Introduction
Подкладка эпителия желудочно-кишечного тракта в постоянном обновлении. Этот процесс инициируется пролиферацию стволовых клеток кишечника (ISCS), которые непрерывно производят потомство быстро заменить кишечный эпителий, как это переворачивает. Пролиферативной отсека, содержащий ISCS ограничивается нижней части крипт. В ISCs привести к потомству, которое в конечном итоге дифференцироваться в пористой и секреторных линий. Перемещение из склепа и на ворсинки или поверхностного эпителия, клетки дифференцируются постепенно, поскольку они мигрируют вверх, прежде чем пилинга в просвет 1. ISCs привести к всех кишечных эпителиальных типах клеток, включая энтероцитов, микроскладкой клеток, энтероэндокринные клеток, бокаловидных клеток, клеток и пучков Paneth клеток. Толстой кишки характеризуется удлинению крипт, состоящих в основном из колоноцитов и бокаловидных клеток, с разбросанными энтероэндокринные и пучков клетки 2.
Экс естественных кульTure системы представляют собой перспективный инструмент для изучения технического обслуживания ISC-кишечного гомеостаза тканей. Тем не менее, трудно рассчитывать на ткани технологий культуры как физиологические условия не полностью воспроизведен и эпителиальных микроокружение часто изменяться 3,4. Крупным достижением в области ISC был учреждение тканевых культур для поддержания и расширения отдельных ISCs мышиные помощью определенных факторов роста, чтобы заменить нормальной кишечной сигналы нишу. Долгосрочные условия культивирования были описаны Sato и др., В которых единичные крипты или изолированные стволовые клетки кишечного эпителия расти с образованием 3-мерные эпителиальных структур, включая нескольких крипт-подобных доменов 5-7. Эти трехмерные структуры претерпевают события деления постоянно расширяться. Интересно, что все типы клеток кишечника, специфичные для ткани происхождения производятся и так экструдируют в полость 8. Использование модификации этой системы, эпителиальнойорганоиды могут быть получены из желудка, тонкой и толстой кишки. Более конкретно, эпителиальные органоиды из тонкого кишечника могут enteroids 9, и те из толстой кишки являются colonoids 9,10. Эти эпителиальные Органоид системы культуры были использованы для проверки способности изолированных одиночных клеток функционировать как стволовые клетки в пробирке, таким образом, испытания «стволовости" изолированных клеток 5,6,10-15. Другие исследователи использовали оба enteroids и colonoids для изучения функции отдельных эпителиальных клеток 16-21. Таким образом, enteroid и colonoid культуры могут быть использованы для оценки как стволовые и не стволовых клеток функции и дать новый взгляд на фундаментальные клеточные взаимодействия в кишечнике.
В 2011 году Сато и его коллеги генерируется долгосрочной культуре эпителиальных органоидам, полученных из человеческой тонкой и толстой кишки 22,23. Кроме того, различия в составе средств массовой информации, эпителиальных enteroids человекаи colonoids проявляют те же функции, как их мышиной коллегой. Кроме того, они могут быть получены из пораженных тканей, таких как пищевода Барретта, аденомы или аденокарциномы, и кистозный фиброз 22,24. Человека enteroids составляют полноценную систему для изучения кишечной стволовых клеток и эпителиальных биологии слизистой оболочки и служить в качестве нового экспериментальной системы для изучения и нормальных и аномальных желудочно-кишечного физиологию 3.
Здесь мы опишем методы для установления enteroids и colonoids от человека тонкого и толстого кишечника склепов (рисунок 1). В этой методологической обзора, мы обращаем внимание на коллекцию склеп из цельной ткани и биопсий. Резюмируем модальности культуры, которые необходимы для успешного роста и поддержания человека enteroids и colonoids и возможных экспериментальных стратегий, реализуемых этой модели.
Protocol
О себе Этика:: Учтите, что все эксперименты с использованием человеческих тканей, описанных здесь был одобрен КРП на CCHMC (IRB # 2012-2858; # 2014-0427). Информированное согласие на сбор ткани, хранения и использования образцов была получена от доноров на CCHMC.
1. Подготовка к культуре
Примечание: Все реагенты, перечисленные в таблице 1.
- Подготовка исходного раствора ЭДТА следующим образом: готовят 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты рН 8 (ЭДТА) в сверхчистой H 2 O, фильтр стерилизуют 0,22 мкм фильтр. По желанию, сохраните ЭДТА маточного раствора в РТ на неопределенный срок.
