Summary
Dit manuscript beschrijft de detectie van sumoylation en ubiquitinering van kinetochoor eiwitten, Ndc10 en Ndc80, in de gist Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Post-translationele modificaties (PTM), zoals fosforylering, methylering, acetylering, ubiquitinatie en sumoylation, regelen de cellulaire functie van verschillende proteïnen. PTMs van kinetochore eiwitten die associëren met centromere DNA bemiddelen trouw chromosoom segregatie naar genoom stabiliteit te handhaven. Biochemische benaderingen zoals massaspectrometrie en Western blot-analyse worden meestal gebruikt voor de identificatie van PTMs. Hier wordt een eiwitzuivering werkwijze beschreven die de detectie van zowel sumoylation en ubiquitinering van het kinetochore eiwitten, Ndc10 en Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae toelaat. Een stam die uitdrukt polyhistidine-Flag-gelabeld Smt3 (HF-Smt3) en Myc-gelabeld Ndc10 of Ndc80 werd gebouwd en gebruikt voor onze studies. Voor detectie van sumoylation, we bedacht een protocol om affiniteit te zuiveren His-tag sumoylated eiwitten met behulp van nikkel kralen en gebruikt western blot analyse met anti-Myc antilichaam aan sumoylated Ndc10 een detecterennd Ndc80. Voor detectie van ubiquitinatie, ontwierpen we een protocol voor immunoprecipitatie van Myc-tagged eiwitten en gebruikt western blot-analyse met anti-Ub-antilichaam aan te tonen dat Ndc10 en Ndc80 worden ubiquitinated. Onze resultaten tonen dat epitoop-gelabeld eiwit van belang in de His-vlag hebben Smt3 stam vergemakkelijkt de detectie van meerdere PTMs. Toekomstige studies moeten toelaten benutting van deze techniek eiwit interacties die afhankelijk zijn van een specifieke PTM identificeren en te karakteriseren.
Introduction
Ubiquitination en sumoylation laat de vervoeging van ubiquitine en Kleine Ubiquitine-achtige modifier (SUMO; Smt3 in S. cerevisiae 1) tot een doelwit eiwit, respectievelijk. PTMs van kinetochore eiwitten invloed op hun cellulair niveau en eiwit-eiwit interacties tijdens de verschillende fasen van de celcyclus trouw chromosoom segregatie te garanderen. Zo zijn cellulaire niveaus van Cse4 / CENP-A en buitenste kinetochoor eiwit Dsn1 geregeld door ubiquitine gemedieerde proteolyse te zorgen genoomstabiliteit 2-5. Destabilisatie van onjuiste kinetochoor-microtubule bijlagen vereist de IPL1 / Aurora B kinase, die Dam1 en Ndc80 complexen die rechtstreeks interageren met microtubules 6-8 fosforyleert. Ondanks de identificatie van meer dan zeventig kinetochore eiwitten, zijn er weinig studies die de wijzigingen van deze eiwitten met PTM's, bijvoorbeeld ubiquitine en SUMO onderzoeken. Een belangrijke beperking is de mogelijkheid om de PTM bewarens tijdens de zuivering en het gebrek aan aangepaste antilichamen voor detectie van PTMs zoals sumoylation, fosforylering, methylering, en anderen. Karakterisering van sumoylated kinetochoor eiwitten Ndc10, Cep3, Bir1 en Ndc80 gebruikt een aangepaste antilichaam 9. Daarnaast is Ndc10 geïmpliceerd als een substraat voor ubiquitinering 10. Human Hec1 (Ndc80 in S. cerevisiae) wordt ook substraat voor ubiquitinering, gereguleerd door APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Daarom Ndc10 en Ndc80 zijn goede kandidaten voor de optimalisatie van het protocol bij zowel sumoylation en ubiquitinering te detecteren in S. cerevisiae.
