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Biology

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

doi: 10.3791/52482 Published: May 3, 2015

Summary

Este manuscrito describe la detección de sumoylation y ubiquitinación de proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes.

Abstract

Modificaciones post-traduccionales (PTMs), tales como fosforilación, metilación, acetilación, ubiquitinación, y sumoylation, regulan la función celular de muchas proteínas. PTM de proteínas cinetocoro que se asocian con el ADN centromérico median segregación cromosómica fieles a mantener la estabilidad del genoma. Enfoques bioquímicos como la espectrometría de masas y análisis de transferencia Western son los más utilizados para la identificación de los PTM. Aquí, un método de purificación de proteínas se describe que permite la detección de tanto sumoylation y ubiquitinación de las proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en Saccharomyces cerevisiae. Una cepa que expresa etiquetados-polihistidina-Bandera Smt3 (HF-Smt3) y Myc-etiquetados Ndc10 o Ndc80 fue construido y utilizado para nuestros estudios. Para la detección de sumoylation, ideamos un protocolo para purificar por afinidad proteínas sumoylated etiquetados-Su usando perlas de níquel y utilizamos Western blot con anti-Myc anticuerpos para detectar sumoylated Ndc10 unnd Ndc80. Para la detección de ubiquitinación, ideamos un protocolo de inmunoprecipitación de proteínas Myc-etiquetados y utilizamos Western blot con el anticuerpo anti-Ub para demostrar que Ndc10 y Ndc80 se ubiquitinated. Nuestros resultados muestran que el epítopo de etiquetado proteína de interés en el Su-Bandera etiquetado cepa Smt3 facilita la detección de múltiples PTM. Los estudios futuros deben permitir la explotación de esta técnica para identificar y caracterizar las interacciones de proteínas que son dependientes de un PTM específico.

Introduction

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La ubiquitinación y la sumoilación permiten la conjugación de la ubiquitina y el modificador Pequeño ubiquitina-like (SUMO; Smt3 en S. cerevisiae 1) a una proteína diana, respectivamente. PTMs de proteínas kinetochore afectan a sus niveles celulares y las interacciones proteína-proteína durante las diferentes fases del ciclo celular para asegurar la segregación cromosómica fiel. Por ejemplo, los niveles celulares de Cse4 / CENP-A y proteínas cinetocoro externo DSN1 están regulados por la proteólisis mediada por ubiquitina de asegurar la estabilidad del genoma 2-5. La desestabilización de accesorios-cinetocoro microtúbulos incorrectas requiere la quinasa B Ipl1 / Aurora, que fosforila Dam1 y Ndc80 complejos que interactúan directamente con los microtúbulos 6-8. A pesar de la identificación de más de setenta proteínas cinetocoro, hay muy pocos estudios que investiguen las modificaciones de estas proteínas con PTM, por ejemplo, ubiquitina y SUMO. Una limitación importante es la capacidad de preservar la PTMs durante la purificación y la escasez de anticuerpos personalizados para la detección de PTM tales como sumoylation, fosforilación, metilación, y otros. Caracterización de proteínas cinetocoro sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1 y Ndc80 utiliza un anticuerpo encargo 9. Además, Ndc10 ha sido implicado como un sustrato para la ubiquitinación 10. Hec1 Humano (Ndc80 en S. cerevisiae) también está sustrato para la ubiquitinación, regulado por APC / C-hCdh1 E3 ligasa 11. Por lo tanto, Ndc10 y Ndc80 son buenos candidatos para la optimización del protocolo para detectar tanto sumoylation y ubiquitinación en S. cerevisiae.

