Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Protein reningsteknik som möjliggör detektion av Sumoylation och ubikvitinering av knoppande jäst kinetochore Proteiner Ndc10 och Ndc80

doi: 10.3791/52482 Published: May 3, 2015

Summary

Detta manuskript beskriver upptäckten av sumoylation och ubikvitinering av kinetokoren proteiner, Ndc10 och Ndc80, i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Posttranslationella modifikationer (PTMs), såsom fosforylering, metylering, acetylering, ubiquitinering, och sumoylation, reglera den cellulära funktionen av många proteiner. PTMs av kinetokoren proteiner som associerar med centromerisk DNA förmedla trogen kromosomsegregation att upprätthålla genomet stabilitet. Biokemiska metoder såsom masspektrometri och Western blot-analys används oftast för identifiering av PTMs. Här, är en proteinreningsmetod som beskrivits som möjliggör detektering av både sumoylation och ubikvitinering av kinetochor proteiner, Ndc10 och Ndc80, i Saccharomyces cerevisiae. En stam som uttrycker polyhistidin-Flag-märkt Smt3 (HF-Smt3) och Myc-märkta Ndc10 eller Ndc80 konstruerades och användes för våra studier. För detektion av sumoylation, utarbetade vi ett protokoll för att affinitetsrena His-taggade sumoylated proteiner genom att använda nickel pärlor och används western blot-analys med anti-Myc antikropp för att detektera sumoylated Ndc10 ennd Ndc80. För detektion av ubikvitinering, utarbetade vi ett protokoll för immunfällning av Myc-märkta proteiner och används western blot-analys med anti-Ub-antikropp för att visa att Ndc10 och Ndc80 är ubiquitineras. Våra resultat visar att epitopmärkt-protein av intresse i His-flaggan märkt Smt3 stam underlättar detektionen av multipla PTMs. Framtida studier bör tillåta utnyttjande av denna teknik för att identifiera och karakterisera proteininteraktioner som är beroende av en specifik PTM.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ubiquitinering och sumoylation tillåta konjugering av ubikitin och små Ubiquitin-liknande modifierare (SUMO; Smt3 i S. cerevisiae 1) till ett målprotein, respektive. PTMs av kinetokoren proteiner påverkar deras cellulära nivåer och protein-proteininteraktioner under olika cellcykelfaser för att säkerställa trogen kromosomsegregation. Till exempel är cellulära nivåerna av Cse4 / CENP-A och yttre kinetochor protein Dsn1 regleras av ubikitin-förmedlad proteolys för att säkerställa genomet stabilitet 2-5. Destabilisering av felaktiga kinetokoren-mikrotubuli bilagor kräver Ipl1 / Aurora B-kinas, som fosforylerar Dam1 och Ndc80 komplex som direkt interagerar med mikrotubuli 6-8. Trots att identifiera över sjuttio kinetokoren proteiner, finns det mycket få studier som undersöker de modifikationer av dessa proteiner med PTMs, t.ex., ubikvitin och SUMO. En viktig begränsning är möjligheten att bevara PTMs under rening och bristen på anpassade antikroppar för detektion av PTMs såsom sumoylation, fosforylering, metylering, och andra. Karakterisering av sumoylated kinetokoren proteiner Ndc10, Cep3, Bir1 och Ndc80 utnyttjade en anpassad antikropp 9. Dessutom har Ndc10 implicerats som ett substrat för ubikitinering 10. Human Hec1 (Ndc80 i S. cerevisiae) är också substrat för ubikitinering, regleras av APC / C-hCdh1 E3 ligas 11. Därför Ndc10 och Ndc80 är goda kandidater för optimering av protokoll för att upptäcka både sumoylation och ubikvitinering i S. cerevisiae.

