Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Proteinoprensning Teknik der tillader detektering af Sumoylation og Ubiquitinering af Spirende Gær Kinetochore Proteiner Ndc10 og Ndc80

doi: 10.3791/52482 Published: May 3, 2015

Summary

Dette manuskript beskriver påvisning af sumoylation og ubiquitinering af kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80, i spirende gæren Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Post-translationelle modifikationer (PTMS), såsom phosphorylering, methylering, acetylering, ubiquitinering, og sumoylation, regulere den cellulære funktion af mange proteiner. PTMS af kinetochore proteiner, der associerer med centromere DNA mediere trofast kromosomsegregering at opretholde genom stabilitet. Biokemiske metoder såsom massespektrometri og western blot analyse er mest almindeligt anvendt til identifikation af PTMS. Her er en proteinoprensning fremgangsmåde beskrevet som tillader påvisningen af både sumoylation og ubiquitinering af kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80, i Saccharomyces cerevisiae. En stamme, der udtrykker polyhistidin-Flag-tagget Smt3 (HF-Smt3) og Myc-mærkede Ndc10 eller Ndc80 blev konstrueret og anvendes til vores studier. Til påvisning af sumoylation, vi udtænkt en protokol til affinitetsoprense His-mærket sumoylated proteiner ved hjælp af nikkel perler og brugte western blot analyse med anti-Myc-antistof til at detektere sumoylated Ndc10 ennd Ndc80. Til påvisning af ubiquitinering, vi udtænkt en protokol for immunopræcipitation af Myc-mærkede proteiner og brugte western blot analyse med anti-Ub antistof at vise, at Ndc10 og Ndc80 er ubiquitineret. Vore resultater viser, at epitop-tagget protein af interesse i His-Flag tagged Smt3 stamme letter påvisning af flere PTMS. Fremtidige undersøgelser bør give udnytte denne teknik til at identificere og karakterisere protein interaktioner, der er afhængige af en bestemt PTM.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ubiquitinering og sumoylation tillader konjugation af ubiquitin og Lille Ubiquitin-lignende modifier (SUMO; Smt3 i S. cerevisiae 1) til et målprotein, hhv. PTMS af kinetochore proteiner påvirker deres cellulære niveauer og protein-protein interaktioner under forskellige cellecyklus faser for at sikre trofaste kromosom adskillelse. For eksempel er cellulære niveauer af Cse4 / CENP-A og ydre kinetochore protein Dsn1 reguleret af ubiquitinmedieret proteolyse for at sikre genomstabilitet 2-5. Destabilisering af ukorrekte kinetochore-mikrotubulus vedhæftninger kræver IPL1 / Aurora B kinase, som phosphorylerer Dam1 og Ndc80 komplekser, direkte interagerer med mikrotubuli 6-8. På trods af den identifikation af over halvfjerds kinetochore proteiner, der er meget få undersøgelser, der undersøger de ændringer af disse proteiner med PTMS fx ubiquitin og SUMO. En væsentlig begrænsning er evnen til at bevare PTMs under oprensning og knapheden på brugerdefinerede antistoffer til påvisning af PTMS såsom sumoylation, phosphorylering, methylering, og andre. Karakterisering af sumoylated kinetochore proteiner Ndc10, Cep3, Bir1 og Ndc80 udnyttede en brugerdefineret antistof 9. Derudover har Ndc10 været inddraget som et substrat for ubiquitinering 10. Menneskelig Hec1 (Ndc80 i S. cerevisiae) er også substrat for ubiquitinering, reguleret af APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Derfor Ndc10 og Ndc80 er gode kandidater til optimering af protokollen til at afsløre både sumoylation og ubiquitinering i S. cerevisiae.