- Подготовка хелатирующую буфер следующим образом: смешать 2% сорбита, 1% сахарозы, 1% альбумина фракция бычьего сывороточного V (BSA) и 1x гентамицин / Амфотерицин решение в фосфатном Игла-солевой буфер без Ca 2+ и Mg 2+ (DPBS), фильтр стерилизуют с размером пор 0,22 мкм фильтр. Подготовка хелатирующую БУФфер свежим.
- Подготовка Wnt-3A-кондиционированной среды следующим образом: Wnt-3A-кондиционированной среды выполнен в доме с использованием клеточной линии L Wnt-3a в соответствии с инструкциями производителя (АТСС, CRL-2647). Дополнение среду с 2 мМ глутамина, 10 мМ HEPES, 100 Е / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 1 N2 добавки, добавки B27 1, 1% BSA и стерилизовать через фильтр с фильтром 0,22 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тест каждая партия для Wnt деятельности с использованием TOPflash анализа. Используйте стабильной клеточной линии HEK293 TOPflash (Hans Clevers лаборатории) с анализа люциферазы комплект Renilla в соответствии с инструкциями изготовителя. Нормализация TOPflash анализа с 100 нг / мл человеческого рекомбинантного Wnt-3A. Подтверждение по меньшей мере 10 раз, изменение активности в кондиционированной среде по сравнению с контролем. Разделить свежий Wnt-3A-кондиционированной среды в 10 мл аликвоты в 15 мл конические пробирки и замораживают при -20 ° С в течение до 6 месяцев. Магазин разморозить аликвот до 5 дней при 4 ° С без потери активности. - Prepare человека minigut среды следующим образом: Дополнение Расширенный DMEM / F12, среда с 2 мМ глутамина, 10 мМ HEPES, 100 Е / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 1 N 2 добавки, добавки B27 1, 1% BSA, и стерилизовать через фильтр с 0,22 Фильтр мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разделите свежей человеческой minigut среды в 10 мл аликвоты в 15 мл конические пробирки и заморозить при -20 ° С в течение до 3 месяцев. Магазин разморозить аликвот до 5 дней при 4 ° С без потери активности. - Подготовка полного человека minigut среды следующим образом: Подготовка свежей до крипт культуры или среднего изменения человеческого minigut среды (см 1,4) с добавлением 50% Wnt-3a-кондиционированной среды (см 1.3), 1 мкг / мл Р-spondin 1 (1: 1000 разбавление 1 мг / мл стоковый), 100 нг / мл Noggin (1: 1000 разведение 100 мкг / мл фондовом), 50 нг / мл EGF (1: 10000 разбавления 500 мкг / мл фондовом), 500 нМ-83 -01 (1: 1000 разведение в 500 м наличии), 10 мкМ SB202190 (1: 3000 разведение 30 мМ исходного), 10 нМ [Leu] 15-Гастрин 1 (1: 10000 разбавления 100 мкМАО), 10 мМ никотинамида (1: 100 разбавление 1 М маточного) и 1 мМ N-ацетилцистеин (1: 1000 разведение 1 М в наличии).
Примечание: Храните полные человека minigut СМИ до 2 дней при 4 ° С без потери активности.
2. Crypt Изоляция от цельной ткани
Примечание: Из коллекции тканей, важно поддерживать образец в физиологическом растворе. Рекомендуется, чтобы сохранить ткани на льду во время транспортировки. Подготовка образца для выделения крипты должна быть выполнена как можно быстрее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, перечисленные в таблице 1, инструментов, оборудования и расходных материалов приведены в таблице 2.
- Подготовьте все реагенты перед началом эксперимента. Оттепель базальной мембраны матрицу на льду и предварительно инкубируют-24-луночного планшета в СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы сделать тонкий слой базальной мембраны матрицы с использованием 15 мкл / лунку в центре +24Ну пластины и поместить его в CO 2 инкубаторе при 37 ° С. Это факультативный этап держит базальной мембраны матрицу в виде капли в процессе полимеризации. - Промыть ткань с ледяной Дульбекко фосфатный буферный раствор без Са 2+ и Mg 2+ (DPBS). Продолжаться до тех пор содержание DPBS не ясно.
- Использование булавки диаметром minutien 0,2 мм, закрепите ткань с силиконовым покрытием стеклянную чашку Петри со льдом холодной DPBS. Стретч и прикрепить ткань плоские с боковой слизистой оболочки вверх.