Para facilitar la identificación de sumoylation, construimos cepas que expresan HF-Smt3 y etiquetada-Myc Ndc10 o Ndc80. El uso de etiquetas de epítopo (HF: His6-Flag) minimiza el fondo debido a la reactividad cruzada que se observa frecuentemente en el suero policlonal generado contra una proteína candidato. Hemos elaborado un protocolo de afinidadpurificar conjugados de HF-Smt3 y luego se usa anticuerpos anti-myc anti-Flag y comercial para detectar la presencia de sumolyated Ndc10 y Ndc80 en la preparación Smt3 purificado. Para ubiquitinación, ideamos un protocolo de inmunoprecipitación modificada que conserva la ubiquitinación de las proteínas del cinetocoro Myc-etiquetados y realizó el análisis de Western blot con el anticuerpo anti-Ub comercial para detectar la ubiquitinación de Ndc10 y Ndc80.

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Protocol

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1. Crecimiento de células de levadura

  1. Inocular células de levadura en 30 ml de YPD (Tabla 1) en un matraz pequeño. Incubar a 30 ° C durante la noche con agitación.
  2. Diluir las células a una densidad óptica de 0,2 a 600 nm (OD 600 = 0,2) en 50 ml de YPD y se incuba a 30 ° C con agitación.
  3. Mantener el cultivo a una densidad óptica de 1,0 a 600 nm (OD 600 = 1,0).
  4. Centrifugar las células durante 5 minutos a 2.000 xg y descartar el sobrenadante.
  5. Resuspender el sedimento celular en 40 ml de agua estéril y centrifugar durante 5 min a 2000 xg para lavar las células. Descartar el sobrenadante y el sedimento celular almacenar a -20 ° C.

2. Extracción de Proteínas

  1. Resuspender las células en 0,5 ml de tampón enfriado con hielo de guanidina (Tabla 1) para el ensayo de pull-down usando perlas Superflow Ni-NTA o tampón A (Tabla 1) para la inmunoprecipitación. Mantenga los tubos en hielo en todo momento.
  2. Transferencia a 2 ml tubo de tapón de rosca.
  3. Añadir el mismo volumen de cuentas de vidrio (Tabla de Materiales).
  4. Bolas de batir las células en un mini batidor grano (Tabla de Materiales) durante 2 minutos a temperatura ambiente, luego se coloca en hielo durante 2-3 minutos. Repita esto tres veces.
  5. Vortex a velocidad alta a 4 ° C durante 30-60 minutos. Compruebe las células mediante visualización bajo el microscopio para asegurar que las células se lisan.
    Nota: Las células lisadas aparecerán fantasmas oscuros y carecen de un límite o forma definida. De manera óptima al menos 80% de las células debe ser lisadas.
  6. Perforar un agujero en la parte inferior del tubo utilizando un alfiler y el lugar en una colección de 15 ml tubo cónico (tapón de rosca debe ser suelta).
  7. Centrifugar a 1000 xg durante 1 min para recoger el lisado.
  8. Transferir el lisado a un tubo de micro centrífuga.
  9. Centrifugar a 15000 xg durante 30 min a 4 ° C para recoger las proteínas extraídas.
  10. Medir la concentración de las proteínas extraídas mediante el assa proteínay kit (Tabla de Materiales) y normalizar todos los extractos para contener la misma cantidad de proteína. Llevar el volumen total a 1 ml con tampón apropiado.
    Nota: Alrededor de 5 mg de proteína total se obtiene de 50 OD 600 células.
  11. Ahorre 50 l (g de proteína 250 si la proteína total extraído de paso 2,10 es 5 mg) en forma de extracto de células enteras (EBB). Añadir 50 l de tampón de muestra Laemmli 2x (Tabla 1) y se incuba a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 min. Cargar 10 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot).

3. Purificación de HF-Smt3 conjugados

  1. Obtener las perlas Superflow Ni-NTA (Tabla de materiales) necesarios para los experimentos (100 l de granos por muestra) por centrifugación a baja velocidad (800-1,500 xg) durante 1 minuto. Eliminar el sobrenadante.
  2. Lave las perlas de 5x con 1 ml de PBS (Tabla de Materiales): Invertir top-sobre-inferior hasta que se vuelven a suspender las cuentas, recoger perlas por centrifugación a baja velocidad, y retire el sobrenadante.
  3. Suspender perlas en 1 ml de tampón de guanidina (Tabla 1) y alícuota ellos en el número de tubos correspondientes a las muestras para ser procesados. Recoger los granos mediante centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante. Mezclar los granos bien invirtiendo arriba sobre la parte inferior.
    Nota: Mezclar los granos bien invirtiendo bottom top-over.
  4. Para cada muestra, añadir 950 l de la WCE restante (del Paso 2.11: Extracción de proteínas) a 100 l de perlas de Ni-NTA Superflow.
  5. Incubar en una plataforma oscilante a 4 ° C durante al menos 4 horas o durante la noche.
  6. Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C.
  7. Ahorre 50 l como sobrenadante (SUP). Añadir 50 l de tampón de muestra Laemmli 2x y se incuba a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 min. Cargar 10 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: anal Western blotanalysis).
  8. Perlas Lavar una vez con 1 ml de tampón de guanidina para 5-10 minutos sobre una plataforma oscilante.
  9. Lavar las perlas de 5x con 1 ml de tampón de ruptura (Tabla 1) durante 5-10 minutos en una plataforma oscilante.
  10. Perlas de resuspender en 90 l de tampón de muestra Laemmli 2x.
  11. Añadir 10 l de 1 M imidazol.
    Nota: imidazol ayuda a disociar la proteína marcada con His de las perlas de Ni-NTA debido a la interacción que compiten entre imidazol y las perlas.
  12. Incubar a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 minutos.
  13. Vortex y centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
  14. Cargar 10-20 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot).
    Nota: 10-20 l corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, si se utiliza 5 mg de WCE.

4. La inmunoprecipitación de etiquetado-Myc proteínas cinetocoro

  1. Obtener-c-Myc contra afinidad de agarosa un geltibody (Tabla de materiales) necesarios para los experimentos (25 l de resina por muestra) por centrifugación a baja velocidad (800-1,500 xg). Eliminar el sobrenadante.
  2. Lave 5x resina con 1 ml de tampón A: top-sobre-fondo Invertir hasta que se volvió a suspender la resina, resina recogen por centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante.
  3. Suspender resina en 1 ml de tampón A y alícuota ellos en el número de tubos correspondientes a las muestras para ser procesados. Recoger resina mediante centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante.
    Nota: Mezclar la resina bien invirtiendo top-sobre-fondo.
  4. Añadir 950 l de la EBB restante (del Paso 2.11: La extracción de proteínas) a 25 l de resina.
  5. Incubar en una plataforma oscilante a 4 ° C durante la noche.
  6. Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C.
  7. Ahorre 50 l como sobrenadante (SUP). Añadir 50 l de tampón de muestra Laemmli 2x y se incuba a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 min. Load 10 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot).
  8. Lave 5x resina con 1 ml de tampón A: top-sobre-fondo Invertir hasta que se volvió a suspender la resina, resina recogen por centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante.
  9. Resuspender la resina en 100 l de tampón de muestra SUMEB (Tabla 1).
    Nota: tampón de muestra SUMEB contiene urea 8 M y SDS al 1% (fuerte condición de desnaturalización).
  10. Incubar a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 minutos.
  11. Vortex y centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
  12. Cargar 10-20 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot).
    Nota: 10-20 l corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, si se utiliza 5 mg de WCE.