Om de identificatie van sumoylation faciliteren, we geconstrueerd stammen die HF-Smt3 en Myc-gelabeld Ndc10 of Ndc80 uiten. Het gebruik van epitooplabels (HF: His6-vlag) minimaliseert de achtergrond door cross-reactiviteit die vaak wordt waargenomen bij polyklonaal serum opgewekt tegen een kandidaat eiwit. We bedachten een protocol affiniteitzuiveren HF-Smt3 conjugaten en vervolgens gebruikt commerciële anti-Flag en anti-Myc antilichamen om de aanwezigheid van sumolyated Ndc10 en Ndc80 in het gezuiverde preparaat Smt3 detecteren. Voor ubiquitination, we bedacht een aangepaste immunoprecipitatie protocol dat ubiquitinatie van de Myc-gelabelde kinetochoor eiwitten bewaart en uitgevoerd western blot analyse met commerciële anti-Ub antilichaam aan ubiquitinering van Ndc10 en Ndc80 detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Groei van gistcellen
- Inoculeer gistcellen in 30 ml YPD (tabel 1) in een kolf. Incubeer bij 30 ° C geïncubeerd onder schudden.
- Verdun de cellen tot een optische dichtheid van 0,2 bij 600 nm (OD 600 = 0,2) in 50 ml YPD en incubeer bij 30 ° C onder schudden.
- Groeien de cultuur een optische dichtheid van 1,0 bij 600 nm (OD 600 = 1,0).
- Centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 2.000 xg en de supernatant weggegooid.
- Resuspendeer de celpellet in 40 ml steriel water en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2000 xg om de cellen te wassen. Verwijder het supernatant en bewaar de celpellet bij -20 ° C.
2. Winning van Proteins
- Resuspendeer cellen in 0,5 ml ijskoude buffer guanidine (tabel 1) voor pull-down assay gebruik van Ni-NTA superflow korrels of buffer A (tabel 1) voor immunoprecipitatie. Blijf buizen op ijs te allen tijde.
- Transfer naar 2 ml schroefdop buis.
- Voeg hetzelfde volume van glazen kralen (Table of Materials).
- Bead-winnen van de cellen in een mini bead beater (Table of Materials) gedurende 2 min bij kamertemperatuur en plaats op ijs gedurende 2-3 minuten. Herhaal dit drie maal.
- Vortex op hoge snelheid bij 4 ° C gedurende 30-60 min. Controleer de cellen door visualisatie onder de microscoop dat de cellen zijn gelyseerd.
Opmerking: gelyseerde cellen worden weergegeven als donkere geesten en het gebrek aan een grens of gedefinieerde vorm. Optimaal ten minste 80% van de cellen worden gelyseerd. - Prik een gat in de bodem van de buis met behulp van een punaise en plaats in een verzameling 15 ml conische buis (schroefdop moet los).
- Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 min naar het lysaat te verzamelen.
- Breng het lysaat naar een microcentrifuge buis.
- Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C om de geëxtraheerde eiwitten te verzamelen.
- Meet de concentratie van de geëxtraheerde eiwitten met het eiwit ASSAy kit (Table of Materials) en normaliseren alle extracten dezelfde hoeveelheid eiwit. Breng het totale volume met geschikte buffer 1 ml.
Opmerking: Ongeveer 5 mg totaal eiwit wordt verkregen uit 50 OD 600 cellen. - Opslaan 50 pl (250 ug eiwit wanneer de totale proteïne geëxtraheerd uit stap 2,10 is 5 mg) als geheel celextract (WCE). Voeg 50 ul van 2 x Laemmli monsterbuffer (Tabel 1) en incubeer bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min. Belasting 10 pi van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse).
3. Zuivering van HF-Smt3 Conjugaten
- Het verkrijgen van de Ni-NTA superflow kralen (Table of Materials) die nodig zijn voor de experimenten (100 pi kralen per monster) door de lage snelheid te centrifugeren (800-1,500 xg) gedurende 1 min. Verwijder het supernatant.
- Was kralen 5x met 1 ml PBS (tabel of Materials): Omkeren top-over-onderkant totdat de kralen worden gesuspendeerd, het verzamelen van kralen door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant.
