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Biology

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

doi: 10.3791/52482 Published: May 3, 2015

Summary

Questo manoscritto descrive la rilevazione di sumoilazione e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, nel lievito Saccharomyces cerevisiae erba.

Abstract

Modificazioni post-traduzionali (PTM), come fosforilazione, metilazione, acetilazione, ubiquitinazione e sumoilazione, regolano la funzione cellulare di molte proteine. PTM di proteine ​​cinetocore che associano con il DNA centromerico mediano fedele segregazione dei cromosomi per mantenere la stabilità del genoma. Approcci biochimici come la spettrometria di massa e analisi di western blot sono più comunemente utilizzati per l'identificazione di PTM. Qui, un metodo di purificazione della proteina è descritto che permette il rilevamento di entrambe sumoylation e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. Un ceppo che esprime polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) e Myc-tagged Ndc10 o Ndc80 è stato costruito e utilizzato per i nostri studi. Per il rilevamento di sumoylation, abbiamo ideato un protocollo per affinità purificare proteine ​​sumoylated His-tagged utilizzando perline di nichel e usato western blot con anticorpi anti-Myc per rilevare sumoylated Ndc10 unnd Ndc80. Per il rilevamento di ubiquitinazione, abbiamo ideato un protocollo per immunoprecipitazione di proteine ​​Myc-tag e utilizzato analisi Western Blot con anticorpi anti-Ub per dimostrare che Ndc10 e Ndc80 sono ubiquitinate. I nostri risultati mostrano che epitopi di proteine ​​tag di interesse per il suo-Flag tagged ceppo Smt3 facilita l'individuazione di molteplici PTM. Studi futuri dovrebbero consentire lo sfruttamento di questa tecnica per identificare e caratterizzare le interazioni proteina che dipendono da uno specifico PTM.

Introduction

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Ubiquitinazione e sumoilazione permettono la coniugazione di ubiquitina e Modifier Piccolo ubiquitina-simile (SUMO, Smt3 in S. cerevisiae 1) ad una proteina bersaglio, rispettivamente. PTM di proteine ​​cinetocore influenzano i livelli cellulari e interazioni proteina-proteina durante le diverse fasi del ciclo cellulare per garantire fedele segregazione dei cromosomi. Ad esempio, i livelli cellulari di Cse4 / CENP-A e proteine ​​cinetocore esterno DSN1 sono regolate da proteolisi ubiquitina-mediata per garantire la stabilità del genoma 2-5. Destabilizzazione degli allegati cinetocore-microtubuli non corretti richiede la B chinasi Ipl1 / Aurora, che fosforila Dam1 e Ndc80 complessi che interagiscono direttamente con i microtubuli 6-8. Nonostante l'identificazione di oltre settanta proteine ​​cinetocore, ci sono molto pochi gli studi che indagano le modifiche di queste proteine ​​con PTM, ad esempio, l'ubiquitina e SUMO. Una limitazione importante è la capacità di conservare la PTMs durante la purificazione e la scarsità di anticorpi personalizzati per la rilevazione di PTM come sumoylation, fosforilazione, metilazione, e altri. Caratterizzazione di proteine ​​cinetocore sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, e Ndc80 utilizzato un anticorpo personalizzato 9. Inoltre, Ndc10 è stata implicata come substrato per 10 ubiquitinazione. Hec1 umana (Ndc80 in S. cerevisiae) è anche substrato per ubiquitinazione, regolato da APC / C-hCdh1 E3 ligasi 11. Pertanto, Ndc10 e Ndc80 sono buoni candidati per l'ottimizzazione del protocollo per rilevare sia sumoilazione e ubiquitinazione in S. cerevisiae.