För att underlätta identifieringen av sumoylation, konstruerade vi stammar som uttrycker HF-Smt3 och Myc-märkta Ndc10 eller Ndc80. Användningen av epitopmärkningar (HF: His6-Flag) minimerar bakgrunden på grund av korsreaktivitet som ofta observeras i polyklonalt serum som tagits fram mot en kandidatprotein. Vi utarbetat ett protokoll för att affinitetsrena HF-Smt3 konjugat och användes sedan i handeln förekommande anti-Flag och anti-Myc-antikroppar för att detektera närvaron av sumolyated Ndc10 och Ndc80 i den renade Smt3 preparatet. För ubiquitinering, utarbetade vi en modifierad immunoprecipitation protokoll som bevarar ubikitinering av Myc-taggade kinetokoren proteiner och utförde western blot-analys med kommersiellt anti-Ub antikropp för att detektera ubikitinering av Ndc10 och Ndc80.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Tillväxt av jästceller

  1. Inokulera jästceller i 30 ml YPD (tabell 1) i en liten kolv. Inkubera vid 30 ° C över natt med skakning.
  2. Späd cellerna till en optisk densitet av 0,2 vid 600 nm (OD 600 = 0,2) i 50 ml YPD och inkubera vid 30 ° C med skakning.
  3. Odla kulturen till en optisk densitet av 1,0 vid 600 nm (OD 600 = 1,0).
  4. Centrifugera cellerna under 5 min vid 2000 xg och kassera supernatanten.
  5. Resuspendera cellpelleten i 40 ml sterilt vatten och centrifugera under 5 min vid 2000 xg för att tvätta cellerna. Kasta bort supernatanten och lagra cellpelleten vid -20 ° C.

2. Utvinning av proteiner

  1. Resuspendera cellerna i 0,5 ml iskall guanidinbuffert (tabell 1) för neddragnings analys använder Ni-NTA Superflow pärlor eller buffert A (tabell 1) för immunoutfällning. Håll rören på is hela tiden.
  2. Överföring till 2 ml skruvkapsylröret.
  3. Tillsätt samma volym av glaspärlor (tabell av material).
  4. Bead-slå cellerna i en mini bead beater (tabell av material) och 2 min vid rumstemperatur, placera sedan på is under 2-3 min. Upprepa detta tre gånger.
  5. Vortex på hög hastighet vid 4 ° C under 30-60 minuter. Kontrollera cellerna genom visualisering under mikroskop för att säkerställa att cellerna lyseras.
    Obs: lyserade celler kommer att visas som mörka spöken och saknar en gräns eller definierad form. Optimalt minst 80% av cellerna bör lyseras.
  6. Punktera ett hål i botten av röret med hjälp av en trycktapp och placera i en samling 15 ml koniskt rör (skruvlock bör vara löst).
  7. Centrifugera vid 1000 xg under 1 min för att samla lysatet.
  8. Överför lysatet till en mikro centrifugrör.
  9. Centrifugera vid 15.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C för att samla in de extraherade proteinerna.
  10. Mäta koncentrationen av de extraherade proteinerna med användning av protein assay kit (Table of Materials) och normalisera alla extrakt att innehålla samma mängd protein. Bringa den totala volymen till 1 ml med lämplig buffert.
    Obs: Omkring 5 mg totalt protein erhålls från 50 OD 600-celler.
  11. Spara 50 pl (250 mikrogram protein om den totala protein extraherat från steg 2,10 är 5 mg) som helcellextrakt (WCE). Lägg 50 pl av 2x Laemmli-provbuffert (tabell 1) och inkubera vid 100 ° C i ett värmeblock under 3-5 minuter. Fylla på 10 ul av varje prov i en SDS-PAGE gel för Western Blot-analys (avsnitt 5: Western blot-analys).