- Suspendeer kralen in 1 ml van guanidine buffer (Tabel 1) en aliquot ze in het aantal buizen overeenkomt met monsters te verwerken. Verzamel parels door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant. Meng de kralen goed door het omkeren van de top-over bodem.
Opmerking: Mix kralen goed door omkeren top-over bodem. - Voor elk monster, voeg 950 ul van de resterende WCE (uit stap 2,11: extractie van eiwitten) aan 100 ui Ni-NTA superflow beads.
- Incubeer op een schudapparaat bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur of 's nachts.
- Centrifugeer bij 800-1,500 xg gedurende 1 min bij 4 ° C.
- Spaar 50 ul als supernatant (SUP). Voeg 50 ul van 2 x Laemmli monsterbuffer en incuberen bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min. Belasting 10 pi van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analtion).
- Was parels eenmaal met 1 ml van guanidine buffer gedurende 5-10 minuten op een schudplatform.
- Was 5x kralen met 1 ml breken buffer (Tabel 1) gedurende 5-10 minuten op een schudplatform.
- Resuspendeer kralen in 90 pl 2 x Laemmli monsterbuffer.
- Voeg 10 ul van 1 M imidazool.
Opmerking: Imidazool helpt de His-gemerkt eiwit uit de Ni-NTA-parels dissociëren vanwege concurrerende wisselwerking tussen imidazool en de kralen. - Incubeer bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min.
- Vortex, centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 30 sec. Breng het supernatant naar een nieuwe buis.
- Load 10-20 ul van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse).
Noot: 10-20 pl overeen met 0,5-1,0 mg input als 5 mg WCE gebruikt.
4. Immunoprecipitatie van de Myc-tagged eiwitten kinetochoor
- Verkrijgen van anti-c-Myc agarose gel een affiniteittibody (Table of Materials) die nodig zijn voor de experimenten (25 ul van hars per monster) door de lage snelheid te centrifugeren (800-1,500 xg). Verwijder het supernatant.
- Was de hars 5x met 1 ml buffer A: Omkeren top-over-bottom totdat de hars wordt gesuspendeerd, het verzamelen van hars door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant.
- Suspendeer hars in 1 ml buffer A en aliquot ze in het aantal buizen overeenkomt met monsters te verwerken. Verzamel hars door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant.
Opmerking: Meng de hars goed door het omkeren van de top-over-bodem. - Voeg 950 pi van het resterende WCE (uit stap 2,11: extractie van eiwitten) tot 25 gl hars.
- Incubeer op een schudapparaat bij 4 ° C overnacht.
- Centrifugeer bij 800-1,500 xg gedurende 1 min bij 4 ° C.
- Spaar 50 ul als supernatant (SUP). Voeg 50 ul van 2 x Laemmli monsterbuffer en incuberen bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min. Ziead 10 ul van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse).
- Was de hars 5x met 1 ml buffer A: Omkeren top-over-bottom totdat de hars wordt gesuspendeerd, het verzamelen van hars door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de hars in 100 pl SUMEB monsterbuffer (Tabel 1).
Opmerking: SUMEB sample buffer bevat 8 M ureum en 1% SDS (sterke denaturerende voorwaarde). - Incubeer bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min.
- Vortex, centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 30 sec. Breng het supernatant naar een nieuwe buis.
- Load 10-20 ul van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse).
Noot: 10-20 pl overeen met 0,5-1,0 mg input als 5 mg WCE gebruikt.
5. Western-blotanalyse
- Laad de eiwitextracten op 4-12% Bis-Tris gels (Table of Materials) en perform elektroforese bij 120 V gedurende 90 min (Hardlopen buffer: Table of Materials).
- Breng de eiwitten van gel naar een nitrocellulosemembraan (Table of Materials) met een overbrenginrichting bij 30 V gedurende 90 min (transfer buffer: Table of Materials).
- Blokkeer het membraan in 5% melk / TBST 1x (Tabel 1) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Incubeer het membraan met primair antilichaam (Table of Materials) in 5% melk / TBST 1x overnacht bij 4 ° C. Voor primaire antilichamen gebruikt een verdunning van 1: 1000 (anti-Flag en anti-Ub-antilichamen) of 1: 5000 (anti-Myc-antilichaam).