Per facilitare l'individuazione di sumoilazione, abbiamo costruito i ceppi che esprimono HF-Smt3 e Myc-tag Ndc10 o Ndc80. L'uso di tag epitopi (HF: His6-Flag) riduce al minimo il fondo a causa della cross-reattività che è frequente nel siero policlonale sollevata contro una proteina candidato. Abbiamo ideato un protocollo per affinitàpurificare coniugati HF-Smt3 e poi utilizzati commerciale anti-Flag e anticorpi anti-myc per rilevare la presenza di sumolyated Ndc10 e Ndc80 nella preparazione Smt3 purificato. Per ubiquitination, abbiamo ideato un protocollo immunoprecipitazione modificata che conserva ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore Myc-targhette e svolta western blot con l'anticorpo commerciale anti-Ub per rilevare ubiquitinazione di Ndc10 e Ndc80.

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Protocol

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1. La crescita di cellule di lievito

  1. Inoculare cellule di lievito in 30 ml di YPD (Tabella 1) in un palloncino. Incubare a 30 ° C per una notte con agitazione.
  2. Diluire le cellule ad una densità ottica di 0,2 a 600 nm (OD 600 = 0.2) in 50 ml di YPD e incubare a 30 ° C con agitazione.
  3. Crescere la coltura ad una densità ottica di 1,0 a 600 nm (OD 600 = 1.0).
  4. Celle di centrifugazione per 5 min a 2000 xg e scartare il surnatante.
  5. Risospendere il pellet di cellule in 40 ml di acqua sterile e centrifugare per 5 min a 2000 xg per lavare le cellule. Eliminare il surnatante e conservare il pellet cellulare a -20 ° C.

2. Estrazione di proteine

  1. Risospendere le cellule in 0,5 ml di ghiacciata buffer di guanidina (Tabella 1) per il dosaggio di pull-down con Ni-NTA perline Superflow o tampone A (Tabella 1) per immunoprecipitazione. Tenere tubi sul ghiaccio in ogni momento.
  2. Trasferimento a 2 ml tubo tappo a vite.
  3. Aggiungere lo stesso volume di perline di vetro (Table of Materials).
  4. Bead-battere le celle di una mini tallone battitore (tabella dei materiali) per 2 minuti a temperatura ambiente, poi posto in ghiaccio per 2-3 minuti. Ripetere questa operazione tre volte.
  5. Vortex sulla alta velocità a 4 ° C per 30-60 min. Controllare le cellule mediante visualizzazione al microscopio per assicurare che le cellule sono lisate.
    Nota: cellule lisate appariranno fantasmi scuri e la mancanza di un confine o una forma definita. In modo ottimale almeno l'80% delle cellule dovrebbe essere lisato.
  6. Perforare un foro nella parte inferiore del tubo con una puntina e posto in una collezione tubo da 15 ml (tappo a vite deve essere sciolto).
  7. Centrifugare a 1000 xg per 1 minuto per raccogliere il lisato.
  8. Trasferire il lisato in una provetta da centrifuga micro.
  9. Centrifugare a 15.000 xg per 30 min a 4 ° C per raccogliere le proteine ​​estratte.
  10. Misurare la concentrazione delle proteine ​​estratte usando l'assa proteiney Kit (Tabella dei Materiali) e normalizzare tutti gli estratti per contenere la stessa quantità di proteine. Portare il volume totale di 1 ml con tampone appropriato.
    Nota: Circa 5 mg di proteine ​​totali è ottenuta da 50 OD 600 cellule.
  11. Risparmia il 50 microlitri (250 ug di proteine ​​se la proteina totale estratto dal punto 2.10 è di 5 mg), come estratto di cellula intera (WCE). Aggiungere 50 ml di tampone campione 2x Laemmli (Tabella 1) e incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min. Carico 10 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: analisi Western Blot).