For at lette identifikationen af ​​sumoylation, vi konstruerede stammer, der udtrykker HF-Smt3 og Myc-mærkede Ndc10 eller Ndc80. Anvendelsen af ​​epitopmærker (HF: His6-Flag) minimerer baggrunden på grund af krydsreaktivitet, der ofte observeres i polyklonalt serum rejst mod en kandidat-protein. Vi udtænkt en protokol til affinitetoprense HF-Smt3 konjugater og derefter anvendes kommercielle anti-Flag og anti-Myc-antistoffer til påvisning af tilstedeværelsen af ​​sumolyated Ndc10 og Ndc80 i oprenset Smt3 præparatet. For ubiquitinering, vi udtænkt en modificeret immunopræcipitering protokol, bevarer ubiquitinering af Myc-mærkede kinetochore proteiner og udførte western blot analyse med kommercielle anti-Ub antistof til at detektere ubiquitinering af Ndc10 og Ndc80.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Vækst af gærceller

  1. Inokulering gærceller i 30 ml YPD (tabel 1) i en lille kolbe. Der inkuberes ved 30 ° C natten over under omrystning.
  2. Fortynd cellerne til en optisk densitet på 0,2 ved 600 nm (OD600 = 0,2) i 50 ml YPD og inkuberes ved 30 ° C under omrystning.
  3. Vokse kulturen til en optisk densitet på 1,0 ved 600 nm (OD600 = 1,0).
  4. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 2.000 xg og kassere supernatanten.
  5. Resuspender cellepelleten i 40 ml sterilt vand og centrifugeres i 5 minutter ved 2.000 xg for at vaske cellerne. Supernatanten fjernes, og opbevar cellepelleten ved -20 ° C.

2. Ekstraktion af proteiner

  1. Resuspender celler i 0,5 ml iskold guanidinbuffer (tabel 1) for pull-down assay brug af Ni-NTA Superflow perler eller puffer A (tabel 1) for immunofældning. Holde rørene på is hele tiden.
  2. Overførsel til 2 ml skruelåg rør.
  3. Tilsæt samme mængde glasperler (Table of Materials).
  4. Bead-slå cellerne i en mini perle beater (tabel of Materials) i 2 minutter ved stuetemperatur, og derefter placere på is i 2-3 min. Gentag dette tre gange.
  5. Vortex på høj hastighed ved 4 ° C i 30-60 min. Check cellerne ved visualisering under mikroskop for at sikre, at cellerne lyseres.
    Bemærk: lyserede celler vises som mørke spøgelser og mangler en grænse eller defineret form. Optimalt mindst 80% af cellerne bør lyseres.
  6. Punktere et hul i bunden af ​​røret under anvendelse af en push pin og sted i en samling 15 ml konisk rør (skruelåg skal være løs).
  7. Centrifuger ved 1.000 x g i 1 min til opsamling af lysatet.
  8. Overfør lysatet til en mikro centrifugerør.
  9. Centrifuger ved 15.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C for at indsamle de ekstraherede proteiner.
  10. Måle koncentrationen af ​​de ekstraherede proteiner ved hjælp af protein ASSAy-kit (tabel of Materials) og normalisere alle ekstrakter til at indeholde den samme mængde protein. Bring det samlede volumen til 1 ml med passende buffer.
    Bemærk: Ca. 5 mg totalt protein opnået fra 50 OD 600-celler.
  11. Spar 50 pi (250 ug protein, hvis det totale protein ekstraheret fra trin 2.10 er 5 mg) som helcelleekstrakt (WCE). Der tilsættes 50 pi 2 x Laemmli-prøvebuffer (tabel 1) og inkuberes ved 100 ° C i en varmeblok i 3-5 min. Belastning 10 pi af hver prøve i en SDS-PAGE gel til Western Blot-analyse (Afsnit 5: Western blot-analyse).