- Was 3x membraan gedurende 10 minuten elk met 1x TBST.
- Incubeer het membraan met secundair antilichaam (Table of Materials) in 5% melk / TBST 1x 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Met een 1: 5000 verdunning van secundaire antilichamen.
- Was 3x membraan gedurende 10 minuten elk met 1x TBST.
- Incubeer membraan met ECL working oplossing (Table of Materials) gedurende 5 min.
- Expose het membraan naar blauw gevoelige X-Ray film (Table of Materials) en de ontwikkeling van het gebruik van een automatische ontwikkelaar (Table of Materials).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om sumoylation van kinetochore eiwitten Ndc80 en Ndc10 detecteren stammen met HF-Smt3 en Myc-gelabeld kinetochoor eiwitten (Ndc80 of Ndc10) werden geconstrueerd (Tabel 2), zoals eerder beschreven 9,12. HF-Smt3 conjugaten werden affiniteit gezuiverd onder toepassing van Ni-NTA korrels. Western blot analyse van gezuiverde HF-Smt3 met anti-Flag-antilichaam liet detectie van sumoylated vormen van SUMO substraten die in de controlestam zonder HF-Smt3 (Figuur 1A en 1B, linkerpaneel) afwezig waren. Zoals verwacht, werden meerdere vormen van SUMO substraten gedetecteerd in de HF-Smt3 stam. We vervolgens bepaald of Ndc80 en Ndc10 aanwezig in het gezuiverde HF-Smt3 conjugaat doende Western blot analyse met een anti-Myc antilichaam. Meerdere banden die waren hoger molecuulgewicht dan die van Ndc80 of Ndc10 werden duidelijk gedetecteerd (Figuur 1A en 1B, rechter paneel). Bovendien, meerdere banden van zowel Ndc80 en Ndc10in nocodazole behandelde cellen (figuur 1C en 1D) werden verminderd. Deze resultaten tonen dat eiwitzuivering en Western blotanalyse hier beschreven kan de detectie van sumoylation van Ndc80 en Ndc10, zoals eerder beschreven 9.
Om ubiquitinering van Ndc80 en Ndc10, detecteren Myc-tagged Ndc80 of Ndc10 werd immunogeprecipiteerd (IP) en Western blot analyse werd uitgevoerd met anti-Myc en anti-Ub-antilichamen (Figuur 2). Analyse van de volledige celextracten (WCE) en supernatant (SUP) bevestigde de expressie van Ndc80-Myc en Ndc10-Myc (Figuur 2A). De lager molecuulgewicht bands op de WCE kunnen afbraakproducten vertegenwoordigen. IP monsters onderzocht met anti-Myc toonde meerdere hoge gewicht bands moleculair, wat suggereert dat Ndc80 en Ndc10 bevatten PTMs. Een laddering patroon van IP monsters gehybridiseerd met anti-Ub-antilichaam toonde dat Ndc80 en Ndc10 worden geubiquitineerd (Figuur 2A, α-Ub). De laddering patroon van Ndc80 en Ndc10 werden versterkt door behandeling met proteasoomremmer (MG132) (Figuur 2B, α-Ub), verder te bevestigen dat deze bands vertegenwoordigen poly-ubiqutination. De representatieve resultaten tonen aan dat zowel Ndc80 en Ndc10 substraten zijn voor sumoylation en ubiquitinatie in S. cerevisiae en dat de beschreven werkwijzen voor eiwitzuivering zijn bruikbaar voor de detectie van PTMs zoals sumoylation en ubiquitinering. Volgens wij weten is dit het eerste rapport dat Ndc80 in S. cerevisiae is een substraat voor ubiquitinering, hoewel ubiquitine afhankelijke proteolyse van de humane homoloog Hec1 is eerder gepubliceerd 11.
Figuur 1: Zuivering van sumolyated substraten maakt de identificatie van kinetochoor eiwitten Ndc80 en Ndc10 als SUMO substraten Pr.oteins werden geëxtraheerd en HF-Smt3 conjugaten werden voorbereid en door western blot-analyse geanalyseerd na SDS-PAGE scheiding. (A en B) Ndc80 en Ndc10 worden sumoylated. Eiwitten werden geëxtraheerd uit logaritmisch groeiende cellen in YPD. Linker paneel: Totaal SUMO substraten werden gedetecteerd met een anti-Flag-antilichaam. Rechter paneel: Sumoylated Ndc80 of Ndc10 werd gedetecteerd in de HF-Smt3 conjugaten indien gesondeerd met anti-Myc-antilichaam. (C en D) sumoylation van Ndc80 en Ndc10 wordt nocodazole behandelde cellen verminderd. Logaritmisch groeiende cellen in YPD werden behandeld met DMSO (-) of DMSO + 20 ug / ml nocodazol (+) gedurende 2 uur bij 30 ° C. HF-Smt3 conjugaten werden geanalyseerd door Western blot analyse met anti-Myc-antilichaam. Isogene giststammen gebruikt zijn (A en C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (His-vlag-SMT3 Ndc80-Myc) en (B en D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (His-Flag-SMT3 Ndc10-Myc).
Figuur 2:. Ubiquitinering van kinetochore eiwitten Ndc80 en Ndc10 extractie van eiwitten en immunoprecipitatie werden uitgevoerd zoals beschreven in het protocol. (A) Ndc80 en Ndc10 worden ubiquitinated. Eiwitten werden geëxtraheerd uit logaritmisch groeiende cellen in YPD. Whole celextract (WCE), supernatant (SUP), en immunogeprecipiteerde (IP) fracties werden onderworpen aan SDS-PAGE. Western blots werden gebruikt voor Myc-gemerkte ubiquitine eiwitten en detectie met anti-Myc en anti-Ub-antilichamen, respectievelijk. (B) Ubiquitinering van Ndc80 en Ndc10 wordt versterkt in cellen behandeld met proteasoomremmer MG132. Logaritmisch groeiende cellen in YPD werden behandeld met DMSO (-) of DMSO + 50 uM MG132 (+) in aanwezigheid van 0,003% SDS gedurende 3 uur bij 30 ° C zoals eerder beschreven 13
| Oplossing | Componenten |
| YPD | 1% gistextract, 2% bacto-pepton, 2% glucose |
| Guanidine buffer | 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 6 M guanidine chloride, 0,5 M NaCI |
| Buffer A | 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,2% Triton X-100, 1 x proteaseremmers |
| Breaking buffer | 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 20% glycerol, 1 mM PMSF |
| SUMEB monsterbuffer | 1% SDS, 8 M ureum, 10 mM MOPS pH 6,8, 10 mM EDTA, 0,01% broomfenolblauw |
| 2x Laemmli Sample Buffer | 100 mM Tris-HClpH 6,8, 4% SDS, 20% glycerol, 0,2% broomfenolblauw (Voor gebruik: add b-mercaptoethanol (BME) tot een eindconcentratie van 200 mM) |
| 1x TBST | 137 mM natriumchloride, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% Tween-20 |
Tabel 1: Solutions.