5. Western Blot Analysis

  1. Cargue los extractos de proteínas de 4-12% Bis-Tris geles (Tabla de Materiales) y perfelectroforesis orm a 120 V durante 90 min (Ejecución de búfer: Tabla de Materiales).
  2. Transferencia de las proteínas a partir de gel a una membrana de nitrocelulosa (Tabla de Materiales) usando un aparato de transferencia a 30 V durante 90 minutos (tampón de transferencia: Tabla de Materiales).
  3. Bloquear la membrana en 5% leche / TBST 1x (Tabla 1) durante 1 hora a temperatura ambiente.
  4. Incubar la membrana con el anticuerpo primario (Tabla de Materiales) en 5% de leche / 1x TBST durante la noche a 4 ° C. Para los anticuerpos primarios, utilizar una dilución de 1: 1000 (anticuerpos anti-Flag y anti-UB) o 1: 5000 (anticuerpo anti-Myc).
  5. Lave 3x membrana durante 10 minutos cada uno con 1x TBST.
  6. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario (Tabla de Materiales) en 5% de leche / 1x TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Utilice una dilución 1: 5000 de anticuerpos secundarios.
  7. Lave 3x membrana durante 10 minutos cada uno con 1x TBST.
  8. Incubar la membrana con ECL workisolución ng (Tabla de Materiales) durante 5 min.
  9. Exponer la membrana sensible al azul película de rayos X (Tabla de Materiales) y desarrollar el uso de un programador automático (Tabla de Materiales).

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Representative Results

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Para detectar sumoylation de proteínas cinetocoro Ndc80 y Ndc10, cepas con HF-Smt3 y proteínas cinetocoro etiquetados-Myc (Ndc80 o Ndc10) fueron construidos (Tabla 2), como se describió anteriormente 9,12. Conjugados HF-Smt3 fueron purificados por afinidad utilizando perlas de Ni-NTA. Western blot de purificado HF-Smt3 con un permitido la detección de anticuerpos anti-Bandera de formas sumoylated de sustratos SUMO que en la cepa control sin HF-Smt3 (Figura 1A y 1B, panel izquierdo) estaban ausentes. Como era de esperar, se detectaron múltiples formas de sustratos SUMO en la cepa HF-Smt3. A continuación se determinó si Ndc80 y Ndc10 están presentes en el conjugado HF-Smt3 purificado haciendo análisis de Western blot utilizando un anticuerpo anti-Myc. Múltiples bandas que eran de mayor peso molecular que el de Ndc80 o Ndc10 fueron claramente detectados (Figura 1A y 1B, panel derecho). Además, múltiples bandas de ambos Ndc80 y Ndc10se redujeron en las células tratadas nocodazole (Figura 1C y 1D). Estos resultados muestran que la purificación de proteínas y análisis de transferencia Western descritos aquí permiten la detección de sumoylation de Ndc80 y Ndc10, como se describió previamente 9.

Para detectar la ubiquitinación de Ndc80 y Ndc10, Myc-etiquetados Ndc80 o Ndc10 se inmunoprecipitaron (IP) y Western blot se realizó con anti-Myc y anti-Ub anticuerpos (Figura 2). Análisis de extractos de células enteras (WCE) y el sobrenadante (SUP) confirmó la expresión de Ndc80-Myc y Ndc10-Myc (Figura 2A). Las bandas de bajo peso molecular en la Europa occidental y central pueden representar productos de degradación. Muestras IP sondadas con anti-Myc mostraron múltiples bandas de alto peso molecular, lo que sugiere que Ndc80 y Ndc10 contienen PTM. Un patrón de escalamiento de muestras IP sondadas con anticuerpo anti-Ub mostró que Ndc80 y Ndc10 se ubiquitinated (Figura 2A, α-Ub). El patrón de escalamiento de Ndc80 y Ndc10 se ve reforzada por el tratamiento con inhibidor del proteasoma (MG132) (Figura 2B, α-Ub), confirmando además que estas bandas representan poli-ubiqutination. Los resultados representativos revelan que tanto Ndc80 y Ndc10 son sustratos para sumoylation y ubiquitinación en S. cerevisiae y que los métodos de purificación de proteínas descritas son útiles para la detección de PTM tales como sumoylation y ubiquitinación. Según nuestro conocimiento, este es el primer informe que Ndc80 en S. cerevisiae es un sustrato para la ubiquitinación, aunque mediada por ubiquitina proteólisis de la homólogo humano Hec1 ha sido publicado previamente 11.

Figura 1
Figura 1: Purificación de sustratos sumolyated permite la identificación de proteínas cinetocoro Ndc80 y Ndc10 como sustratos SUMO Pr.oteins fueron extraídos y conjugados HF-Smt3 se prepararon y analizaron por Western blot después de la separación SDS-PAGE. (A y B) y Ndc80 Ndc10 se sumoylated. Las proteínas se extrajeron a partir de células en crecimiento logarítmico en YPD. Panel izquierdo: sustratos totales SUMO se detectaron con un anticuerpo anti-Flag. Panel derecho: se detectó sumoylated Ndc80 o Ndc10 en los conjugados HF-Smt3 cuando se sondearon con un anticuerpo anti-Myc. (C y D) Sumoylation de Ndc80 y Ndc10 se reduce en las células tratadas nocodazole. Logarítmicamente células que crecen en YPD fueron tratados con DMSO (-) o DMSO + 20 mg / ml nocodazole (+) durante 2 horas a 30 ° C. Conjugados HF-Smt3 se analizaron mediante análisis de transferencia Western usando anticuerpo anti-Myc. Cepas de levadura utilizadas son isogénicas (A y C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (Su-Bandera-SMT3 Ndc80-Myc) y (B y D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (Su-Flag-SMT3 Ndc10-Myc).

Figura 2
Figura 2:. Ubiquitination de proteínas kinetochore Ndc80 y Ndc10 Extracción de proteína e inmunoprecipitación se realizaron como se describe en el protocolo. (A) Ndc80 y Ndc10 se ubiquitinated. Las proteínas se extrajeron a partir de células en crecimiento logarítmico en YPD. Extracto de células enteras (WCE), el sobrenadante (SUP), y las fracciones inmunoprecipitadas (IP) se sometieron a SDS-PAGE. Western blots se utilizan para detectar las proteínas con etiqueta myc y ubiquitinated con anticuerpos anti-UB anti-Myc y, respectivamente. (B) La ubiquitinación de Ndc80 y Ndc10 se ha mejorado en las células tratadas con inhibidor del proteasoma MG132. Las células en crecimiento logarítmico en YPD fueron tratados con DMSO (-) o DMSO + 50 M MG132 (+) en presencia de 0,003% de SDS durante 3 horas a 30 ° C, como se describe anteriormente 13

Solución Componentes
YPD Extracto de levadura 1%, 2% Bacto-peptona, 2% de glucosa
Tampón de guanidina 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 6 M de cloruro de guanidina, M NaCl 0,5
Tampón A 50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 50 mM, 0,2% de Triton, inhibidores de proteasas 1x X-100
Tampón Breaking 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 20% de glicerol, 1 mM PMSF
Tampón de muestra SUMEB 1% SDS, 8 M urea, 10 mM MOPS pH 6,8, EDTA 10 mM, 0,01% de azul de bromofenol
Tampón de muestras Laemmli 2x MM Tris-HCl 100pH 6.8, 4% SDS, 20% de glicerol, 0,2% de azul de bromofenol (Antes del uso: añadir b-mercaptoetanol (BME) a ​​una concentración final de 200 mM)
1x TBST 137 mM de cloruro sódico, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% de Tween-20

Tabla 1: Soluciones.

Tabla 2. Cepas de levadura utilizadas en este estudio *.
Cepas Padre Genotipo Referencia
BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Abrir Biosystems
BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Abrir Biosystems
YMB7278 BY4741 / BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 Este estudio
YPH1734 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 Montpetit et al., 2006
YPH1800 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 Montpetit et al., 2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 MATa his3 leu2 ura3 trp1 ade2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80-Myc :: His3MX6 Este estudio
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 MATa his3 leu2 ura3 trp1 lys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 Este estudio
* Todas las cepas de levadura son derivados de Saccharomyces cerevisiae S288C.
Tabla 2: Cepas de levadura utilizadas en este estudio.