3. Purificazione di HF-Smt3 Coniugati

  1. Ottenere le perline Superflow Ni-NTA (Tabella dei Materiali) necessari per gli esperimenti (100 ml di perline per campione) tramite centrifugazione a bassa velocità (800-1,500 xg) per 1 min. Rimuovere il surnatante.
  2. Lavare perline 5x con 1 ml di PBS (Table of Materials): Inverti top-overfondo fino a quando le perle sono risospese, raccogliere perle di centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante.
  3. Sospendere perline in 1 ml di tampone guanidina (Tabella 1) e un'aliquota nel numero di tubi corrispondenti ai campioni da trattare. Raccogliere perle per centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante. Mescolare le perline ben invertendo top-over in basso.
    Nota: Miscelare cordoni ben invertendo bottom top-over.
  4. Per ciascun campione, aggiungere 950 microlitri della restante WCE (dal punto 2.11: Estrazione di proteine) a 100 ml di Ni-NTA perline Superflow.
  5. Incubare su una piattaforma oscillante a 4 ° C per almeno 4 ore o tutta la notte.
  6. Centrifugare a 800-1,500 xg per 1 min a 4 ° C.
  7. Risparmia il 50 microlitri come surnatante (SUP). Aggiungere 50 ml di tampone campione 2x Laemmli e incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min. Carico 10 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: anal Western BlotYsis).
  8. Perline Lavare una volta con 1 ml di tampone guanidina per 5-10 minuti su una piattaforma oscillante.
  9. Lavare perline 5x con 1 ml di tampone di rottura (Tabella 1) per 5-10 minuti su una piattaforma oscillante.
  10. Perline Risospendere in 90 ml di tampone campione 2x Laemmli.
  11. Aggiungere 10 ml di 1 M imidazolo.
    Nota: Imidazolo aiuta a dissociarsi proteina His-tag da perline Ni-NTA dovuta all'interazione competizione tra imidazolo e le perle.
  12. Incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min.
  13. Vortex, quindi centrifugare a 13.000 g per 30 sec. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
  14. Carico 10-20 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: analisi Western Blot).
    Nota: 10-20 ml corrisponde a 0,5-1,0 mg di ingresso, se viene utilizzato 5 mg di WCE.

4. Immunoprecipitation di Myc-tag cinetocore Proteine

  1. Ottenere anti-c-Myc affinità agarosio gel untibody (Tabella dei Materiali) necessari per gli esperimenti (25 microlitri di resina per campione) tramite centrifugazione a bassa velocità (800-1,500 xg). Rimuovere il surnatante.
  2. 5x resina Lavare con 1 ml di tampone A: Inverti top-over-basso fino la resina viene risospeso, raccolgono resina tramite centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante.
  3. Sospendere resina in 1 ml di tampone A e Aliquotare nel numero di tubi corrispondenti ai campioni da trattare. Raccogliere resina mediante centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante.
    Nota: Mescolare la resina ben invertendo top-over-bottom.
  4. Aggiungere 950 microlitri della restante WCE (dal punto 2.11: Estrazione di proteine) a 25 ml di resina.
  5. Incubare su una piattaforma oscillante a 4 ° C durante la notte.
  6. Centrifugare a 800-1,500 xg per 1 min a 4 ° C.
  7. Risparmia il 50 microlitri come surnatante (SUP). Aggiungere 50 ml di tampone campione 2x Laemmli e incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min. Load 10 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per l'analisi Western Blot (Sezione 5: analisi Western Blot).
  8. 5x resina Lavare con 1 ml di tampone A: Inverti top-over-basso fino la resina viene risospeso, raccolgono resina tramite centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante.
  9. Risospendere la resina in 100 ml di tampone campione SUMEB (Tabella 1).
    Nota: tampone campione SUMEB contiene 8 M Urea e 1% SDS (forte condizione di denaturazione).
  10. Incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min.
  11. Vortex, quindi centrifugare a 13.000 g per 30 sec. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
  12. Carico 10-20 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: analisi Western Blot).
    Nota: 10-20 ml corrisponde a 0,5-1,0 mg di ingresso, se viene utilizzato 5 mg di WCE.