3. Oprensning af HF-Smt3 konjugater

  1. Opnå de Ni-NTA Superflow perler (Tabel over materialer), der er nødvendige for eksperimenterne (100 pi perler pr prøve) ved lav hastighed centrifugering (800-1,500 xg) i 1 min. Fjern supernatanten.
  2. Vask perler 5x med 1 ml PBS (tabel of Materials): Vend top-over-bund, indtil perlerne resuspenderes, indsamle perler ved centrifugering ved lav hastighed, og supernatanten fjernes.
  3. Suspender perlerne i 1 ml guanidinbuffer (tabel 1) og udportionerer dem i antal rør, der svarer til prøver, der skal behandles. Indsamle perler ved centrifugering ved lav hastighed og fjern supernatanten. Bland perlerne godt ved at vende top-over bunden.
    Bemærk: Bland perler godt ved at vende top-over bund.
  4. For hver prøve tilsættes 950 pi af de resterende WCE (fra trin 2.11: Ekstraktion af proteiner) til 100 pi Ni-NTA Superflow perler.
  5. Inkuber på en vippende platform ved 4 ° C i mindst 4 timer eller natten over.
  6. Centrifuger ved 800-1,500 xg i 1 min ved 4 ° C.
  7. Spar 50 pi som supernatant (SUP). Der tilsættes 50 pi 2 x Laemmli prøvepuffer og inkuberes ved 100 ° C i en varmeblok i 3-5 min. Belastning 10 pi af hver prøve i en SDS-PAGE gel til Western Blot-analyse (Afsnit 5: Western blot analysis).
  8. Vask perler gang med 1 ml guanidinbuffer for 5-10 min på en vippende platform.
  9. Vask perler 5x med 1 ml bryde puffer (tabel 1) i 5-10 min på en vippende platform.
  10. Resuspender perler i 90 pi 2 x Laemmli-prøvebuffer.
  11. Tilsæt 10 pi 1 M imidazol.
    Bemærk: Imidazol hjælper til at dissociere His-mærket protein fra Ni-NTA-perler på grund af konkurrerende interaktion mellem imidazol og perlerne.
  12. Der inkuberes ved 100 ° C i en varmeblok i 3-5 min.
  13. Vortex, centrifugeres ved 13.000 x g i 30 sek. Supernatanten overføres til et nyt rør.
  14. Belastning 10-20 pi af hver prøve i en SDS-PAGE gel til Western Blot-analyse (Afsnit 5: Western blot-analyse).
    Bemærk: 10-20 pi svarer til 0,5-1,0 mg input, hvis der anvendes 5 mg Vest- og Centraleuropa.

4. Immunopræcipitation af Myc-mærkede proteiner Kinetochore

  1. Opnå anti-c-Myc agarose affinitetsgel entibody (tabel of Materials) nødvendige til forsøgene (25 pi harpiks per prøve) ved lav hastighed centrifugering (800-1,500 xg). Fjern supernatanten.
  2. Vask af resin 5x med 1 ml puffer A: Invert top-over-bund indtil harpiksen resuspenderes, indsamle harpiks ved lav hastighed centrifugering, og supernatanten fjernes.
  3. Suspendere harpiksen i 1 ml puffer A og udportionerer dem i antal rør, der svarer til prøver, der skal behandles. Indsamle harpiksen ved lav hastighed centrifugering, og supernatanten fjernes.
    Bemærk: Bland harpiksen godt ved at vende top-over-bund.
  4. Tilføj 950 pi af de resterende WCE (fra trin 2.11: Ekstraktion af proteiner) til 25 pi harpiks.
  5. Inkuber på en vippende platform ved 4 ° C natten over.
  6. Centrifuger ved 800-1,500 xg i 1 min ved 4 ° C.
  7. Spar 50 pi som supernatant (SUP). Der tilsættes 50 pi 2 x Laemmli prøvepuffer og inkuberes ved 100 ° C i en varmeblok i 3-5 min. Load 10 pi af hver prøve i en SDS-PAGE gel til Western Blot-analyse (Afsnit 5: Western blot-analyse).
  8. Vask af resin 5x med 1 ml puffer A: Invert top-over-bund indtil harpiksen resuspenderes, indsamle harpiks ved lav hastighed centrifugering, og supernatanten fjernes.
  9. Resuspender harpiksen i 100 pi SUMEB prøvebuffer (tabel 1).
    Bemærk: SUMEB prøvepuffer indeholder 8 M urinstof og 1% SDS (stærk denaturerende betingelse).
  10. Der inkuberes ved 100 ° C i en varmeblok i 3-5 min.
  11. Vortex, centrifugeres ved 13.000 x g i 30 sek. Supernatanten overføres til et nyt rør.
  12. Belastning 10-20 pi af hver prøve i en SDS-PAGE gel til Western Blot-analyse (Afsnit 5: Western blot-analyse).
    Bemærk: 10-20 pi svarer til 0,5-1,0 mg input, hvis der anvendes 5 mg Vest- og Centraleuropa.