3. Rening av HF-Smt3 konjugat

  1. Skaffa Ni-NTA Superflow pärlor (Tabell of Materials) som behövs för experimenten (100 ^ pärlor per prov) efter låghastighetscentrifugering (800-1,500 xg) under 1 minut. Avlägsna supernatanten.
  2. Tvätta pärlor 5x med 1 ml PBS (Table of Materials): Vänd toppöverbotten tills pärlorna återsuspenderas, samla pärlor från låghastighetscentrifugering och avlägsna supernatanten.
  3. Suspendera pärlor i en ml guanidinbuffert (tabell 1) och delprov dem in antalet rör som motsvarar prover som skall bearbetas. Samla pärlor genom låghastighetscentrifugering, och avlägsna supernatanten. Blanda pärlorna väl genom invertering topp över botten.
    Obs: Blanda pärlorna väl genom att vända top-over botten.
  4. För varje prov, tillsätt 950 pl av den återstående WCE (från steg 2,11: Extraktion av proteiner) till 100 | il av Ni-NTA Superflow-pärlor.
  5. Inkubera på en gungande plattform vid 4 ° C under minst 4 h eller över natten.
  6. Centrifugera vid 800-1,500 xg under 1 min vid 4 ° C.
  7. Spara 50 pl som supernatant (SUP). Lägg 50 pl av 2x Laemmli-provbuffert och inkubera vid 100 ° C i ett värmeblock under 3-5 minuter. Belastning 10 | il av varje prov i en SDS-PAGE-gel för Western Blot-analys (Avsnitt 5: Western blöt anallys).
  8. Tvätta pärlor gång med 1 ml guanidinbuffert för 5-10 minuter på en gungande plattform.
  9. Tvätta pärlorna 5x med 1 ml bryta buffert (Tabell 1) under 5-10 min på en vaggande plattform.
  10. Återsuspendera pärlorna i 90 pl av 2x Laemmli-provbuffert.
  11. Lägg 10 pl av 1 M imidazol.
    Obs: Imidazol bidrar till att dissociera His-märkt protein från Ni-NTA-pärlor på grund av konkurrerande interaktion mellan imidazol och pärlorna.
  12. Inkubera vid 100 ° C i ett värmeblock under 3-5 minuter.
  13. Virvel, centrifugera sedan vid 13000 x g under 30 sek. Överför supernatanten till ett nytt rör.
  14. Belastning 10-20 pl av varje prov i en SDS-PAGE-gel för Western Blot-analys (Avsnitt 5: Western blot-analys).
    Obs: 10-20 il motsvarar 0,5-1,0 mg ingång, om 5 mg WCE används.

4. Immunoprecipitation av Myc-taggade kinetochore proteiner

  1. Skaffa anti-c-Myc agaros affinitetsgel entibody (Table of Materials) som behövs för experimenten (25 pl harts per prov) genom låghastighetscentrifugering (800-1,500 xg). Avlägsna supernatanten.
  2. Tvätta harts 5x med 1 ml buffert A: Invertera topp-over-botten tills hartset återsuspenderas, samla harts genom låghastighetscentrifugering, och avlägsna supernatanten.
  3. Suspendera hartset i en ml av buffert A och delprov dem in antalet rör som motsvarar prover som skall bearbetas. Samla harts genom låghastighetscentrifugering, och avlägsna supernatanten.
    Obs: Blanda hartset väl genom att vända top-over-botten.
  4. Lägg 950 pl av resterande WCE (från Steg 2.11: Utvinning av proteiner) till 25 pl harts.
  5. Inkubera på en gungande plattform vid 4 ° C över natten.
  6. Centrifugera vid 800-1,500 xg under 1 min vid 4 ° C.
  7. Spara 50 pl som supernatant (SUP). Lägg 50 pl av 2x Laemmli-provbuffert och inkubera vid 100 ° C i ett värmeblock under 3-5 minuter. Load 10 pl av varje prov i en SDS-PAGE-gel för Western Blot-analys (Avsnitt 5: Western blot-analys).
  8. Tvätta harts 5x med 1 ml buffert A: Invertera topp-over-botten tills hartset återsuspenderas, samla harts genom låghastighetscentrifugering, och avlägsna supernatanten.
  9. Resuspendera hartset i 100 | il SUMEB provbuffert (tabell 1).
    Obs: SUMEB provbuffert innehåller 8 M urea och 1% SDS (stark denatureringstillstånd).
  10. Inkubera vid 100 ° C i ett värmeblock under 3-5 minuter.
  11. Virvel, centrifugera sedan vid 13000 x g under 30 sek. Överför supernatanten till ett nytt rör.
  12. Belastning 10-20 pl av varje prov i en SDS-PAGE-gel för Western Blot-analys (Avsnitt 5: Western blot-analys).
    Obs: 10-20 il motsvarar 0,5-1,0 mg ingång, om 5 mg WCE används.

5. Western blot-analys

  1. Ladda proteinextrakten på 4-12% Bis-Tris-geler (Table of Materials) och perform elektrofores vid 120 V under 90 min (Running buffert: Table of Materials).
  2. Överför proteinerna från gelén till ett nitrocellulosamembran (tabell av material) med användning av en överföringsanordning vid 30 V under 90 min (transferbuffert: Tabell över Materials).
  3. Blockera membranet i 5% mjölk / 1x TBST (Tabell 1) under 1 h vid rumstemperatur.
  4. Inkubera membran med primär antikropp (Table of Materials) i 5% mjölk / 1x TBST över natten vid 4 ° C. För primära antikroppar, använd en utspädning av 1: 1000 (anti-Flag och anti-UB antikroppar) eller 1: 5000 (anti-Myc antikropp).
  5. Tvätta membran 3x under 10 minuter vardera med 1x TBST.
  6. Inkubera membran med sekundär antikropp (Table of Materials) i 5% mjölk / 1x TBST under 1 timme vid rumstemperatur. Använd en 1: 5000 utspädning av sekundära antikroppar.
  7. Tvätta membran 3x under 10 minuter vardera med 1x TBST.
  8. Inkubera membran med ECL working lösning (Table of Materials) under 5 min.
  9. Exponera membranet till blå känsliga röntgenfilm (Table of Materials) och utveckla med en automatisk utvecklare (Table of Materials).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att upptäcka sumoylation av kinetokoren proteiner Ndc80 och Ndc10, stammar med HF-Smt3 och Myc-märkta kinetokoren proteiner (Ndc80 eller Ndc10) konstruerades (tabell 2), som tidigare beskrivits 9,12. HF-Smt3 konjugaten affinitetsrenades med användning av Ni-NTA-pärlor. Western blot-analys av renat HF-Smt3 med en anti-Flag-antikropp tillät detektering av sumoylated former SUMO substrat som var frånvarande i kontrollstammen utan HF-Smt3 (Figur 1A och 1B, vänster panel). Som väntat, var flera former av SUMO substrat detekterades i HF-Smt3 stam. Vi nästa bestämmas om Ndc80 och Ndc10 är närvarande i den renade HF-Smt3 konjugatet genom att göra Western blot-analys med användning av en anti-Myc-antikropp. Flera band som var av högre molekylvikt än den hos Ndc80 eller Ndc10 tydligt detekteras (figur 1A och 1B, högra panelen). Dessutom multipla band både Ndc80 och Ndc10minskades nokodazol behandlade celler (Figur 1C och 1D). Dessa resultat visar att proteinrening och Western blot-analys som beskrivs här gör det möjligt för detektion av sumoylation av Ndc80 och Ndc10, såsom tidigare beskrivits 9.

För att detektera ubikvitinering av Ndc80 och Ndc10, Myc-tagged Ndc80 eller Ndc10 immunutfälldes (IP) och Western blot-analys utfördes med anti-Myc och anti-Ub-antikroppar (Figur 2). Analys av helcellextrakt (WCE) och supernatanten (SUP) bekräftade uttrycket av Ndc80-Myc och Ndc10-Myc (Figur 2A). De lågmolekylära banden på WCE kan representera nedbrytningsprodukter. IP-prover sonderade med anti-Myc visade flera högmolekylära band, vilket tyder på att Ndc80 och Ndc10 innehåller PTMs. En laddering mönster av IP-prover sonderade med anti-Ub-antikropp visade att Ndc80 och Ndc10 är ubiquitineras (Figur 2A, α-UB). Den laddering mönster Ndc80 och Ndc10 förstärktes genom behandling med proteasomhämmare (MG132) (Figur 2B, α-UB), vilket ytterligare bekräftar att dessa band representerar poly-ubiqutination. De representativa resultat visar att både Ndc80 och Ndc10 är substrat för sumoylation och ubikvitinering i S. cerevisiae och att de beskrivna proteinreningsmetoder är användbara för detektion av PTMs såsom sumoylation och ubikvitinering. Enligt vår kännedom, är detta den första rapporten som Ndc80 i S. cerevisiae är ett substrat för ubikitinering, även ubikitin-förmedlad proteolys av den humana homologen Hec1 har tidigare publicerats 11.

Figur 1
Figur 1: Rening av sumolyated substrat möjliggör identifiering av kinetochore proteiner Ndc80 och Ndc10 som SUMO substrat Pr.oteins extraherades och HF-Smt3 konjugat framställdes och analyserades genom Western blot-analys efter SDS-PAGE-separation. (A och B) Ndc80 och Ndc10 är sumoylated. Proteiner extraherades från logaritmiskt växande celler i YPD. Vänster panel: Totala SUMO substrat detekterades med en anti-FLAG-antikropp. Höger panel: Sumoylated Ndc80 eller Ndc10 upptäcktes i HF-Smt3 konjugat när sonderades med en anti-Myc antikropp. (C och D) Sumoylation av Ndc80 och Ndc10 reduceras i nokodazol behandlade celler. Logaritmiskt växande celler i YPD behandlades med DMSO (-) eller DMSO + 20 pg / ml nokodazol (+) for 2 h vid 30 ° C. HF-Smt3 konjugat analyserades genom Western blot-analys med användning av anti-Myc-antikropp. Isogena jäststammar som används är (A och C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Myc) och (B och D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (His-Flag-SMT3 Ndc10-Myc).

Figur 2
Figur 2:. Ubikitinering av kinetokoren proteiner Ndc80 och Ndc10 Extraktion av protein och immunutfällning utfördes såsom beskrivs i protokollet. (A) Ndc80 och Ndc10 är ubiquitineras. Proteiner extraherades från logaritmiskt växande celler i YPD. Helcellextrakt (WCE), supernatanten (SUP), och de immunfällda (IP) fraktioner utsattes för SDS-PAGE. Western blöts användes för att detektera Myc-taggade och ubiquitinerade proteiner med anti-Myc och anti-Ub-antikroppar, respektive. (B) ubiquitinering av Ndc80 och Ndc10 förstärks i celler som behandlats med proteasomhämmare MG132. Logaritmiskt växande celler i YPD behandlades med DMSO (-) eller DMSO + 50 pM MG132 (+) i närvaro av 0,003% av SDS under 3 h vid 30 ° C, såsom tidigare beskrivits 13

Lösning Komponenter
YPD 1% jästextrakt, 2% bakto-pepton, 2% glukos
Guanidinbuffert 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 6 M guanidin-klorid, 0,5 M NaCl
Buffert A 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,2% Triton X-100, 1x proteasinhibitorer
Heta buffert 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 20% glycerol, 1 mM PMSF
SUMEB provbuffert 1% SDS, 8 M urea, 10 mM MOPS pH 6,8, 10 mM EDTA, 0,01% bromfenolblått
2x Laemmli provbuffert 100 mM Tris-HClpH 6,8, 4% SDS, 20% glycerol, 0,2% bromfenolblått (Före användning: add B-merkaptoetanol (BME) till en slutlig koncentration av 200 mM)
1x TBST 137 mM natriumklorid, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% Tween-20

Tabell 1: Solutions.