- Под микроскопом рассекает, удалите лежащего слизистую оболочку от подслизистой и соединительной ткани с помощью микро-рассечение ножницами и тонкость изогнутые щипцы (рис 2а, б).
- Стретч и пин-код расчлененный слизистой оболочки квартира на силиконовым покрытием стеклянную чашку Петри с слизистой стороной вверх. Остальные подслизистой и соединительной ткани могут быть удалены или использованы для дальнейших экспериментов (фиг.2с).
- Мягкоцарапать поверхность слизистой оболочки с изогнутыми щипцами. Этот шаг необходим для улучшения качества препарата.
- Для тонкой кишки, осторожно соскоблить слизистую оболочку, чтобы удалить ворсинки.
- Для толстой кишки, осторожно соскоблить слизистую оболочку, чтобы удалить слизистой и мусора.
- Промыть слизистой 3-4 раза охлажденным на льду буфером комплексообразования, чтобы удалить ворсинки и мусор.
- Обложка слизистую оболочку со свежеприготовленными 2 мМ ЭДТА комплексообразования буфера (200 мкл 0,5 М ЭДТА в 49,6 мл хелатной буфера).
- Поместите чашку Петри на льду и встряхивают осторожно в течение 30 мин на орбитальном шейкере горизонтальной.
- Вымойте ткани 3-4 раза с ледяной комплексообразования буфера без ЭДТА. После стирки, оставьте слизистую оболочку в ледяной комплексообразования буфера.
- Процесс слизистую оболочку при вскрытии микроскопом, используя изогнутые и тонких щипцов. Аккуратно очистить слизистую оболочку, чтобы освободить кишечных крипт, используя изогнутые щипцы.
- Аккуратно снимите склепа отстранение от чашки Петри с помощью пиPette и передавать его в 50 мл коническую трубку.
Примечание: Проверьте ткань, чтобы убедиться, что почти все склепы были удалены из слизистой оболочки. - Суспензию фильтруют склепы через 150 мкм сетки 2 раза.
Примечание: Проверьте проточного по обогащению склепа под микроскопом (рис 2D). - Центрифуга крипт суспензию 5 мин при 50 мкг, 4 ° С. Удалите супернатант.
- Ресуспендируют осадок в 5 мл ледяной комплексообразования буфера.
- Подсчитайте количество крипт на 10 мкл, падение с подвески с шага 2.15. Перевести число крипт, необходимых для обшивки до 5 мл с круглым дном трубки. Используйте от 200 до 500 склепов на лунку блюдо 24-луночного установить enteroids или colonoids.
- Центрифуга крипт фракцию течение 10 мин при 150 г, 4 ° С. Удалить супернатант.
- Используйте склепы для последующего культуры.
3. Crypt Изоляция от биопсии
- Подготовьте все реагенты доначале эксперимента. Оттепель базальной мембраны матрицу на льду и предварительно инкубируют-24-луночного планшета в СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С.
- Вымойте биопсии с ледяной фосфат Дульбекко буферный раствор без Са 2+ и Mg 2+ (DPBS).
- Использование булавки диаметром minutien 0,1 мм, закрепите биопсию с силиконовым покрытием стеклянную чашку Петри со льдом холодной DPBS. Стретч и пин-код слизистую оболочку плоский с боковой слизистой оболочки вверх (рис 2E).
- Осторожно очистить поверхность слизистой оболочки с изогнутыми щипцами, чтобы удалить ворсинки и мусор. Этот шаг необходим для улучшения качества препарата.
- Вымойте биопсии 3-4 раза ледяной комплексообразования буфером для удаления ворсинок и мусора.
- Накройте биопсии свежеприготовленного 2 мМ ЭДТА комплексообразования буфера (200 мкл 0,5 М ЭДТА в 49,8 мл хелатной буфера).
- Поместите чашку Петри на льду и встряхивают осторожно в течение 30 мин на орбитальном шейкере горизонтальной. <LI> Вымойте биопсии 3-4 раза с ледяной комплексообразования буфера без ЭДТА. После стирки, оставьте биопсию в ледяной комплексообразования буфера.
- Процесс биопсии при вскрытии микроскопом, используя изогнутые и тонких щипцов. Аккуратно очистить слизистую оболочку, чтобы освободить кишечных крипт с помощью изогнутых щипцов.
- Аккуратно снимите склепа отстранение от чашки Петри с помощью пипетки и перенести его на 50 мл коническую трубку.
Примечание: Проверьте ткань, чтобы убедиться, что почти все склепы были удалены из слизистой оболочки. - Фильтр крипт суспензию через 150 мкм нейлоновой сеткой 2 раза.