5. Western blot-analyse

  1. Indlæse proteinekstrakter på 4-12% Bis-Tris geler (tabel of Materials) og perform elektroforese ved 120 V i 90 min (Running buffer: Table of Materials).
  2. Overføre proteinerne fra gelen til en nitrocellulosemembran (tabel of Materials) under anvendelse af et overførsel ved 30 V i 90 minutter (Transfer buffer: Table of Materials).
  3. Blokere membranen i 5% mælk / TBST 1x (Tabel 1) i 1 time ved stuetemperatur.
  4. Inkuber membran med primært antistof (tabel Materialer) i 5% mælk / 1x TBST natten over ved 4 ° C. For primære antistoffer, anvendes en fortynding på 1: 1.000 (anti-Flag og anti-Ub antistoffer) eller 1: 5.000 (anti-Myc-antistof).
  5. Vask membran 3x i 10 minutter hver med 1x TBST.
  6. Inkuber membranen med sekundært antistof (tabel Materialer) i 5% mælk / TBST 1x i 1 time ved stuetemperatur. Brug en 1: 5000 fortynding af sekundære antistoffer.
  7. Vask membran 3x i 10 minutter hver med 1x TBST.
  8. Inkuber membran med ECL working opløsning (Tabel over Materials) i 5 min.
  9. Expose membranen til blå følsomme X-Ray film (Tabel over Materials) og udvikler ved hjælp af en automatisk udvikler (Table of Materials).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For at detektere sumoylation af kinetochore proteiner Ndc80 og Ndc10, stammer med HF-Smt3 og Myc-mærkede kinetochore proteiner (Ndc80 eller Ndc10) blev konstrueret (tabel 2), som tidligere beskrevet 9,12. HF-Smt3 konjugater blev affinitetsoprenset under anvendelse af Ni-NTA-perler. Western blot analyse af oprenset HF-Smt3 med et anti-Flag-antistof tillod detektion af sumoylated former af SUMO substrater, der var fraværende i kontrolstammen uden HF-Smt3 (figur 1A og 1B, venstre panel). Som forventet blev der flere former for SUMO substrater påvist i HF-Smt3 stamme. Derefter bestemte vi, hvis Ndc80 og Ndc10 er til stede i oprenset HF-Smt3 konjugat ved at gøre western blot-analyse under anvendelse af et anti-Myc-antistof. Flere bands, der var med højere molekylvægt end Ndc80 eller Ndc10 var klart påvist (figur 1A og 1B, højre panel). Desuden flere bånd af både Ndc80 og Ndc10blev reduceret i nocodazol behandlede celler (figur 1C og 1D). Disse resultater viser, at proteinoprensning og western blot-analyse beskrevet her muliggør påvisning af sumoylation af Ndc80 og Ndc10, som tidligere beskrevet 9.

For at detektere ubiquitinering af Ndc80 og Ndc10, Myc-tagget Ndc80 eller Ndc10 blev immunpræcipiteret (IP) og western blot-analyse blev udført med anti-Myc og anti-Ub antistoffer (figur 2). Analyse af helcelleekstrakter (WCE) og supernatant (SUP) bekræftede ekspressionen af Ndc80-Myc og Ndc10-Myc (figur 2A). De lavere molekylvægt bånd på WCE kan repræsentere nedbrydningsprodukter. IP prøver undersøgt med anti-Myc viste flere højmolekylære bands, hvilket tyder på, at Ndc80 og Ndc10 indeholder PTMS. En laddering mønster af IP prøver probet med anti-Ub-antistof viste, at Ndc80 og Ndc10 er ubiquitineret (figur 2A, α-Ub). Den laddering mønster af Ndc80 og Ndc10 blev forbedret ved behandling med proteasominhibitor (MG132) (figur 2B, α-Ub), hvilket yderligere bekræfter, at disse bånd repræsenterer poly-ubiqutination. De repræsentative resultater viser, at både Ndc80 og Ndc10 er substrater for sumoylation og ubiquitinering i S. cerevisiae og at de beskrevne protein oprensningsfremgangsmåder er anvendelige til påvisning af PTMS såsom sumoylation og ubiquitinering. Ifølge vores viden, er dette den første rapport, Ndc80 i S. cerevisiae er et substrat for ubiquitinering, selvom ubiquitin medieret proteolyse af den humane homolog Hec1 tidligere er blevet offentliggjort 11.