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Discussion

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Etiquetas de epítopo tales como HA, Myc, Flag, GST y son ampliamente utilizados para el análisis bioquímico de las proteínas. Construcción de cepas con HF-Smt3 y kinetochore proteínas etiquetadas-Myc, tales como Ndc10 y Ndc80, facilita la detección de PTM tales como sumoylation y ubiquitinación. HF-Smt3 desplegable ensayo permite la detección de proteínas cinetocoro sumoylated, Ndc10 y Ndc80 (Figura 1). El protocolo de purificación por afinidad y análisis de transferencia Western usando anticuerpo anti-Flag establecer la especificidad de la interacción entre HF-Smt3 y proteínas diana, ya que no se detectaron proteínas modificadas en la cepa control sin HF-Smt3. El uso de la etiqueta Myc en los sustratos proteicos valida la presencia de sumoylated Ndc10 y Ndc80 en los conjugados HF-Smt3. Además, sumoylation de ambos Ndc10 y Ndc80 se redujo en las células tratadas nocodazole (Figura 1C y 1D). Disminución sumoylation de Ndc10 en respuesta a treatmen nocodazolt, pero no Ndc80, se informó previamente por Montpetit et al. 9. Esto puede ser debido a diferencias en el protocolo experimental y el uso de un anticuerpo anti-SUMO personalizado. Nuestros resultados para sumoylation de sustratos kinetochore sugieren que un protocolo similar se puede utilizar para investigar otros sustratos SUMO candidato.

Para detectar ubiquitinación, proteínas cinetocoro Myc-etiquetados se inmunoprecipitaron primero y las fracciones IP se probaron con anticuerpos anti-Ub (Figura 2). Se aumentó el patrón de escalamiento de Ndc10 y Ndc80 cuando las células fueron tratadas con MG132 para inhibir la función del proteasoma (Figura 2B), lo que indica que estas proteínas son sustratos de la proteasoma. Las fracciones IP no lograron detectar la sumoilación de Ndc10 o Ndc80 en el análisis Western blot con anti-Flag o anti-Smt3 de anticuerpos (datos no mostrados). Esto puede ser debido a razones técnicas, tales como los niveles de sustrato sumoylated en la fracción de IP o la interference de las etiquetas de epítopo. Además la optimización del protocolo de IP tales como la concentración de sales y condiciones de transferencia de Western debería facilitar la detección de múltiples PTMs de cualquier proteína de interés. En la actualidad, sumoylation se detecta mejor por el HF-Smt3 desplegable de ensayo seguido de transferencias Western de los sustratos SUMO candidato (Figura 1).

Varios detalles afectan a la eficiencia de la purificación de proteínas y la capacidad de detectar la PTM. En primer lugar, todos los tubos deben mantenerse en hielo para inhibir las proteasas excepción de lo especificado. En segundo lugar, una relación 1: 1 de suspensión de células a perlas de vidrio es crítico para romper las células por el batidor de bolas y / o vórtex. La lisis celular debe ser monitoreado por el examen de las células bajo el microscopio. En tercer lugar, es muy importante preparar un lisado aclarado para el ensayo de la tracción o IP. Centrifugación velocidad corta o baja puede contribuir a la contaminación de restos celulares en el lisado y esto afecta la capacidad de détéct del PTM. Por último, agitación vigorosa de las perlas con un gran volumen de lisado claro (aproximadamente 1 ml) en un tubo de centrífuga de 1,5 ml micro asegura que las cuentas están totalmente suspendidos para el ensayo de tirar hacia abajo o IPs. En resumen, las técnicas de purificación de proteínas y de detección tales como la descrita aquí proporcionan importantes ideas mecanicistas sobre cómo PTM de las proteínas del cinetocoro afecta a su estructura y montaje para fieles la segregación de cromosomas 14, 15.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

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References

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Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80
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Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

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