Примечание: Проверьте проточного по обогащению склепа под микроскопом. - Центрифуга крипт суспензию 5 мин при 50 мкг, 4 ° С. Удалите супернатант.
- Ресуспендируют осадок в 1 мл охлажденного льдом буфера комплексообразования. Передача крипт суспензии в 1,5 мл пробирке.
- Центрифуга крипт фракцию течение 10 мин при 150 х г, 4oC. Удалить супернатант. </ Li>
- Используйте склепы для последующего культуры.
4. Crypt культура в базальной мембране Matrix
- Использование предварительно охлажденные советы пипетки, ресуспендируют склепа гранул (начиная с шага 2,18 или 3,15) в базальной мембране матрицы (от 200 до 500 склепов / 50 мкл базальная мембрана матрицы).
- Применить 50 мкл склепа суспензии в базальной мембране матрицы на лунку на предварительно нагретой тарелке. Медленно извлечь базальной мембраны матрицу в центре ямы.
- Поместите пластину 24-луночного в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 30 мин, чтобы позволить полную полимеризацию базальной мембраны матрицы.
- Перекрытие базальной мембраны матрицу с 500 мкл полной человеческой minigut среде, дополненной 2,5 мкМ CHIR99021 (1: 4000 разведение 10 мМ исходного) и 2,5 мкМ Thiazovivin (1: 4000 разведение 10 мМ исходного).
- Инкубируйте планшет в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
- Замените среду с свежей полной Humaп minigut среду каждые 2 дня.
5. пассажи культивируемых Enteroids и Colonoids.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прохождение Enteroids и Colonoids каждые 7 до 10 дней после первоначального посева. Вообще, разделить один хорошо в 3-х до 4 скважин.
- Подготовьте все реагенты перед началом эксперимента. Оттепель базальной мембраны матрицу на льду и предварительно инкубируют-24-луночного планшета в СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С.
- Выньте материал, используя стерильные наконечники и накладки с 1 мл ледяной DPBS.
- Внесите туда и обратно с наконечником в 1000 мкл. Перенесите раствор в новом 15 мл коническую трубку.
- Добавить 2 мл человеческого minigut среды с добавлением 5% FBS в 1 мл среды.
- Центрифуга раствор в течение 5 мин при 50 мкг, 4 ° С. Удалите супернатант.
- Ресуспендируют гранул с 2 мл клеточной диссоциации фермента с добавкой 10 мкМ Y-27632 (1: 1000 разбавлением 10 мМ исходного). Выдержите в течение 5 мВ при 37 ° С в водяной бане.
- Диссоциации клеток комки с помощью 3 мл Луера шприц, снабженный 18-G заполнения / тупой иглы. Аккуратно пипетки раствор назад и вперед с помощью шприца 10 раз.
- Центрифуга суспензии в течение 5 мин при 500 х г, 4oC. Удалите супернатант.
- Использование предварительно охлажденные советы пипетки, ресуспендируют осадок клеток в базальной мембраны матрицы.
- Применить 50 мкл склепа суспензии в базальной мембране матрицы на лунку на предварительно нагретой тарелке. Медленно извлечь базальной мембраны матрицу в центре ямы.
- Поместите пластину 24-а в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 20 мин, чтобы позволить полную полимеризацию базальной мембраны матрицы.
- Перекрытие базальной мембраны матрицу с 500 мкл полной человеческой minigut среде, дополненной 10 мкМ Y-27632 (1: 1000 разбавлением 10 мМ исходного).
- Инкубируйте планшет в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
- После 2 дней, Замените носитель свежей полной человеческой minigut среде с добавлением 10 мкМ Y-27632 (1: 1000 разведение 10 мМ складе). После этого, замените носитель свежей, полной человеческой minigut среде каждый день.
6. Замораживание Искусственный Enteroids и Colonoids
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно заморозить одну скважину на 2-3 криопробирки.
- Повторите шаги 5,1 до 5,8.
- Ресуспендируют гранул с холодной среде замерзания. Передача 1 мл замораживания раствора в помечены криопробирку. Поместите криопробирку в морозильной контейнер, содержащий 500 мл изопропилового спирта.
- Передача морозильной контейнера в 80 ° C морозильнике в течение 24 ч, а затем перенести криопробирку на хранение в жидком азоте.
Примечание: Храните Enteroids и Colonoids до 1 года.
Representative Results
Рисунок 2D показан типичный пример свежевыделенных склепов из цельной ткани (рис 2D). Количество крипт, выделенных из биопсии ниже, чем в цельной ткани. Используя стандартные биопсии мощность щипцы с иглой, мы, как правило, выполняют две биопсии укусов на один проход. Каждый результаты биопсии прикус в 10 мм 2 поверхности, в среднем на 50 до 100 склепов на биопсии (рис 2F).
После культивирования в базальной мембраны матрицы, склепы округлить до формирования enterospheres для тонкой кишки и colonospheres для толстой кишки. Склеп бутонизации, как правило, происходит в течение 5 до 6 дней, после посева. Однако это не является необычным, чтобы увидеть либо enteroids (enteroids) или colonoids (colonoids), образующие сферы в базальной мембраны матрицы (рис 3A-C; Фильм 1). Пассирования может быть сделано через 7 дней, в зависимости от размера enteroids. Enteroids или colonoids были оббедных и обнищавших слоев при биопсии пройти тот же самый процесс в области культуры. Однако, как плотность крипт при посеве ниже, пассирования обычно делается после того, как от 10 до 12 дней в культуре (4а, б). Enteroids и colonoids культуры расширить воспроизводимым способом.
Оба enteroids и colonoids представить просвета сторону и выровнены с эпителием (рис 5А, В). Пролиферативные клетки можно наблюдать в enteroids и расположены в зародыше советы (5С, D). Конфокальной визуализации enteroids окрашенных E-кадгерина (ECAD) показывает, эпителиальные клетки (рис 5E).
Оба enteroids и colonoids можно установить из ткани, полученной от пациентов с генетическими / врожденных нарушений. Рисунок 6 показывает репрезентативные enteroids растущие от пациента с кистозным фиброзом (фиг.6А) и прошивной энтеропатии из-за врожденной мутацией в эпителиальных клеток объявлениемГен hesion молекула (EpCAM) (6В). Кроме генетического дефекта, в enteroids не обнаруживают различий в базальном состоянии.
Рисунок 1. Технологическая схема склепы диссоциации и генерации человека enteroids и colonoids в культуре. Гробницы (от тонкой кишки человека или толстой кишки) выделяют ЭДТА комплексообразования. Искусственный склепы образуют enteroids для тонкой кишки и colonoids для толстой кишки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Процесс Вскрытие для склепа изоляции. () Небольшой specime кишечникап растягивается и возлагали квартиру в силиконовой покрытием чашке Петри. (B) слизистой оболочки отделена от основной подслизистой. (С) рассекали слизистую оболочку растягивается и возлагали плоским в силиконовым покрытием чашке Петри. (D) После ЭДТА комплексообразования, склепы, которые отделены от ткани. (E) Один биопсия растягивается и возлагали квартиру в силиконовой покрытием чашке Петри. (F) После ЭДТА комплексообразования, склепы изолированы от биопсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Crypt культура и человек enteroid и colonoid поколения от всей ткани. () Тощей кишки склепы помещают в подвал матрицы мембраны после выделения, В склепы закрытия после 3 до 4 часов и начать на воздушном шаре, чтобы сформировать enterospheres сверх этого времени. В 7 дней, тощей enteroids образуются. (B) После выделения и культуры, подвздошной склепы ведут себя как тощей кишки склепов и образуют подвздошной enteroids. (C) крипт ободочной кишки помещают в подвал матрицы мембраны после выделения. Склепы сближаются и образуют colonoids после 7 дней (масштаб баров: 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Crypt культура и человек enteroid и colonoid поколения от биопсии. () Двенадцатиперстной кишки склепы помещают в подвал матрицы мембраны после выделения. В склепы закрытия после 3 до 4 часов и начать на воздушном шаре до beyoй на этот раз, чтобы сформировать enterospheres. В 7 дней, enteroids образуются. (B) После выделения и культуры, толстой склепы помещают в подвал матрицы мембраны. Склепы закрыть, чтобы сформировать colonospheres то colonoids после 7 дней (масштаб баров: 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Кишечные происхождений человека enteroids. () Человеческий enteroid после 6 дней в культуре. (В) гематоксилин-эозином срезы enteroids в (А) демонстрируют эпителиальной выстилки (шкала бар: 100 мкм). (CD) конфокальной визуализации enteroids после окрашивания ОБРАЗОВАНИЕ (пурпурного) показывает наличие пролиферативных клеток. (E Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. Crypt культура и enteroid поколение человек из пораженной ткани. () Enteroids, установленных с кистозным фиброзом образца. (B) Enteroids, установленных с врожденными образца тафтинговые энтеропатия (масштаб баров: 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Фильм 1. Enterosphere формирования человеческого enteroid в культуре. 32 ч временные кругове фильм показывает enterosphere, установленных с тонкой кишки человека втягивания сформировать enteroid в культуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео.
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Растворитель | Фото Концентрация | Конечная концентрация | Комментарий |
| Фосфат Дульбекко солевой буфер Ca 2+, Mg 2+ бесплатно (DPBS) | Life Technologies; Гибко | 14190-144 | - | - | 1x | |
| Этилендиамин этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) | Sigma-Aldrich | 431788 | Ultrapure дН 2 O | 2 мм | ||
| Сорбитол | Fischer Scientific | BP439-500 | DPBS | Порошок | 2% | |
| Сахароза | Fischer Scientific | BP220-1 | DPBS | Порошок | 1% | |
| Бычий сывороточный альбумин (БСА) Фракция V | Fischer Scientific | BP1600-100 | DPBS | Порошок | 1% | |
| Решение Gzntamycin / Амфотерицин B | Life Technologies; Гибко | R-015-10 | - | 500x | 1x | |
| Wnt-3A системой кондиционирования среды | в доме | - | - | - | - | |
| Расширенный DMEM / F12 | Life Technologies; Гибко | 12634-028 | - | - | - | |
| HEPES 1M | Life Technologies; Гибко | 15630-080 | - | 1 М | 10 мм | |
| GlutaMAX (глутамин) | Life Technologies; Гибко | 35050-061 | - | 100X | 1X | |
| Пенициллин-стрептомицина (10000 ЕД / мл) | Life Technologies; Гибко | 15140-148 | - | 100X | 1X | |
| N2 Дополнение | Life Technologies; Гибко | 17502-048 | - | 100X | 1X | |
| B27 Дополнение | Life Technologies; Гибко | 17504-044 | - | 50X | 1X | |
| N-ацетилцистеин | Sigma-Aldrich | A9165-5G | DPBS | 1 М | 1 мм | </ TD> |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | DPBS | 1 М | 10 мм | |
| Matrigel, СКФ, фенол бесплатно (базальная мембрана матрица) | Corning | 356231 | - | - | - | НЕОБХОДИМЫЕ |
| рекомбинантный Noggin человек | R & D | 6057-NG / CF | DPBS | 100 мкг / мл | 100 нг / мл | Другие поставщики: R & D; AnaSpec и Preprotech |
| человеческий рекомбинантный R-Spondin | Preprotech | 120-38 | DPBS | 1 мг / мл | 1 мкг / мл | |
| рекомбинантный EGF человек | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | ППД | 500 мкг / мл | 50 нг / мл | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | DPBS | 10 мм | 10 мкМ | |
| -83-01 | Tocris | 2939 | ДМСО | 500 мкМ | 500 нМ | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | ДМСО | 30 мм | 10 мкМ | |
| человек [Leu] 15-Гастрин 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | DPBS | 100 мкМ | 10 нМ | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | ДМСО | 10 мм | 2,5 мкм | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | ДМСО | 10 мм | 2,5 мкм | |
| TrypLE Экспресс фермента (1X), фенол красный (диссоциации клеток фермент) | Life Technologies; Гибко | 12605-010 | - | - | - | Для пассирования |
| Фетальной бычьей сыворотки | Life Technologies; Гибко | 10082-147 | - | - | - | Для пассирования |
| CTS Synth--Фриз Средний (замораживание среда) | Life Technologies; Гибко | A13713-01 | - | - | - | Для замораживания |
| L Wnt-3A клеточная линия | ATCC | CRL-2647 | - | - | - | Wnt-3A системой кондиционирования медиа-продукции |
| Renilla люциферазы анализ | Promega | E2710 | - | - | - | Wnt-3A системой кондиционирования деятельность СМИ |
| человеческий рекомбинантный Wnt-3A | R & D | 5036-WN / CF | DPBS | 100 мкг / мл | 100 нг / мл | |
| Клеточной линии HEK293 TOPflash | - | - | - | - | - | Wnt-3A системой кондиционирования деятельность СМИ; Подарок от Hans Clevers лаборатории |
Таблица список 1. Подробное реагент с предпочтительным производителя и номер по каталогу.
| Оборудование | Потребляемый | Инструменты |
| Ламинаре | 15- и 50 мл конических пробирок | Дюмон # 5 стандартных щипцы (ФСТ; # 11251-20) |
| CO 2 инкубатор | Микрофужную трубы | Дюмон # 7, изогнутые тонкие щипцы (ФСТ; # 11274-20) |
| Стерео-микроскоп | 24-луночные планшеты | Изобразительное ножницы (ФСТ; # 14060-09) | 0,22 мкм фильтры (Sartorius) | Vännäs весенние ножницы (ФСТ; # 15018-10) |
| Орбитальный шейкер | Серологические пипетки | Контакты диаметр minutien 0,2 мм (ФСТ; # 26002-20) |
| Замораживание контейнер (Nalgene) | Советы микропипетка | Контакты диаметр minutien 0,1 мм (ФСТ; # 26002-10) |
| Sylgard 184 Силиконовые (Dow Corning) | 150 мкм сетки отверстия, нейлон скрининга (Dynamic Aqua-питания) | |
| Стекло Петри | 5 мл с круглым дном полипропиленовые трубы (Falcon) | |
| Серологические пипетки | 18G тупой заполнения иглы (BD) | |
| Микропипетки | 3 мл lsyringes с советами Luer-Lock (BD) | |
| Криопробирки |
Discussion
Этот метод обеспечивает полную систему воспроизведения кишечного эпителия клоны и эпителиальные динамику, что является полезным инструментом для изучения эпителия кишечника биологии. Метод, представленный здесь было приспособлено от первоначального мышей исследования Сато и Clevers 22, который эффективно приводит в человеческих enteroids и colonoids. Здесь мы вручную взял склепы микродиссекции, чтобы избежать каких-либо клеточные загрязняющие вещества. Этот метод позволяет прямую визуализацию склепов и приводит к консистенции овертайме по сравнению с оригинальной коллекции склепа на "встряхивания". Другие группы разработали аналогичные технику, используя несколько различных подходов, особенно, заменяющие хелирование ЭДТА коллагеназы 25. Кроме того, различия в склепе коллекции, эти техники использовать определенный носитель, необходимый для выращивания человеческих enteroids в культуре 22. Для повышения эффективности роста на склеп посева, добавить ингибитор GSK3 (CHIR99021)в течение первых двух дней 12.
Обработка ткани или биопсии является важным и выделение крипт должна быть выполнена, как только ткани поступает в лаборатории. Тем не менее, выделение задержкой крипт и культуры могут быть выполнены до 24 ч после сбора ткани (данные не показаны), как описано выше для мышиного ткани 26. Кишечного ткани должны быть помещены в конической трубе, заполненной полностью DPBS, чтобы избежать разрушение ткани и должны быть сохранены при 4 ° С. Задержка подготовка позволяет ткани доставки, но изменение температуры следует избегать во время транспортировки. Общее время, необходимое для начального склепа покрытия составляет примерно 2 ч с 15 до 30 мин для обработки ткани и от 1 до 2 ч, чтобы изолировать и пластины склеп. Микродиссекции из ткани критическим фактором и предикат чистой подготовки склепа. Тем не менее, крипты выпуск путем встряхивания вручную, как описано в различных протоколах можно 22,23.
Несмотря на сходство с мышиным enteroid (enteroids) системы, человека enteroids требуют специфических молекул для повышения и поддержания их роста с течением времени. Факторы роста, EGF, Noggin, R-spondin используются так же, как в мышиных эпителиальных органоидам. Тем не менее, использование Wnt-3А имеет решающее значение. Мы отметили, что формирование, а также эффективность роста больше, с помощью Wnt-3a кондиционированной среды, чем рекомбинантного белка человека. Одновременно, мы продемонстрировали улучшение условий культивирования с использованием ингибитора в гликоген-синтазы-киназы 3 (CHIR99021) 12. Рекомбинантные факторы роста могут быть заменены Wnt-3А, R-spondin и Noggin условно-средах. Wnt-3A-экспрессирующих линии L-клеток является коммерчески доступным (АТСС). Другие группы разработали R-spondin 1- 23,27, Noggin- 19, и Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 клеточных линий, экспрессирующих. Два низкомолекулярные ингибиторы используются в культуре яДиаметр и необходимы для поддержания культуры 29. -83-01 представляет собой селективный ингибитор трансформирующего фактора роста β и активин / Узловые рецепторы (активин-киназы, как 4, 5, 7) и SB202190 является р38 митоген-активированный протеин-киназы (МАРК). Оба ингибитора были использованы соответственно для поддержания человеческой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки самообновлению и установить человека наивных плюрипотентных стволовых клеток 30-32. Кроме того, никотинамид, предшественник никотинамидадениндинуклеотида, необходим для поддержания enteroids и расширение colonoids в долгосрочной образом 22,29.
ЭДТА комплексообразования важный шаг, поскольку он определяет выход из препарата склепа. Мы добились успеха в лечении 2 мМ ЭДТА. Тем не менее, концентрация ЭДТК может быть изменена от 2 мм до 15 мм относительно вида ткани. В этом случае, время инкубации должен быть определены эмпирически. После первоначального посева, склеп будет округлить-Uр и в конечном итоге образуют enteroids. Тем не менее, enteroids или colonoids часто демонстрируют "Стебли" фенотип, формируя сферы, практически не дифференцированных клеток. В этом случае, дифференцировка может быть инициирована путем удаления Wnt-3a, никотинамид и ингибитор р38 МАРК. Использование ингибитора Notch, таких как DAPT или DBZ помогает повышению дифференциации внутри enteroids 22.
Эта модель повторяет кишечника физиологию с постоянным Crypt-почкованием событий, связанных с купе стволовых клеток, а также ворсинок, как эпителиальных доменов, содержащих как поглощательной и секреторной дифференцированы линий. Интересно, что эта система не содержит каких-либо мезенхимальные клетки и использует специфические условия медиа для удовлетворения требований ниша сигнала.
Как мышиной модели, человека enteroids могут быть получены из отдельных эпителиальных клеток кишечника, чтобы проверить способность этих клеток функционировать в качестве стволовых клеток. SeveRAL исследования использовали кластер маркеров дифференцировки (CD44, CD24 или CD166) и EphB2 позитивных клеток для обогащения клеток с помощью стволовых свойств 12,23,33. Вместе, эти исследования показывают полезность человека enteroids культур для тестирования стволовости. Другие исследователи используют эту модель для изучения кишечных заболеваний, таких как инфекционные желудочно-кишечных заболеваний, кистозный фиброз, или колоректального рака 22,34-37. Эти исследования показывают, что человека enteroids являются надежным модели заболевания человека с возможностью двигаться в направлении персонализированной скрининга. Человека enteroids может быть генетически модифицирована с помощью трансфекции ДНК или инфекции вирусных частиц 38. Это обеспечивает мощный инструмент для изучения функций генов конкретного в эпителиальных органоидов человека или правильных генетических мутаций. Недавно Schwank и его коллеги показали возможность редактировать геном с CRISPR / системы Cas9 и исправить мутацию гена CFTR, вызывающей переменного токаystic фиброз 24. Человека enteroids составляют полноценную систему для изучения кишечной стволовых клеток и эпителиальных биологии слизистой оболочки и служить в качестве нового экспериментальной системы для изучения и нормальных и аномальных желудочно-кишечного тракта физиологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | |
| Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Fischer Scientific | BP1600-100 | |
| Gzntamycin/Amphotericin B solution | Life technologies; Gibco | R-015-10 | |
| Wnt-3A conditioned medium | in house | ||
| Advanced DMEM/F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 | |
| HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 | |
| GlutaMAX (glutamine) | Life technologies; Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies; Gibco | 15140-148 | |
| N2 Supplement | Life technologies; Gibco | 17502-048 | |
| B27 Supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| human recombinant Noggin | R&D | 6057-NG/CF | |
| human recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 | |
| human recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | |
| human [Leu]15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) | Life technologies; Gibco | 12605-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 | |
| CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 | |
| L Wnt-3A cell line | ATCC | CRL-2647 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2710 | |
| human recombinant Wnt-3A | R&D | 5036-WN/CF | |
| HEK293 TOPflash cell line |
References
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).
- Shroyer, N. F., Kocoshis, S. Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases. Hyams, J. R. W. III , Elsevier. 324-336 (2010).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. , (2014).
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).
- Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).
- Furstenberg, R. J., et al. Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).
- Wang, F., et al. Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay. Gastroenterology. , (2013).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).
- Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Akcora, D., et al. The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche. Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).
- Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
- Lau, W., et al. Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts. Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. , (2014).
- Fuller, M. K., et al. Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage. Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Koo, B. K., Clevers, H. Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5. Gastroenterology. , (2014).
- Li, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).
- Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).
- Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med (Maywood). , (2014).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Kovbasnjuk, O., et al. Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S3 (2013).
- Fujii, M., Sato, T. Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research. Front Genet. 5, 169 (2014).
- Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. Retroviral gene expression control in primary organoid cultures. Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).