Tabell 2. Jäststammar som användes i denna studie *.
Stammar Förälder Genotyp Referens
BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Öppen Biosystems
BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Öppen Biosystems
YMB7278 BY4741 / BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 URa3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 Denna studie
YPH1734 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 Montpetit et al., 2006
YPH1800 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 Montpetit et al., 2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 MATa his3 leu2 ura3 ade2 TRP1 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80-Myc :: His3MX6 Denna studie
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 MATa his3 leu2 ura3 TRP1 lys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 Denna studie
* Alla jäststammar härrör från Saccharomyces cerevisiae S288C.
Tabell 2: Jäststammar som användes i denna studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Epitopmärkningar såsom HA, Myc, sjunker, och GST används allmänt för biokemisk analys av proteiner. Konstruktion av stammar med HF-Smt3 och Myc-märkta kinetokoren proteiner, såsom Ndc10 och Ndc80 underlättar detekteringen av PTMs såsom sumoylation och ubikvitinering. HF-Smt3 dra ner analysen möjliggör detekteringen av sumoylated kinetokoren proteiner, Ndc10 och Ndc80 (figur 1). Den affinitetsreningsprotokoll och western blot-analys med användning av anti-Flag antikropp fastställa specificiteten av interaktionen mellan HF-Smt3 och målproteiner, som modifierade proteiner inte detekterades i kontrollstammen utan HF-Smt3. Användningen av myc-påhänget på proteinsubstrat validerar närvaron av sumoylated Ndc10 och Ndc80 i HF-Smt3 konjugat. Vidare sumoylation både Ndc10 och Ndc80 minskas nokodazol behandlade celler (Figur 1C och 1D). Minskad sumoylation av Ndc10 som svar på nokodazol treatment, men inte Ndc80, tidigare rapporterats av Montpetit et al. 9. Detta kan bero på skillnader i försöksprotokoll och användning av en anpassad anti-SUMO antikropp. Våra resultat sumoylation av kinetokoren substrat tyder på att en liknande protokoll kan användas för att undersöka andra kandidat SUMO substrat.

För att detektera ubikitinering ades Myc-märkta kinetokoren proteiner först immunutfälldes och IP fraktionerna sonderades med anti-Ub-antikropp (figur 2). Den laddering mönstret Ndc10 och Ndc80 ökade när cellerna behandlades med MG132 att inhibera proteasomfunktion (figur 2B), vilket indikerar att dessa proteiner är substrat av proteasomen. IP fraktionerna misslyckats med att upptäcka sumoylation av Ndc10 eller Ndc80 i western blot-analys med anti-Flag eller anti-Smt3 antikropp (data ej visade). Detta kan bero på tekniska orsaker, såsom nivåer av sumoylated substrat i IP-fraktionen eller interference från epitoppåhäng. Ytterligare optimering av IP-protokollet, såsom koncentration av salter och Western blotting-betingelser bör underlätta detektering av flera PTMs av något protein av intresse. För närvarande är sumoylation bäst detekteras av HF-Smt3 dra ner analys följt av western blöts av kandidat SUMO-substrat (Figur 1).

Flera detaljer påverka effektiviteten av proteinrening och förmågan att detektera PTMs. För det första bör alla rör hållas på is för att hämma proteaser undantag för vad som anges. För det andra, en 1: är ett förhållande av cellsuspension till glaspärlor kritiskt att sönderdela cellerna genom vulsten slagbom och / eller virvel. Cellys bör övervakas genom undersökning av cellerna under mikroskop. För det tredje är det mycket viktigt att förbereda en klarnade lysatet för pull down analysen eller IP. Kort eller låghastighetscentrifugering kan bidra till kontaminering av cellrester i lysatet och detta påverkar förmågan att DeTect den PTMs. Slutligen, kraftig skakning av kulorna med en stor volym av klart lysat (ca 1 ml) i en 1,5 ml mikrocentrifugröret gör att pärlorna är helt upphängda för rullgardins analysen eller IP-adresser. Sammanfattningsvis proteinrenings och detekteringsmetoder såsom den som beskrivs här ger viktiga mekanistiska insikter i hur PTM av kinetokoren proteiner påverkar deras struktur och montering för trogen kromosomsegregation 14, 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
Protein reningsteknik som möjliggör detektion av Sumoylation och ubikvitinering av knoppande jäst kinetochore Proteiner Ndc10 och Ndc80
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter