Summary
تصف هذه المخطوطة الكشف عن sumoylation وubiquitination من البروتينات الحيز الحركي، Ndc10 وNdc80، في مهدها خميرة الخباز.
Abstract
التعديلات بعد متعدية (PTMs)، مثل الفسفرة، مثيلة، أستلة، ubiquitination، وsumoylation، تنظيم وظيفة الخلوية من العديد من البروتينات. PTMs من البروتينات الحيز الحركي التي تربط مع DNA القسيم المركزي توسط المؤمنين العزل الصبغي للحفاظ على استقرار الجينوم. النهج البيوكيميائية مثل مطياف الكتلة وتحليل لطخة الغربي هي الأكثر شيوعا لتحديد PTMs. هنا، يتم وصف طريقة تنقية البروتين الذي يسمح للكشف عن كل من sumoylation وubiquitination من البروتينات الحيز الحركي، Ndc10 وNdc80، في خميرة الخباز. سلالة التي تعبر عن polyhistidine العلم الموسومة Smt3 (HF-Smt3) وMyc على الموسومة Ndc10 أو شيد Ndc80 وتستخدم لدراساتنا. للكشف عن sumoylation أوجدنا بروتوكول لتقارب تنقية صاحب الموسومة البروتينات sumoylated باستخدام الخرز النيكل ويستخدم تحليل لطخة الغربية مع مكافحة Myc على الأجسام المضادة للكشف عن sumoylated Ndc10 لالثاني Ndc80. للكشف عن ubiquitination، ونحن وضعت بروتوكولا للمناعي من البروتينات Myc على الموسومة ويستخدم تحليل لطخة الغربية مع مكافحة UB الأجسام المضادة لإظهار أن Ndc10 وNdc80 وubiquitinated. نتائجنا تظهر ان حاتمة الموسومة البروتين من الفائدة في صاحب العلم الموسومة سلالة Smt3 يسهل الكشف عن PTMs متعددة. ينبغي أن يسمح الدراسات المستقبلية استغلال هذه التقنية لتحديد وتوصيف التفاعلات البروتينية التي تعتمد على PTM معين.
Introduction
Ubiquitination وsumoylation السماح للتصريف بتحول والصغيرة اليوبيكويتين مثل معدل (SUMO؛ Smt3 في S. خميرة 1) إلى بروتين الهدف، على التوالي. PTMs من البروتينات الحيز الحركي تؤثر على مستويات الخلوية وتفاعلات البروتين البروتين خلال مختلف مراحل دورة الخلية لضمان المؤمنين كروموسوم العزل. على سبيل المثال، يتم تنظيم مستويات الخلايا من Cse4 / CENP-A وبروتين الحيز الحركي الخارجي Dsn1 التي كتبها بوساطة بتحول والتحلل البروتيني لضمان الاستقرار الجينوم 2-5. زعزعة استقرار إرفاق ملفات-الحيز الحركي أنيبيب غير صحيحة يتطلب B كيناز Ipl1 / أورورا، التي phosphorylates Dam1 وNdc80 المجمعات التي تتفاعل مباشرة مع ميكروتثبول 6-8. على الرغم من تحديد أكثر من سبعين البروتينات الحيز الحركي، وهناك عدد قليل جدا من الدراسات إلى أن التحقيق في إدخال تعديلات على هذه البروتينات مع PTMs، على سبيل المثال، بتحول وSUMO. وجود قيود الرئيسي هو القدرة على الحفاظ على PTMالصورة خلال تنقية وندرة الأجسام المضادة مخصصة للكشف عن PTMs مثل sumoylation، الفسفرة، مثيلة، وغيرها. توصيف البروتينات الحيز الحركي sumoylated Ndc10، Cep3، تستخدم Bir1، وNdc80 الأجسام المضادة مخصصة 9. بالإضافة إلى ذلك، تم Ndc10 المتورطين باعتبارها الركيزة لubiquitination 10. Hec1 الإنسان (Ndc80 في S. الخباز) هو الركيزة أيضا لubiquitination، التي تنظمها APC / C-hCdh1 E3 يغاز 11. ولذلك، Ndc10 وNdc80 هي مرشحة جيدة لتعظيم الاستفادة من بروتوكول للكشف عن كل من sumoylation وubiquitination في S. الخباز.
لتسهيل التعرف على sumoylation، اقمنا السلالات التي تعبر عن HF-Smt3 وMyc على الموسومة Ndc10 أو Ndc80. استخدام علامات حاتمة (HF: His6 العلم) يقلل الخلفية بسبب عبر التفاعل الذي كثيرا ما لوحظ في المصل بولكلونل أثيرت ضد بروتين مرشح. نحن وضعت بروتوكولا لتقاربتنقية تقارن HF-Smt3 ثم استخدام التجاري المضادة للعلم ومعاداة Myc على الأجسام المضادة للكشف عن وجود sumolyated Ndc10 وNdc80 في إعداد Smt3 تنقيته. لubiquitination أوجدنا بروتوكول مناعي تعديل يحفظ ubiquitination من البروتينات Myc على الحيز الحركي الموسومة وإجراء تحليل لطخة الغربية مع التجاري مكافحة UB الأجسام المضادة للكشف عن ubiquitination من Ndc10 وNdc80.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نمو خلايا الخميرة
- تطعيم خلايا الخميرة في 30 مل من YPD (الجدول 1) في قارورة صغيرة. احتضان عند 30 درجة مئوية خلال الليل مع اهتزاز.
- تمييع الخلايا إلى كثافة ضوئية من 0.2 في 600 نانومتر (OD 600 = 0.2) في 50 مل من YPD واحتضان عند 30 درجة مئوية مع الهز.
- تنمو ثقافة إلى كثافة ضوئية من 1.0 في 600 نانومتر (OD 600 = 1.0).
- خلايا جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2000 x ج وتجاهل طاف.
- resuspend الكرية خلية في 40 مل ماء معقم وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2000 x ج لغسل الخلايا. تجاهل طاف وتخزين بيليه خلية في -20 ° C.
2. استخراج البروتينات
- Resuspend الخلايا في 0.5 مل من الجليد الباردة غوانيدين العازلة (الجدول 1) لفحص المنسدلة باستخدام الخرز superflow ني NTA أو العازلة A (الجدول 1) لمناعي. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات.
- نقل إلى 2 مترل سقف المسمار الأنبوب.
- إضافة نفس الحجم من الخرز الزجاجي (جدول المواد).
- حبة تغلب على الخلايا في حبة الخافق صغيرة (جدول المواد) لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم ضع على الجليد لمدة 2-3 دقيقة. كرر ذلك ثلاث مرات.
- دوامة على سرعة عالية عند 4 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة. تحقق الخلايا التي تصور تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا هي lysed.
ملاحظة: الخلايا هي lysed ستظهر أشباح الظلام كما وتفتقر إلى الحدود أو شكل محدد. على النحو الأمثل ينبغي هي lysed لا يقل عن 80٪ من الخلايا. - ثقب حفرة في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام دبوس دفعة وضعها في مجموعة (يجب أن يكون سقف المسمار فضفاضة) 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع المحللة.
- نقل المحللة إلى أنبوب الطرد المركزي الجزئي.
- الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية لجمع البروتينات المستخرجة.
- قياس تركيز البروتينات المستخرجة باستخدام أسا البروتينذ مجموعة (جدول المواد) وتطبيع كل مقتطفات لتحتوي على نفس كمية البروتين. جلب الحجم الإجمالي إلى 1 مل مع العازلة المناسبة.
ملاحظة: يتم الحصول على حوالي 5 ملغ من البروتين الكلي من 50 OD 600 الخلايا. - وفر 50 ميكرولتر (250 ميكروغرام من البروتين إذا كان البروتين الكلي المستخرجة من الخطوة 2.10 هو 5 ملغ)، واستخراج خلية كاملة (WCE). إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة (الجدول 1)، واحتضان عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 3-5 دقيقة. تحميل 10 ميكرولتر من كل عينة في جل SDS-PAGE لتحليل البقعة الغربية (القسم 5: تحليل لطخة غربية).
3. تنقية HF-Smt3 تقارن
- الحصول على حبات superflow ني NTA (جدول المواد) اللازمة للتجارب (100 ميكرولتر من الخرز لكل عينة) من خلال انخفاض سرعة الطرد المركزي (800-1،500 x ج) لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف.
- تغسل حبات 5X مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (جدول المواد): المقلوب أعلى التغلبأسفل حتى يتم معلق الخرز، وجمع حبات بواسطة الطرد المركزي بسرعة منخفضة، وإزالة طاف.
- تعليق الخرز في 1 مل من العازلة غوانيدين (الجدول 1) وقسامة لهم في عدد من أنابيب الموافق عينات لتتم معالجتها. جمع حبات بواسطة الطرد المركزي بسرعة منخفضة، وإزالة طاف. مزيج من الخرز بشكل جيد من قبل قلب أعلى الإفراط في القاع.
ملاحظة: مزيج الخرز بشكل جيد من قبل قلب كبير على القاع. - لكل عينة، إضافة 950 ميكرولتر من WCE المتبقية (من الخطوة 2.11: استخراج البروتينات) إلى 100 ميكرولتر من الخرز superflow ني NTA.
- احتضان على منصة هزاز عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة أو طوال الليل.
- أجهزة الطرد المركزي في 800-1،500 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- وفر 50 ميكرولتر كما طاف (SUP). إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة واحتضان عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 3-5 دقيقة. تحميل 10 ميكرولتر من كل عينة في جل SDS-PAGE لتحليل البقعة الغربية (القسم 5: الشرج لطخة غربيةيسيس).
- تغسل حبات مرة واحدة مع 1 مل من العازلة غوانيدين لمدة 5-10 دقيقة على منصة هزاز.
- تغسل حبات 5X مع 1 مل من كسر العازلة (الجدول 1) لمدة 5-10 دقيقة على منصة هزاز.
- الخرز resuspend في 90 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة.
- إضافة 10 ميكرولتر من 1 M إميدازول.
ملاحظة: إيميدازول يساعد على فصل البروتين صاحب الموسومة من الخرز ني NTA بسبب التنافس التفاعل بين إميدازول والخرز. - احتضان عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 3-5 دقيقة.
- الدوامة، ثم الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 30 ثانية. طاف لنقل أنبوب جديد.
- الحمل 10-20 ميكرولتر من كل عينة في جل SDS-PAGE لتحليل البقعة الغربية (القسم 5: تحليل لطخة غربية).
ملاحظة: 10-20 ميكرولتر يتوافق مع 0،5-1،0 ملغ من المدخلات، إذا تم استخدام 5 ملغ من WCE.
4. مناعي من Myc على الموسومة الحيز الحركي البروتينات
- الحصول على مكافحة ج. Myc على تقارب الاغاروز هلام لtibody (جدول المواد) الضروري لتجارب (25 ميكرولتر من الراتنج لكل عينة) من خلال انخفاض سرعة الطرد المركزي (800-1،500 x ج). إزالة طاف.
- غسل 5X الراتنج مع 1 مل من العازلة A: عكس كبار الإفراط في أسفل حتى يتم معلق الراتنج، وجمع الراتنج التي كتبها انخفاض سرعة الطرد المركزي، وإزالة طاف.
- تعليق الراتنج في 1 مل من العازلة ألف وقسامة لهم في عدد من أنابيب الموافق عينات لتتم معالجتها. جمع الراتنج التي كتبها انخفاض سرعة الطرد المركزي، وإزالة طاف.
ملاحظة: مزيج من الراتنج بشكل جيد من قبل قلب كبير الإفراط في القاع. - إضافة 950 ميكرولتر من WCE المتبقية (من الخطوة 2.11: استخراج البروتينات) إلى 25 ميكرولتر من الراتنج.
- احتضان على منصة هزاز عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- أجهزة الطرد المركزي في 800-1،500 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- وفر 50 ميكرولتر كما طاف (SUP). إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة واحتضان عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 3-5 دقيقة. لوإعلان 10 ميكرولتر من كل عينة في جل SDS-PAGE لتحليل البقعة الغربية (القسم 5: تحليل لطخة غربية).
- غسل 5X الراتنج مع 1 مل من العازلة A: عكس كبار الإفراط في أسفل حتى يتم معلق الراتنج، وجمع الراتنج التي كتبها انخفاض سرعة الطرد المركزي، وإزالة طاف.
- Resuspend والراتنج في 100 ميكرولتر من عينة العازلة SUMEB (الجدول 1).
ملاحظة: يحتوي عينة العازلة SUMEB 8 M اليوريا و 1٪ SDS (حالة تغيير طبيعة قوية). - احتضان عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 3-5 دقيقة.
- الدوامة، ثم الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 30 ثانية. طاف لنقل أنبوب جديد.
- الحمل 10-20 ميكرولتر من كل عينة في جل SDS-PAGE لتحليل البقعة الغربية (القسم 5: تحليل لطخة غربية).
ملاحظة: 10-20 ميكرولتر يتوافق مع 0،5-1،0 ملغ من المدخلات، إذا تم استخدام 5 ملغ من WCE.
5. ويسترن تحليل وصمة عار
- تحميل مقتطفات من البروتين على 4-12٪ مكرر تريس المواد الهلامية (جدول المواد) والأداء الإقتصادي الأداءاسندت الكهربائي في 120 V لمدة 90 دقيقة (العازلة على التوالي: جدول المواد).
- نقل البروتينات من الهلام إلى غشاء النيتروسليلوز (جدول المواد) باستخدام جهاز نقل في 30 V لمدة 90 دقيقة (العازلة نقل: جدول المواد).
- منع الغشاء في الحليب 5٪ / 1X TBST (TABLE1) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية (جدول المواد) في الحليب 5٪ / 1X TBST بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. عن الأجسام المضادة الأولية، استخدم التخفيف من 1: 1000 (المضادة للعلم ومكافحة UB الأجسام المضادة) أو 1: 5000 (مكافحة Myc على الضد).
- غسل 3X غشاء لمدة 10 دقيقة لكل منهما مع 1X TBST.
- احتضان الغشاء مع الضد الثانوية (جدول المواد) في 5٪ حليب / 1X TBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استخدام 1: 5000 التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية.
- غسل 3X غشاء لمدة 10 دقيقة لكل منهما مع 1X TBST.
- احتضان الغشاء مع ECL workiنانوغرام الحل (جدول المواد) لمدة 5 دقائق.
- تعرض الغشاء إلى الأزرق حساسة فيلم X-راي (جدول المواد) وتطوير استخدام مطور التلقائي (جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للكشف عن sumoylation من البروتينات الحيز الحركي Ndc80 وNdc10، سلالات مع HF-Smt3 والبروتينات Myc على الحيز الحركي الموسومة (Ndc80 أو Ndc10) شيدت (الجدول 2)، كما هو موضح سابقا 9،12. تم تنقيته تقارن HF-Smt3 تقارب باستخدام الخرز ني NTA. تحليل لطخة الغربي من تنقية HF-Smt3 مع مضاد للعلم الضد يسمح الكشف عن أشكال sumoylated من ركائز SUMO التي كانت غائبة في سلالة تحكم دون HF-Smt3 (الشكل 1A و 1B، اللوحة اليسرى). كما هو متوقع، تم الكشف عن أشكال متعددة من ركائز SUMO في سلالة HF-Smt3. نحن مصممون المقبل إذا Ndc80 وNdc10 موجودة في المطهرون المترافقة HF-Smt3 عن طريق القيام تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. العصابات المتعددة التي كانت ذات الوزن الجزئي العالي من ذلك من Ndc80 أو Ndc10 تم الكشف بوضوح (الشكل 1A و 1B، اللوحة اليمنى). وعلاوة على ذلك، والعصابات المتعددة لكل من Ndc80 وNdc10خفضت في الخلايا نوكودازول المعالجة (الشكل 1C و1D). وتشير هذه النتائج إلى أن تنقية البروتين وتحليل لطخة غربية وصفت هنا تسمح للكشف عن sumoylation من Ndc80 وNdc10، كما هو موضح سابقا 9.
للكشف عن ubiquitination من Ndc80 وNdc10، Myc على الموسومة كان immunoprecipitated Ndc80 أو Ndc10 (IP) وأجري تحليل لطخة الغربية مع مكافحة Myc على ومكافحة UB الأجسام المضادة (الشكل 2). وأكد تحليل مقتطفات خلية كاملة (WCE) وطاف (SUP) التعبير عن Ndc80. Myc على وNdc10. Myc على (الشكل 2A). انخفاض العصابات الوزن الجزيئي على WCE قد تمثل منتجات التحلل. وأظهرت عينات IP بحث مع مكافحة Myc على عدة نطاقات عالية الوزن الجزيئي، مما يوحي بأن Ndc80 وNdc10 احتواء PTMs. وأظهر نمط laddering العينات IP بحث مع مكافحة UB الأجسام المضادة التي Ndc80 وNdc10 وubiquitinated (الشكل 2A، α-UB). تم تحسين نمط laddering من Ndc80 وNdc10 عن طريق العلاج مع proteasome والمانع (MG132) (الشكل 2B، α-UB)، مما يؤكد أن هذه العصابات تمثل بولي ubiqutination. نتائج تمثيلية تكشف أن كلا Ndc80 وNdc10 هم ركائز للsumoylation وubiquitination في S. الخباز وأن أساليب تنقية البروتين وصفه مفيدة للكشف عن PTMs مثل sumoylation وubiquitination. وفقا لمعرفتنا، وهذا هو التقرير الأول الذي Ndc80 في S. الخباز هو الركيزة لubiquitination، على الرغم من بتحول بوساطة التحلل البروتيني من homolog الإنسان Hec1 وقد نشرت سابقا 11.
الشكل 1: تنقية من ركائز sumolyated يسمح تحديد البروتينات الحيز الحركي Ndc80 وNdc10 بمثابة ركائز SUMO العلاقات العامة.تم استخراج oteins وأعدت تقارن HF-Smt3 وتحليلها عن طريق تحليل لطخة غربية بعد الانفصال SDS-PAGE. وsumoylated (A و B) Ndc80 وNdc10. تم استخراج البروتينات من خلايا المتزايد لوغاريتمي في YPD. غادر لوحة: تم الكشف عن مجموع ركائز SUMO مع الأجسام المضادة لمكافحة العلم. اللوحة اليمنى: تم الكشف Sumoylated Ndc80 أو Ndc10 في تقارن HF-Smt3 عندما بحث مع الأضداد المضادة. Myc على. يتم تخفيض (C و D) Sumoylation من Ndc80 وNdc10 في الخلايا المعالجة نوكودازول. غاريثمي عولج الخلايا نموا في YPD مع DMSO (-) أو DMSO + 20 ميكروغرام / مل نوكودازول (+) لمدة 2 ساعة على 30 درجة مئوية. وقد تم تحليل تقارن HF-Smt3 عن طريق تحليل لطخة غربية استخدام الألغام المضادة. Myc على الأجسام المضادة. سلالات الخميرة إسوي المستخدمة هي (A و C) YPH1800 (Ndc80. Myc على)، YMB7862 (صاحب العلم-SMT3 Ndc80. Myc على) و (B و D) YPH1734 (Ndc10. Myc على)، YMB7867 (صاحب-FLAG-SMT3 Ndc10. Myc على).
أجريت Ubiquitination من البروتينات الحيز الحركي Ndc80 وNdc10 استخراج البروتين ومناعي كما هو موضح في البروتوكول: الرقم 2. وubiquitinated (A) Ndc80 وNdc10. تم استخراج البروتينات من خلايا المتزايد لوغاريتمي في YPD. تعرض استخراج كامل الخلية (WCE)، طاف (SUP)، وimmunoprecipitated (IP) الكسور إلى SDS-PAGE. استخدمت البقع الغربية للكشف عن البروتينات MYC الموسومة وubiquitinated مع مكافحة Myc على والأجسام المضادة لمكافحة UB، على التوالي. ومما يعزز (B) Ubiquitination من Ndc80 وNdc10 في الخلايا تعامل مع proteasome والمانع MG132. تم علاج الخلايا المتنامية لوغاريتمي في YPD مع DMSO (-) أو DMSO + 50 ميكرومتر MG132 (+) في وجود 0.003٪ من SDS لمدة 3 ساعة على 30 درجة مئوية، كما هو موضح سابقا 13
| حل | مكونات |
| YPD | 1٪ خلاصة الخميرة، 2٪ bacto-ببتون، 2٪ الجلوكوز |
| عازلة غوانيدين | 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 6 M غوانيدين كلوريد، كلوريد الصوديوم 0.5 M |
| عازلة A | 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 0.2٪ تريتون X-100، 1X مثبطات الأنزيم البروتيني |
| عازلة العاجلة | 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 20٪ الجلسرين، 1 ملم PMSF |
| SUMEB عينة العازلة | 1٪ SDS، 8 M اليوريا، 10 ملي اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 6.8، 10 ملي EDTA، 0.01٪ برموفينول الأزرق |
| 2X Laemmli عينة العازلة | 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريكالرقم الهيدروجيني 6.8، 4٪ SDS، 20٪ الجلسرين، 0.2٪ برموفينول الأزرق (قبل الاستخدام: إضافة ب المركابتويثانول (BME) إلى التركيز النهائي من 200 ملي) |
| 1X TBST | 137 ملي كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 0.1٪ توين-20 |
الجدول 1: حلول.
| الجدول 2. سلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة *. | |||
| سلالات | أصل | راثى | إشارة |
| BY4741 | ماتا his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 | فتح النظم البيولوجية | |
| BY4742 | ماتا his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 | فتح النظم البيولوجية | |
| YMB7278 | BY4741 / BY4742 | ماتا his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 اورa3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 | هذه الدراسة |
| YPH1734 | ماتا ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 | Montpetit وآخرون، 2006 | |
| YPH1800 | ماتا ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 | Montpetit وآخرون، 2006 | |
| YMB7862 | YMB7278 / YPH1800 | ماتا HIS3 leu2 ura3 ade2 trp1 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80. Myc على :: His3MX6 | هذه الدراسة |
| YMB7867 | YMB7278 / YPH1734 | ماتا HIS3 leu2 ura3 trp1 lys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10. Myc على :: kanMX6 | هذه الدراسة |
| * تستمد جميع سلالات الخميرة من خميرة الخباز S288C. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتستخدم على نطاق واسع علامات حاتمة مثل HA، Myc على، العلم، وGST لتحليل الكيمياء الحيوية للبروتينات. بناء سلالات مع HF-Smt3 والبروتينات Myc على الحيز الحركي الموسومة، مثل Ndc10 وNdc80، ويسهل الكشف عن PTMs مثل sumoylation وubiquitination. HF-Smt3 هدم مقايسة يسمح للكشف عن البروتينات الحيز الحركي sumoylated، Ndc10 وNdc80 (الشكل 1). بروتوكول تنقية تقارب وتحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة ضد العلم تنشئ خصوصية التفاعل بين HF-Smt3 والبروتينات المستهدفة، والبروتينات المعدلة لم يتم الكشف في سلالة تحكم دون HF-Smt3. استخدام العلامة Myc على على ركائز البروتين يؤكد وجود sumoylated Ndc10 وNdc80 في تقارن HF-Smt3. وعلاوة على ذلك، تم تخفيض sumoylation كل Ndc10 وNdc80 في الخلايا نوكودازول المعالجة (الشكل 1C و1D). انخفضت sumoylation من Ndc10 ردا على المعامله نوكودازولر، ولكن ليس Ndc80، أفيد سابقا من قبل Montpetit وآخرون. 9. قد يكون هذا بسبب الاختلافات في البروتوكول التجريبي واستخدام مخصص لمكافحة SUMO الأجسام المضادة. نتائجنا لsumoylation من ركائز الحيز الحركي تشير إلى أن بروتوكول مماثل يمكن استخدامها لتحقيق ركائز أخرى SUMO مرشح.
للكشف عن ubiquitination، وimmunoprecipitated أولا البروتينات Myc على الحيز الحركي الموسومة وتم بحث الكسور IP مع مكافحة UB الأضداد (الشكل 2). وقد ارتفع نمط laddering من Ndc10 وNdc80 عندما تم علاج الخلايا مع MG132 إلى تثبيط وظيفة proteasome و(الشكل 2B)، مشيرا إلى أن هذه البروتينات هي ركائز للproteasome و. فشلت الكسور IP للكشف عن sumoylation من Ndc10 أو Ndc80 في تحليل لطخة الغربية مع المضادة للعلم أو لمكافحة Smt3 الأضداد (لا تظهر البيانات). قد يكون هذا يرجع إلى أسباب فنية مثل مستويات الركيزة sumoylated في جزء IP أو interferencالبريد من علامات حاتمة. مزيد من التحسين لبروتوكول IP مثل تركيز الأملاح والشروط النشاف الغربية من شأنه أن يسهل الكشف عن PTMs متعددة من أي بروتين من الفائدة. في الوقت الحاضر، هو أفضل الكشف عن sumoylation من قبل HF-Smt3 هدم فحص تليها البقع الغربية من ركائز SUMO مرشح (الشكل 1).
تفاصيل عديدة تؤثر على كفاءة تنقية البروتين والقدرة على الكشف عن PTMs. أولا، يجب أن تبقى جميع الأنابيب على الجليد لتحول دون البروتياز باستثناء ما هو محدد. ثانيا، نسبة 1: 1 من خلية إلى تعليق الخرز الزجاجي أمر بالغ الأهمية لتعطيل الخلايا التي الخافق حبة و / أو vortexer. ينبغي رصد تحلل الخلية عن طريق الفحص من الخلايا تحت المجهر. ثالثا، من المهم جدا لإعداد المحللة أوضح للالمنسدلة فحص أو IP. القصير أو انخفاض سرعة الطرد المركزي يمكن أن تسهم في التلوث من حطام خلية في المحللة وهذا يؤثر على القدرة على DETEط م وPTMs. أخيرا، اهتزاز قوي من الخرز مع كمية كبيرة من المحللة واضح (حوالي 1 مل) في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل الدقيقة يضمن الخرز تعلق تماما لهدم مقايسة أو الشرطة العراقية. باختصار، تقنيات تنقية البروتين والكشف عن مثل تلك التي وصفها هنا توفر رؤى الآلية مهمة حول كيفية PTM من البروتينات الحيز الحركي تؤثر على هيكلها والتجمع من أجل كروموسوم المؤمنين الفصل 14 و 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm diameter |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1,000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5,000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5,000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1,000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5,000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5,000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
References
- Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
- Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
- Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
- Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
- Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
- Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
- Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
- Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
- Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
- Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
- Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
- Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