| Tabel 2. Giststammen die in deze studie *. | |||
| Stammen | Ouder | Genotype | Verwijzing |
| BY4741 | MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 | Open Biosystems | |
| BY4742 | MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 | Open Biosystems | |
| YMB7278 | BY4741 / BY4742 | MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 | Deze studie |
| YPH1734 | MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3A200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 | Montpetit et al., 2006 | |
| YPH1800 | MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3A200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 | Montpetit et al., 2006 | |
| YMB7862 | YMB7278 / YPH1800 | MATa his3 leu2 ura3 trp 1 ade2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80-Myc :: His3MX6 | Deze studie |
| YMB7867 | YMB7278 / YPH1734 | MATa his3 leu2 ura3 trp 1 LYS2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 | Deze studie |
| * Alle giststammen zijn afgeleid van Saccharomyces cerevisiae S288C. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitoopaanhangsels zoals HA, Myc, vlag, GST en worden veel gebruikt voor biochemische analyse van eiwitten. Constructie van stammen met HF-Smt3 en Myc-tagged kinetochore eiwitten, zoals Ndc10 en Ndc80, vergemakkelijkt de detectie van PTMs zoals sumoylation en ubiquitinering. HF-Smt3 afbreken assay maakt de detectie van sumoylated kinetochore eiwitten, Ndc10 en Ndc80 (figuur 1). De affiniteit zuivering protocol en western blot analyse met behulp van anti-Flag antilichaam te stellen de specificiteit van de interactie tussen de HF-Smt3 en target eiwitten, zoals gemodificeerde eiwitten niet in de controle stam zonder HF-Smt3 werden gedetecteerd. Het gebruik van de Myc-tag op de eiwitsubstraten valideert de aanwezigheid van sumoylated Ndc10 en Ndc80 in de HF-Smt3 conjugaten. Bovendien sumoylation zowel Ndc10 en Ndc80 is in nocodazole behandelde cellen (figuur 1C en 1D) gereduceerd. Verminderde sumoylation van Ndc10 in reactie op nocodazole treatment, maar niet Ndc80, is eerder beschreven door Montpetit et al. 9. Dit kan te wijten zijn aan verschillen in experimentele protocol en het gebruik van een aangepaste anti-SUMO-antilichaam. Onze resultaten sumoylation van kinetochore substraten suggereren dat een vergelijkbaar protocol kan worden gebruikt om andere kandidaat SUMO substraten onderzocht.
Om ubiquitinatie detecteren, werden Myc-tagged kinetochore eiwitten eerst immuunprecipitatie en IP fracties werden gesondeerd met anti-Ub-antilichaam (Figuur 2). De laddering patroon van Ndc10 en Ndc80 verhoogd wanneer de cellen werden behandeld met MG132 tot proteasoomfunctie (figuur 2B) remt, wat aangeeft dat deze eiwitten substraten van het proteasoom. Het IP fracties niet sumoylation van Ndc10 of Ndc80 detecteren in Western blot-analyse met anti-Flag of anti-Smt3 antilichaam (gegevens niet getoond). Dit kan als gevolg van technische redenen zoals niveaus van sumoylated substraat in de IP fractie of de interference van de epitoop-merkers. Verdere optimalisatie van het IP protocol zoals zoutconcentratie en Western blotting omstandigheden zou de detectie van meerdere PTMs van een eiwit van belang te vergemakkelijken. Momenteel wordt sumoylation best gedetecteerd door de HF-Smt3 afbreken assay gevolgd door western blots van de kandidaat SUMO substraten (figuur 1).
Verscheidene gegevens invloed op de efficiëntie van eiwitzuivering en de mogelijkheid om de PTMs detecteren. Ten eerste moeten alle buizen worden op ijs gehouden tot de proteasen, behalve zoals aangegeven remmen. Ten tweede, een 1: 1 verhouding celsuspensie glasparels is cruciaal om de cellen te verstoren door de bead beater en / of vortexer. Cellysis moeten worden gecontroleerd door onderzoek van de cellen onder de microscoop. Ten derde is het zeer belangrijk om een geklaarde lysaat te bereiden op de pulldown assay of IP. Korte of lage snelheid centrifugatie kan bijdragen aan vervuiling van celresten in het lysaat en dit beïnvloedt het vermogen Detect de PTMs. Tenslotte krachtig schudden van de bolletjes met een groot volume duidelijke lysaat (ongeveer 1 ml) in een 1,5 ml microcentrifuge buis zorgt ervoor dat de korrels volledig worden gedurende het rolmenu assay of IPs. Samengevat, eiwitzuivering en detectie technieken, zoals die hier beschreven leveren belangrijke mechanistische inzichten in hoe de PTM van kinetochoor eiwitten invloed op hun structuur en assemblage voor trouwe chromosoom segregatie 14, 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm diameter |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1,000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5,000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5,000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1,000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5,000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5,000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
References
- Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
- Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
- Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
- Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
- Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
- Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
- Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
- Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
- Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
- Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
- Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
- Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