5. Western Blot analisi

  1. Caricare i estratti proteici di 4-12% Bis-Tris gels (Tabella dei Materiali) e perfelettroforesi orm a 120 V per 90 min (buffer di Esecuzione: Tabella dei Materiali).
  2. Trasferire le proteine ​​da gel su una membrana di nitrocellulosa (Table of Materials) usando un dispositivo di trasferimento a 30 V per 90 min (Buffer di trasferimento: Table of Materials).
  3. Bloccare la membrana in 5% di latte / 1x TBST (Tabella 1) per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Incubare a membrana con anticorpo primario (Table of Materials) a 5% di latte / 1x TBST notte a 4 ° C. Per anticorpi primari, utilizzare una diluizione di 1: 1.000 (anticorpi anti-Flag e anti-Ub) o 1: 5.000 (anticorpo anti-Myc).
  5. Lavare membrana 3x per 10 minuti ciascuno con 1x TBST.
  6. Incubare a membrana con anticorpo secondario (Tabella dei Materiali) a 5% di latte / 1x TBST per 1 ora a temperatura ambiente. Usare una diluizione 1: 5.000 del anticorpi secondari.
  7. Lavare membrana 3x per 10 minuti ciascuno con 1x TBST.
  8. Incubare a membrana con ECL workisoluzione ng (Table of Materials) per 5 min.
  9. Esporre la membrana blu X-ray film sensibile (Tabella dei Materiali) e sviluppare utilizzando uno sviluppatore automatica (Table of Materials).

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Representative Results

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Per rilevare sumoylation di proteine ​​cinetocore Ndc80 e Ndc10, ceppi con HF-Smt3 e proteine ​​cinetocore Myc-tag (Ndc80 o Ndc10) sono stati costruiti (Tabella 2), come descritto in precedenza 9,12. Coniugati HF-Smt3 stati affinità purificate utilizzando Ni-NTA perline. Analisi Western blot di purificato HF-Smt3 con un anticorpo anti-Flag permesso rilevamento di forme sumoylated di substrati SUMO che erano assenti nel ceppo di controllo senza HF-Smt3 (Figura 1A e 1B, pannello di sinistra). Come previsto, molteplici forme di substrati SUMO sono stati rilevati nel ceppo HF-Smt3. Abbiamo poi stabilito se Ndc80 e Ndc10 sono presenti nel purificata HF-Smt3 coniugato effettuando analisi western blot utilizzando un anticorpo anti-Myc. Più bande che erano di peso molecolare superiore a quello del Ndc80 o Ndc10 erano chiaramente rilevati (Figura 1A e 1B, pannello di destra). Inoltre, più bande di entrambi Ndc80 e Ndc10sono stati ridotti in cellule trattate nocodazole (Figura 1C e 1D). Questi risultati mostrano che la purificazione di proteine ​​e western blot descritte permettono di rilevare sumoilazione di Ndc80 e Ndc10, come descritto in precedenza 9.

Per rilevare ubiquitination di Ndc80 e Ndc10, Myc-tagged Ndc80 o Ndc10 stata immunoprecipitati (IP) e l'analisi Western Blot è stato eseguito con l'anti-Myc e anti-Ub anticorpi (Figura 2). Analisi di estratti cellulari totali (ECO) e surnatante (SUP) ha confermato l'espressione di Ndc80-Myc e Ndc10-Myc (Figura 2A). Le bande con peso molecolare inferiore sul WCE possono rappresentare prodotti di degradazione. Campioni IP sondato con anticorpi anti-Myc mostrato bande multiple ad alto peso molecolare, il che suggerisce che Ndc80 e Ndc10 contengono PTM. Un modello laddering di campioni IP sondati con anticorpi anti-Ub mostrato che Ndc80 e Ndc10 sono ubiquitinate (Figura 2A, α-Ub). Il modello di laddering Ndc80 e Ndc10 sono stati rafforzati dal trattamento con inibitore del proteasoma (MG132) (Figura 2B, α-Ub), ulteriore conferma che queste bande rappresentano poli-ubiqutination. I risultati rappresentativi rivelano che sia Ndc80 e Ndc10 sono substrati sumoilazione e ubiquitinazione in S. cerevisiae e che la proteina metodi di purificazione descritti sono utili per il rilevamento di PTM come sumoilazione e ubiquitinazione. Secondo la nostra conoscenza, questo è il primo rapporto che Ndc80 a S. cerevisiae è un substrato per ubiquitination, sebbene ubiquitina mediata proteolisi l'omologo umano Hec1 è stato pubblicato in precedenza 11.

Figura 1
Figura 1: Purificazione di substrati sumolyated permette l'identificazione di proteine ​​cinetocore Ndc80 e Ndc10 come substrati SUMO Pr.oteins sono stati estratti e coniugati HF-Smt3 sono stati preparati e analizzati mediante western blot dopo la separazione SDS-PAGE. (A e B) e Ndc80 Ndc10 sono sumoylated. Le proteine ​​sono stati estratti dalle cellule logaritmica crescita in YPD. A sinistra: substrati SUMO totali sono stati rilevati con un anticorpo anti-Flag. A destra: Sumoylated Ndc80 o Ndc10 è stato rilevato nei coniugati HF-Smt3 quando sondato con un anticorpo anti-Myc. (C e D) sumoilazione di Ndc80 e Ndc10 è ridotta in cellule trattate nocodazole. Logaritmicamente cellule in crescita in YPD sono stati trattati con DMSO (-) o DMSO + 20 mcg / ml nocodazole (+) per 2 ore a 30 ° C. Coniugati HF-Smt3 sono stati analizzati mediante analisi western blot utilizzando un anticorpo anti-Myc. Lieviti isogenici usate sono (A e C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Myc) e (B e D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (His-Flag-SMT3 Ndc10-Myc).

Figura 2
Figura 2:. Ubiquitinazione di proteine ​​cinetocore Ndc80 e Ndc10 Estrazione di proteine ​​e immunoprecipitazione sono state eseguite come descritto nel protocollo. (A) Ndc80 e Ndc10 sono ubiquitinate. Le proteine ​​sono stati estratti dalle cellule logaritmica crescita in YPD. Estratto di cellule intere (ECO), surnatante (SUP), e le frazioni (IP) immunoprecipitati sono stati sottoposti a SDS-PAGE. Macchie occidentali sono stati usati per rilevare le proteine ​​Myc-targhette e ubiquitinate con anti-Myc e anticorpi anti-Ub, rispettivamente. (B) Ubiquitinazione di Ndc80 e Ndc10 è aumentata in cellule trattate con l'inibitore del proteasoma MG132. Cellule logaritmicamente crescita in YPD sono stati trattati con DMSO (-) o DMSO + 50 pM MG132 (+) in presenza di 0,003% di SDS per 3 ore a 30 ° C, come precedentemente descritto 13

Soluzione Componenti
YPD Estratto di lievito 1%, 2% Bacto-peptone, 2% di glucosio
Buffer Guanidine 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 6 M cloruro di guanidina, 0,5 M NaCl
Buffer A 50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 50 mM, 0,2% Triton, inibitori della proteasi 1x X-100
Buffer Rompere 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 20% glicerolo, 1 mM PMSF
Tampone campione SUMEB 1% SDS, 8 M Urea, 10 mM MOPS pH 6,8, EDTA 10 mm, 0,01% di bromofenolo blu
2x Laemmli Sample Buffer 100 mM Tris-HClpH 6,8, 4% SDS, 20% glicerolo, 0,2% blu di bromofenolo (Prima dell'uso: aggiungere b-mercaptoetanolo (BME) ad una concentrazione finale di 200 mM)
1x TBST 137 mM cloruro di sodio, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% Tween-20

Tabella 1: Soluzioni.

Tabella 2. ceppi di lievito usati in questo studio *.
Tensioni Genitore Genotipo Riferimento
BY4741 MATA his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Aperto Biosystems
BY4742 MATA his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Aperto Biosystems
YMB7278 BY4741 / BY4742 MATA his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 Questo studio
YPH1734 MATA ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 Montpetit et al., 2006
YPH1800 MATA ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 Montpetit et al., 2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 MATA his3 LEU2 URA3 ADE2 TRP1 HF-SMT3 :: LEU2 Ndc80-Myc :: His3MX6 Questo studio
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 MATA his3 LEU2 URA3 TRP1 lys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 Questo studio
* Tutti i ceppi di lievito sono derivati ​​da Saccharomyces cerevisiae S288c.
Tabella 2: ceppi di lievito utilizzato in questo studio.

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Discussion

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Tag epitopo quali HA, Myc, Bandiera, e GST sono ampiamente utilizzati per l'analisi biochimica delle proteine. Costruzione di ceppi con HF-Smt3 e proteine ​​cinetocore Myc-tag, come Ndc10 e Ndc80, facilita l'individuazione di PTM, come sumoilazione e ubiquitinazione. HF-Smt3 tirare giù test permette la rilevazione di proteine ​​cinetocore sumoylated, Ndc10 e Ndc80 (Figura 1). Il protocollo di purificazione per affinità e western blot utilizzando un anticorpo anti-Flag stabilire la specificità di interazione tra HF-Smt3 e proteine ​​bersaglio, come proteine ​​modificate non sono stati rilevati nel ceppo di controllo senza HF-Smt3. L'uso del tag Myc sui substrati proteici convalida la presenza di sumoylated Ndc10 e Ndc80 nei coniugati HF-Smt3. Inoltre, sumoilazione sia Ndc10 e Ndc80 è stata ridotta nelle cellule trattate nocodazole (Figura 1C e 1D). Diminuzione sumoylation di Ndc10 in risposta a treatmen nocodazolet, ma non Ndc80, è stato precedentemente riportato da Montpetit et al. 9. Ciò può essere dovuto a differenze nel protocollo sperimentale e l'uso di un anticorpo anti-SUMO personalizzata. I nostri risultati per sumoylation di substrati cinetocoro suggeriscono che un protocollo simile può essere usato per studiare altri substrati candidato SUMO.

Per rilevare ubiquitinazione, proteine ​​cinetocore Myc-tag sono stati immunoprecipitati e le frazioni IP sono stati sondati con anticorpi anti-Ub (Figura 2). Il modello di laddering Ndc10 e Ndc80 è stata aumentata quando le cellule sono state trattate con MG132 per inibire la funzione del proteasoma (Figura 2B), indicando che queste proteine ​​sono substrati del proteasoma. Le frazioni IP non sono riusciti a rilevare sumoilazione di Ndc10 o Ndc80 in analisi Western Blot con anticorpi anti-Flag o anticorpo anti-Smt3 (dati non mostrati). Ciò può essere dovuto a ragioni tecniche quali i livelli di supporto sumoylated nella frazione IP o il interference dai tag epitopi. Ulteriore ottimizzazione del protocollo IP, come la concentrazione di sali e condizioni blotting occidentali dovrebbe facilitare l'individuazione di molteplici PTM di qualsiasi proteina di interesse. Attualmente, sumoilazione è migliore rilevata dal HF-Smt3 pull down assay seguita da Western blot dei substrati candidato SUMO (Figura 1).

Molti dettagli influenzano l'efficienza di purificazione di proteine ​​e la capacità di rilevare la PTMs. In primo luogo, tutti i tubi devono essere tenuti in ghiaccio per inibire le proteasi a eccezione delle indicazioni. In secondo luogo, un rapporto 1: 1 di sospensione cellulare in perline di vetro è fondamentale per distruggere le cellule dal battitore tallone e / o vortex. Lisi delle cellule devono essere monitorati con l'esame delle cellule sotto il microscopio. In terzo luogo, è molto importante preparare un lisato chiarificato per il saggio di pull down o IP. Breve o centrifugazione a bassa velocità può contribuire alla contaminazione di detriti cellulari nel lisato e questo influenza la capacità di detect il PTM. Infine, vigorosa agitazione delle perle con un grande volume di lisato chiaro (circa 1 ml) in una provetta da centrifuga da 1,5 ml micro assicura che le perle sono completamente sospesi per il saggio o IP discesa. In sintesi, purificazione di proteine ​​e tecniche di rivelazione, come quella qui descritta forniscono importanti intuizioni meccanicistici in come PTM delle proteine ​​cinetocore pregiudica la loro struttura e assemblaggio per il cromosoma fedeli separazione 14, 15.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

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References

  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
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  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
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Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80
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Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

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