ PMSF |
| SUMEB буфера образца | 1% ДСН, 8 М мочевины, 10 мМ MOPS рН 6,8, 10 мМ ЭДТА, 0,01% голубой бромфениловый |
| 2x Лэммли Образец Буфер | 100 мМ Трис-HClрН 6,8, 4% SDS, 20% глицерина, 0,2% бромфенолового синего (Перед использованием: добавление б-меркаптоэтанола (BME) до конечной концентрации 200 мМ) |
| 1x TBST | 137 мМ хлорида натрия, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1% Твин-20 |
Таблица 1: Решения.
| Таблица 2. Штаммы дрожжей, используемые в данном исследовании *. | |||
| Деформации | Родитель | Генотип | Ссылка |
| BY4741 | MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 | Открыть биосистем | |
| BY4742 | MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 | Открыть биосистем | |
| YMB7278 | BY4741 / BY4742 | MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 урa3Δ0 ВЧ-SMT3 :: LEU2 | Эта учеба |
| YPH1734 | MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 | Montpetit др., 2006 | |
| YPH1800 | MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 | Montpetit др., 2006 | |
| YMB7862 | YMB7278 / YPH1800 | MATa his3 leu2 URA3 ADE2 trp1 ВЧ-SMT3 :: LEU2 Ndc80-Мус :: His3MX6 | Эта учеба |
| YMB7867 | YMB7278 / YPH1734 | MATa his3 leu2 URA3 trp1 Lys2 ВЧ-SMT3 :: LEU2 NDC10-Мус :: kanMX6 | Эта учеба |
| * Все штаммы дрожжей являются производными от Saccharomyces Cerevisiae S288C. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эпитоп теги, такие как HA, Мус, флаг, и GST широко используются для биохимического анализа белков. Строительство штаммов с HF-Smt3 и Мус-меченных кинетохорных белков, таких как Ndc10 и Ndc80, облегчает обнаружение PTMs таких как SUMOylation и убиквитинирования. ВЧ-Smt3 снести анализа позволяет выявлять sumoylated кинетохорных белков, Ndc10 и Ndc80 (рис 1). Протокол аффинной очистки и Вестерн-блоттинга с использованием анти-Flag антитела установить специфичность взаимодействия ВЧ-Smt3 и белков-мишеней, а модифицированные белки не были обнаружены в контрольном штамме без ВЧ-Smt3. Использование тега Myc на белковых субстратах проверяет наличие sumoylated Ndc10 и Ndc80 в конъюгатах ВЧ-Smt3. Кроме того, сумоилирования обоих Ndc10 и Ndc80 была снижена в нокодазол обработанных клеток (рис 1С и 1D). Снижение SUMOylation из Ndc10 в ответ на нокодазолом ЛЕЧЕНИИт, но не Ndc80, ранее сообщал Montpetit др. 9. Это может быть из-за различий в протоколе и использования пользовательского анти-SUMO антитела. Наши результаты для SUMOylation из кинетохорных субстратов предположить, что подобная протокол может быть использован для исследования других кандидатов сумо субстратов.
Для обнаружения убиквитинирование, Мус-тегом кинетохор белки были впервые иммунопреципитировали и IP фракции исследовали с анти-Ub антитела (рис 2). Лэддеринг образец Ndc10 и Ndc80 была увеличена, когда клетки обрабатывали MG132 ингибировать функцию протеасомы (фиг.2В), указывая, что эти белки являются субстратами протеасомы. IP-фракции не удалось обнаружить SUMOylation из Ndc10 или Ndc80 в Вестерн-блот-анализа с анти-Flag или анти-Smt3 антителом (данные не показаны). Это может быть из-за технических причин, таких как уровни sumoylated подложки во фракции IP или interferencе из тегов эпитоп. Дальнейшая оптимизация протокола IP, таких как концентрация солей и вестерн-блоттинга условиях должны способствовать выявлению нескольких PTMs любого интересующего белка. В настоящее время, сумоилирования лучше обнаружены ВЧ-Smt3 снести анализа с последующим западных пятнами кандидата SUMO субстратов (рисунок 1).
Несколько подробнее влияет на эффективность очистки белков и способность обнаруживать PTMs. Во-первых, все трубы должны быть на льду тормозят протеаз кроме как указано. Во-вторых, в соотношении 1: 1 из клеточной суспензии на стеклянные бусы имеет решающее значение для разрушения клеток с помощью бортового колотушки и / или вихревом смесителе. Лизис клеток следует контролировать путем исследования клеток под микроскопом. В-третьих, очень важно, чтобы подготовить осветленной лизата для выпадающего анализа или IP. Краткое или низкая скорость центрифугирования может способствовать загрязнению мусора клеток в лизата, и это влияет на способность детеКТ PTMs. Наконец, энергичного встряхивания гранул с большим объемом прозрачного лизата (около 1 мл) в 1,5 мл микро трубки центрифуги гарантирует, что шарики полностью приостановлено в раскрывающемся анализа или IP-адресов. Таким образом, очистки белков и обнаружения, такой как описана здесь обеспечивают важные механистические понимание того, как ПТМ из кинетохорных белков влияет на их структуру и сборку для верными хромосом 14, 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm diameter |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1,000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5,000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5,000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1,000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5,000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5,000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
References
- Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
- Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
- Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
- Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
- Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
- Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
- Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
- Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
- Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
- Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
- Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
- Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