Figur 1
Figur 1: Oprensning af sumolyated substrater tillader identifikation af kinetochore proteiner Ndc80 og Ndc10 som SUMO substrater Pr.oteins blev ekstraheret og HF-Smt3 konjugater blev fremstillet og analyseret ved western blot-analyse efter SDS-PAGE separation. (A og B) Ndc80 og Ndc10 er sumoylated. Proteiner blev ekstraheret fra logaritmisk voksende celler i YPD. Venstre panel: Totale SUMO substrater blev detekteret med et anti-Flag-antistof. Højre panel: Sumoylated Ndc80 eller Ndc10 blev påvist i HF-Smt3 konjugater når undersøgt med et anti-Myc-antistof. (C og D) Sumoylation af Ndc80 og Ndc10 reduceres i nocodazol behandlede celler. Logaritmisk voksende celler i YPD blev behandlet med DMSO (-) eller DMSO + 20 ug / ml nocodazol (+) i 2 timer ved 30 ° C. HF-Smt3 konjugater blev analyseret ved Western blot-analyse under anvendelse af anti-Myc-antistof. Isogene gærstammer anvendes, er (A og C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Myc) og (B og D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (His-Flag-SMT3 Ndc10-Myc).

Figur 2
Figur 2:. Ubiquitinering af kinetochore proteiner Ndc80 og Ndc10 Udvinding af protein og immunfældning blev udført som beskrevet i protokollen. (A) Ndc80 og Ndc10 er ubiquitineret. Proteiner blev ekstraheret fra logaritmisk voksende celler i YPD. Helcelleekstrakt (WCE), supernatant (SUP), og de immunopræcipiterede (IP) fraktioner blev underkastet SDS-PAGE. Western blots blev anvendt til at detektere Myc-mærkede og ubiquitinerede proteiner med anti-Myc og anti-Ub antistoffer hhv. (B) Ubiquitinering af Ndc80 og Ndc10 forstærkes i celler behandlet med proteasominhibitor MG132. Logaritmisk voksende celler i YPD blev behandlet med DMSO (-) eller DMSO + 50 uM MG132 (+) i nærvær af 0,003% SDS i 3 timer ved 30 ° C, som tidligere beskrevet 13

Opløsning Komponenter
YPD 1% gærekstrakt, 2% bacto-pepton, 2% glucose
Guanidinbuffer 0,1 M Tris-HCI pH 8,0, 6 M guanidin-chlorid, 0,5 M NaCl
Buffer A 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,2% Triton X-100, 1x proteasehæmmere
Breaking buffer 0,1 M Tris-HCI pH 8,0, 20% glycerol, 1 mM PMSF
SUMEB prøvebuffer 1% SDS, 8 M urinstof, 10 mM MOPS pH 6,8, 10 mM EDTA, 0,01% bromphenolblåt
2x Laemmli prøvebuffer 100 mM Tris-HCIpH 6,8, 4% SDS, 20% glycerol, 0,2% bromphenolblåt (Før brug: tilføj b-mercaptoethanol (BME) til en slutkoncentration på 200 mM)
1x TBST 137 mM natriumchlorid, 20 mM Tris-HCI pH 7,5, 0,1% Tween-20

Tabel 1: Solutions.

Tabel 2. Gærstammer anvendt i denne undersøgelse *.
Stammer Parent Genotype Henvisning
BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Open Biosystems
BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Open Biosystems
YMB7278 BY4741 / BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 Denne undersøgelse
YPH1734 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3A200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 Montpetit et al., 2006
YPH1800 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3A200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 Montpetit et al., 2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80-Myc :: His3MX6 Denne undersøgelse
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 MATa his3 leu2 ura3 trp1 lys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 Denne undersøgelse
* Alle gærstammer er afledt af Saccharomyces cerevisiae S288C.
Tabel 2: Gærstammer anvendt i denne undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Epitopmærker såsom HA, Myc, Flag, og GST er almindeligt brugt til biokemisk analyse af proteiner. Konstruktion af stammer med HF-Smt3 og Myc-mærkede kinetochore proteiner, såsom Ndc10 og Ndc80, letter påvisning af PTMS såsom sumoylation og ubiquitination. HF-Smt3 trække ned assay muliggør detektion af sumoylated kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80 (figur 1). Affinitetsoprensning protokol og Western blot-analyse under anvendelse af anti-Flag-antistof fastslå specificiteten af ​​interaktionen mellem HF-Smt3 og målproteiner, som modificerede proteiner ikke blev påvist i kontrolstammen uden HF-Smt3. Brugen af ​​Myc-mærke på proteinsubstraterne validerer tilstedeværelsen af ​​sumoylated Ndc10 og Ndc80 i HF-Smt3 konjugater. Endvidere blev sumoylation af både Ndc10 og Ndc80 reduceret i nocodazol behandlede celler (figur 1C og 1D). Nedsat sumoylation af Ndc10 som reaktion på nocodazol behandlit, men ikke Ndc80, er tidligere rapporteret af Montpetit et al. 9. Dette kan skyldes forskelle i forsøgsprotokol og anvendelse af en tilpasset anti-SUMO antistof. Vore resultater for sumoylation af kinetochore substrater tyder på, at en tilsvarende protokol kan anvendes til at undersøge andre kandidat SUMO substrater.

For at detektere ubiquitinering, blev Myc-mærkede proteiner kinetochore først immunopræcipiteret og IP fraktioner blev probet med anti-Ub-antistof (figur 2). Den laddering mønster af Ndc10 og Ndc80 blev forøget, når cellerne blev behandlet med MG132 at inhibere proteasomfunktionen (figur 2B), hvilket indikerer, at disse proteiner er substrater for proteasomet. IP fraktioner ikke har kunnet påvise sumoylation af Ndc10 eller Ndc80 i Western blot-analyse med anti-Flag eller anti-Smt3 antistof (data ikke vist). Dette kan skyldes tekniske årsager, såsom niveauer af sumoylated substrat i undersøgelsesperioden fraktion eller den interference fra epitopmærker. Yderligere optimering af IP-protokollen, såsom koncentration af salte og Western blotting betingelser bør lette påvisning af flere PTMS af enhver protein af interesse. På nuværende tidspunkt er sumoylation bedst registreres af HF-Smt3 pull down assay efterfulgt af western blots af kandidat SUMO substrater (figur 1).

Adskillige detaljer påvirke effektiviteten af ​​proteinoprensning og evnen til at detektere PTMS. For det første skal alle rør holdes på is til at hæmme proteaserne undtagen som specificeret. Sekund, en 1: 1-forhold mellem cellesuspension til glasperler er kritisk at forstyrre cellerne ved perlen beater og / eller hvirvelomrøreren. Cellelysis bør overvåges ved undersøgelse af cellerne under mikroskop. For det tredje er det meget vigtigt at udarbejde en afklaret lysat for pull down assay eller IP. Kort eller centrifugering ved lav hastighed kan bidrage til kontaminering af cellerester i lysatet, og dette påvirker evnen til at Detect den PTMS. Endelig kraftig omrystning af perlerne med et stort volumen af ​​klare lysat (ca. 1 ml) i et 1,5 ml micro centrifugerør sikrer, at perlerne er fuldt ud ophængt for pull down assay eller IP'er. Sammenfattende proteinoprensning og detekteringsteknikker, såsom at her beskrevne giver vigtige mekanistiske indsigt i, hvordan PTM af kinetochore proteiner påvirke deres struktur og samling til trofast kromosom adskillelse 14, 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
Proteinoprensning Teknik der tillader detektering af Sumoylation og Ubiquitinering af Spirende Gær Kinetochore Proteiner Ndc10 og Ndc80
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter