Introduction
אפיתל הרירית של מערכת העיכול הוא בהתחדשות מתמדת. תהליך זה מופעל על ידי התפשטות של תאי גזע במעי (ISCs) אשר ברציפות לייצר צאצאים להחליף במהירות אפיתל במעי כפי שמתברר מעל. תא השגשוג המרכיב את ISCs מוגבל לחלקו התחתון של מאורות. ISCs להצמיח צאצאים שסופו של דבר להתמיין הקליטה או שושלות הפרשה. נע אל מחוץ לקריפטה ועל האפיתל הסיסי או משטח, תאים להבחין בהדרגה כפי שהם נודדים כלפי מעלה לפני הקילוף לתוך הלום 1. ISCs להצמיח כל סוגי תאי אפיתל במעי כוללים enterocytes, תאי microfold, תאי enteroendocrine, תאי גביע, תאי ציצה ותאי פנט. המעי הגס מאופיין מאורות מוארכים מורכבים בעיקר מcolonocytes ותאי גביע, עם enteroendocrine המפוזר ותאי ציצה 2.
Vivo לשעבר רחוב ללא מוצאמערכות מכשור מהוות כלי מבטיח ללימוד תחזוקת ISC והומאוסטזיס רקמת מעי. עם זאת, קשה להסתמך על טכנולוגיות תרבית רקמה כתנאים פיסיולוגיים אינם לשכפל באופן מלא ומייקרו-סביבת אפיתל לעתים קרובות שינה 3,4. התקדמות גדולה בתחום ISC הייתה הקמתה של טכניקות תרבית רקמה כדי לשמור ולהרחיב ISCs העכברי בודד באמצעות גורמי גדילה הגדירו להחליף את אותות נישה מעיים הרגילים. תנאי תרבות לטווח ארוך תוארו על ידי אל סאטו et., שבו מאורות בודדים או תאי גזע מבודדים מאפיתל במעי לגדול כדי ליצור מבני אפיתל 3 ממדים כוללים תחומים כמו קריפטה-מרובים 5-7. מבני tridimensional אלה עוברים אירועי ביקוע להרחיב ברציפות. מעניין, כל סוגי תאי המעיים ספציפיים לרקמת המוצא מיוצרים וגם נמתחים לתוך לומן 8. באמצעות שינויים במערכת זו, אפיתליכול להיות שנוצר organoids מהקיבה, המעי הדק והמעי הגס. באופן ספציפי יותר, organoids אפיתל מהמעי הדק הם enteroids 9, ואלה מהמעי הגס הם colonoids 9,10. מערכות התרבות אלה אפיתל organoid היו בשימוש על מנת לבחון את היכולת של תאים בודדים מבודדים לתפקד כתאי גזע במבחנה, ובכך בודקים את "stemness" של תאים מבודדים 5,6,10-15. חוקרים אחרים השתמשו בשני enteroids וcolonoids ללמוד את הפונקציה של תאי האפיתל פרט 16-21. כך, ניתן להשתמש בתרבויות enteroid וcolonoid להעריך את שני פונקציות הגזע ותאים הלא-גזע ולתת תובנה חדשה אינטראקציות הסלולר יסודיות בתוך המעיים.
בשינה 2011, סאטו ועמיתים נוצרו תרבות לטווח הארוך של organoids אפיתל נגזר ממעי דק ומעי גס אנושיים 22,23. מלבד הבדלים בהרכב תקשורת, enteroids אפיתל האדםוcolonoids להפגין את אותן תכונות כמו עמיתו העכברי שלהם. יתר על כן, הם יכולים להיות שנוצרו מרקמות חולות כגון הוושט, אדנומה בארט או אדנוקרצינומה, וסיסטיק פיברוזיס 22,24. enteroids האנושי מהווה מערכת רבת ערך כדי ללמוד בתאי גזע במעי וביולוגיה רירית אפיתל וישמש כמערכת ניסיונית רומן ללמוד פיזיולוגיה של מערכת העיכול הן נורמלית ולא נורמלית 3.
כאן אנו מתארים שיטות להקים enteroids וcolonoids ממעי דק אנושי ומאורות מעי גס (איור 1). בסקירה מתודולוגית זו, אנו מדגישים את אוסף קריפטה מכל רקמה וביופסיות. אנחנו לשחזר את שיטות התרבות שהם חיוניים לצמיחה והתחזוקה של enteroids האדם וcolonoids והאסטרטגיות הניסיוניות האפשריים שבוצעו על ידי מודל זה מצליח.
Protocol
הצהרת אתיקה:: הערה כל הניסויים באמצעות רקמות אנושיות המתוארות במסמך זה אושר על ידי IRB בCCHMC (IRB # 2012-2858; # 2,014-0,427). הסכמה מדעת לאיסוף רקמות, אחסון, ושימוש בדגימות התקבלה מהתורמים בCCHMC.
1. הכנה לתרבות
הערה: כל חומרים כימיים מפורטים בטבלה 1.
- הכן פתרון מניות EDTA כדלקמן: להכין 0.5 חומצת ethylenediaminetetraacetic M, pH 8 (EDTA) בH 2 O ultrapure, המסנן מעוקר עם 0.22 מיקרומטר סינון. לחלופין, לאחסן פתרון מניות EDTA בRT ללא הגבלת זמן.
- הכן חיץ chelating כדלקמן: לערבב סורביטול 2%, סוכרוז 1%, 1% V חלק אלבומין בסרום שור (BSA) ו1x גנטמיצין / פתרון Amphotericin בפוספט של Dulbecco שנאגרו מלוח ללא Ca 2 + ו Mg 2 + (DPBS), מסנן מעוקר עם 0.22 מיקרומטר סינון. הכן את buf chelatingטרי fer.
- הכן Wnt-3A מיזוג בינוני כדלקמן: בינוני מזגן Wnt-3A הוא עשה בבית באמצעות שורת תאי L Wnt-3A על פי הוראות היצרן (ATCC, CRL-2647). להשלים בינוני עם 2 גלוטמין מ"מ, 10 מ"מ HEPES, 100 U / ml פניצילין, 100 ג '/ מיליליטר סטרפטומיצין, 1 מוסף N2, תוספת 1 B27, BSA 1% ומסנן מעוקרים עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
הערה: מבחן כל אצווה לפעילות Wnt באמצעות assay TOPflash. השתמש בשורת תאי HEK293 TOPflash יציבה (מעבדה הנס Clevers) עם ערכת assay בלוציפראז Renilla לפי הוראות היצרן. לנרמל את assay TOPflash עם 100 ng / Wnt-3A רקומביננטי האנושי מיליליטר. אשר לפחות פעילות מתקפל שינוי 10 של התקשורת המותנה בהשוואה לשליטה. לחלק בינוני מזגן Wnt-3A טרי לתוך 10 aliquots מיליליטר ב 15 מיליליטר צינורות והקפאת חרוטי ב -20 ° C עד 6 חודשים. חנות מופשרת aliquots עד 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס ללא הפסד של פעילות. - Prepare בינוני minigut אדם כדלקמן: תוספת מתקדם DMEM F12 בינוני / עם 2 גלוטמין מ"מ, 10 מ"מ HEPES, פניצילין 100 U / mL, 100 גר '/ סטרפטומיצין מ"ל, תוספת 1 N2, תוספת 1 B27, BSA 1% ומסנן מעוקר עם 0.22 מסנן מיקרומטר.
הערה: חלק בינוניים minigut אנושי טרי לתוך 10 aliquots מיליליטר ב 15 מיליליטר צינורות והקפאת חרוטי ב -20 ° C עד 3 חודשים. חנות מופשרת aliquots עד 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס ללא הפסד של פעילות. - הכן בינוני minigut אדם שלם כדלקמן: הכן טרי לפני תרבות קריפטה או בינוני minigut האנושי שינוי בינוני (ראה 1.4) בתוספת 50% בינוניים Wnt-ממוזג 3A (ראו 1.3), 1 מיקרוגרם / מיליליטר R-spondin 1 (1: 1000 דילול של 1 מ"ג / מיליליטר מניות), 100 מיליליטר Noggin / ng (1: 1,000 דילול של 100 ג '/ מ"ל מניות), 50 ng / mL EGF (1: 10,000 דילול של 500 מיקרוגרם / מ"ל מניות), 500 ננומטר-83 -01 (1: 1,000 דילול של 500 M מלאי), 10 מיקרומטר SB202190 (1: 3,000 דילול של 30 מניות מ"מ), 10 ננומטר [Leu] 15-Gastrin 1 (דילול 1: 10,000 של 100 מיקרומטרהמניה), 10 מ"מ Nicotinamide (1: מניית 100 דילול של 1 M) ו -1 מ"מ N-acetylcysteine (1: 1,000 דילול של מניות 1 M).
הערה: תקשורת חנות מלאה אדם minigut עד 2 ימים בC ° 4 ללא הפסד של פעילות.
2. בידוד קריפטה משלמות רקמות
הערה: מתוך אוסף הרקמות, זה חיוני כדי לשמור על המדגם במלח. מומלץ לשמור על הרקמה על קרח במהלך הובלה. הכנת המדגם לבידודה של קריפטה צריכה להתבצע בהקדם האפשרי.
הערה: כל המגיבים רשומים בטבלה 1, כלים, ציוד, וחומרים המפורטים בטבלה 2.
- הכן את כל חומרים כימיים לפני תחילת הניסוי. להפשיר את מטריצת קרום במרתף על קרח ומראש דגירה צלחת 24 גם בחממה CO 2 על 37 מעלות צלזיוס.
הערה: לחלופין לעשות שכבה דקה של מטריצת קרום במרתף באמצעות 15 μl / גם במרכז 24צלחת "טוב ולמקם אותו בחממה CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. צעד פקולטטיביים זה שומר את מטריצת הקרום במרתף כמו ירידה בפילמור. - שטוף את הרקמה עם קרח קר פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוח ללא Ca 2 + ו Mg 2 + (DPBS). המשך עד התוכן של DPBS ברור.
- באמצעות 0.2 מ"מ סיכות קוטר minutien, לאבטח את הרקמה על צלחת פטרי מצופי סיליקון זכוכית מלאה DPBS קר כקרח. למתוח ולהצמיד הרקמה שטוחה עם הצד הרירי פונה כלפי מעלה.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, להסיר את הרירית שמעליה מsubmucosa ורקמת חיבור באמצעות מספריים מיקרו לנתח ומלקחיים מעוקלים נקודה עדינה (איור 2 א, ב).
- למתוח ולהצמיד גזור רירית שטוחה בצלחת פטרי מזכוכית מצופה סיליקון עם הצד הרירי פונה כלפי מעלה. Submucosa שנותר ורקמת חיבור יכולים להיות מושלך או המשמשים לניסויים נוספים (איור 2 ג).
- בעדינותלגרד את פני השטח של הרירית עם מלקחיים מעוקלים. צעד זה הוא הכרחי כדי לשפר את האיכות של התכשיר.
- למעי דק, בעדינות לגרד את הרירית להסיר את villi.
- למעי גס, בעדינות לגרד את הרירית להסיר רירי ופסולת.
- שטוף את הרירית 3-4 פעמים עם חיץ קלאציה קר כקרח כדי להסיר villi ופסולת.
- מכסה את הרירית עם חיץ מוכן טרי 2 המ"מ EDTA קלאציה (200 μl 0.5 M EDTA ב49.6 מיליליטר חיץ קלאציה).
- מניחים את צלחת פטרי על קרח וללחוץ בעדינות במשך 30 דקות על שייקר מסלולית אופקית.
- שטוף את הרקמה 3-4 פעמים עם חיץ קלאציה קר כקרח ללא EDTA. לאחר כביסה, לעזוב את הרירית במאגר קלאציה קר כקרח.
- לעבד את הרירית תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מלקחיים מעוקלים ודקים. בעדינות לגרד את הרירית לשחרר מאורות מעיים באמצעות המלקחיים המעוקלים.
- הוצא בעדינות את ההשעיה קריפטה מצלחת פטרי באמצעות pipette ולהעביר אותו לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר.
הערה: לבדוק את הרקמות כדי לוודא שכמעט כל מאורות הוסרו מהרירית. - סנן את ההשעיה מאורות דרך 150 מיקרומטר רשת 2 פעמים.
הערה: לבדוק את הזרימה דרך להעשרת קריפטה תחת מיקרוסקופ (איור 2 ד). - צנטריפוגה דקות השעיה 5 קריפטה ב 50 XG, 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant.
- Resuspend גלולה ב 5 מיליליטר חיץ קלאציה קר כקרח.
- לספור את מספר מאורות לירידה של 10-μl מההשעיה מהצעד 2.15. העבר את מספר מאורות הדרושים לציפוי ל5 מיליליטר צינור מסביב לתחתית. השתמש 200 עד 500 מאורות לכל טוב של צלחת 24 גם להקים enteroids או colonoids.
- צנטריפוגה חלק קריפטה במשך 10 דקות ב 150 גרם, 4 ° C. הסר את supernatant.
- השתמש מאורות לתרבות שלאחר מכן.
3. בידוד קריפטה מביופסיה
- הכן את כל חומרים כימיים לפניתחילת הניסוי. להפשיר את מטריצת קרום במרתף על קרח ומראש דגירה צלחת 24 גם בחממה CO 2 על 37 מעלות צלזיוס.
- שטוף את הביופסיה עם קרח קר פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוח ללא Ca 2 + ו Mg 2 + (DPBS).
- באמצעות 0.1 מ"מ סיכות קוטר minutien, לאבטח את הביופסיה בצלחת פטרי מצופי סיליקון זכוכית מלאה DPBS קר כקרח. למתוח ולהצמיד את הרירית שטוחה עם הצד הרירי פונה כלפי מעלה (איור 2E).
- בעדינות לגרד את פני השטח של הרירית עם מלקחיים מעוקלים כדי להסיר villi ופסולת. צעד זה הוא הכרחי כדי לשפר את האיכות של התכשיר.
- שטוף את הביופסיה 3-4 פעמים עם חיץ קלאציה קר כקרח כדי להסיר villi ופסולת.
- מכסה את הביופסיה עם חיץ מוכן טרי 2 המ"מ EDTA קלאציה (200 μl 0.5 M EDTA ב49.8 מיליליטר חיץ קלאציה).
- מניחים את צלחת פטרי על קרח וללחוץ בעדינות במשך 30 דקות על שייקר מסלולית אופקית. <li> לשטוף את הביופסיה 3-4 פעמים עם חיץ קלאציה קר כקרח ללא EDTA. לאחר כביסה, לעזוב את הביופסיה במאגר קלאציה קר כקרח.
- לעבד את הביופסיה תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מלקחיים מעוקלים ודקים. בעדינות לגרד את הרירית כדי לשחרר את מאורות מעיים באמצעות מלקחיים מעוקלים.
- הוצא בעדינות את ההשעיה קריפטה מצלחת פטרי בעזרת פיפטה ולהעביר אותו לצינור חרוטי 50 מיליליטר.
הערה: לבדוק את הרקמות כדי לוודא שכמעט כל מאורות הוסרו מהרירית. - סנן את ההשעיה קריפטה דרך ניילון 150 מיקרומטר רשת 2 פעמים.
הערה: לבדוק את הזרימה דרך להעשרת קריפטה תחת מיקרוסקופ. - צנטריפוגה דקות השעיה 5 קריפטה ב 50 XG, 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant.
- Resuspend גלולה במאגר קלאציה קר כקרח 1 מיליליטר. מעביר את ההשעיה קריפטה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge.
- צנטריפוגה חלק קריפטה במשך 10 דקות ב 150 XG, 4 ° C. הסר את supernatant. </ Li>
- השתמש מאורות לתרבות שלאחר מכן.
4. קריפטה תרבות בממברנה מטריקס מרתף
- בעזרת הטיפים pipet מראש צונן, resuspend גלולה קריפטה (משלב 2.18 או 3.15) במטריצת קרום במרתף (200 עד 500 מאורות / מטריצת קרום במרתף 50 μl).
- החל 50 μl של ההשעיה קריפטה במטריצת קרום במרתף לכל גם על הצלחת המחוממת מראש. לאט לאט להוציא את מטריצת קרום במרתף במרכז הבאר.
- מניחים את צלחת 24 גם ב37 ° C, חממה 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור של מטריצת הקרום במרתף מלא.
- כיסוי מטריצת הקרום במרתף עם 500 μl של מדיום minigut האנושי מלא בתוספת 2.5 מיקרומטר CHIR99021 (1: 4,000 דילול של 10 מניות מ"מ) ו -2.5 מיקרומטר Thiazovivin (1: 4,000 דילול של 10 מניות מ"מ).
- דגירה את הצלחת ב37 ° C, חממה 5% CO 2.
- החלף את המדיום עם הומא מלא טריn minigut בינוני כל 2 ימים.
5. Passaging של התרבית Enteroids וColonoids.
הערה: מעבר Enteroids וColonoids כל 7 עד 10 ימים לאחר ציפוי ראשוני. בדרך כלל, לפצל אחד גם לתוך 3-4 בארות.
- הכן את כל חומרים כימיים לפני תחילת הניסוי. להפשיר את מטריצת קרום במרתף על קרח ומראש דגירה צלחת 24 גם בחממה CO 2 על 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את המדיה באמצעות טיפים וכיסוי סטרילי עם 1 מיליליטר של DPBS קר כקרח.
- פיפטה הלוך ושוב עם קצה 1,000 μl. מעביר את הפתרון בצינור חרוטי 15 מיליליטר חדש.
- הוסף 2 מיליליטר של מדיום minigut אדם בתוספת 5% FBS לכל 1 מיליליטר של מדיום.
- צנטריפוגה הפתרון במשך 5 דקות ב 50 XG, 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant.
- Resuspend גלולה עם 2 מיליליטר של אנזים התא דיסוציאציה בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (דילול 1: 1000 של 10 מניות מ"מ). דגירה של 5 מ 'בשעת 37 ° C במי אמבטיה.
- לנתק את גושי תאים באמצעות מזרק 3 מיליליטר luer נעילה מצויד במילוי / מחט קהה 18-G. בעדינות פיפטה הפתרון קדימה ואחורה באמצעות המזרק 10 פעמים.
- צנטריפוגה ההשעיה למשך 5 דקות ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant.
- בעזרת הטיפים pipet מראש צונן, resuspend התא גלולה במטריצת קרום במרתף.
- החל 50 μl של ההשעיה קריפטה במטריצת קרום במרתף לכל גם על הצלחת המחוממת מראש. לאט לאט להוציא את מטריצת קרום במרתף במרכז הבאר.
- מניחים את צלחת 24 גם ב37 ° C, חממה 5% CO 2 במשך 20 דקות, כדי לאפשר פילמור של מטריצת הקרום במרתף מלא.
- כיסוי מטריצת הקרום במרתף עם 500 μl של מדיום minigut האנושי מלא בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (דילול 1: 1000 של 10 מניות מ"מ).
- דגירה את הצלחת ב37 ° C, חממה 5% CO 2.
- לאחר 2 ימים, להחליף בינוני עם בינוני minigut אדם שלם טרי בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (1: 1,000 דילול של 10 מניות מ"מ). לאחר מכן, להחליף בינוני עם בינוני טרי, מלא minigut אדם בכל יום אחר.
6. ההקפאה המתורבתת Enteroids וColonoids
הערה: בדרך כלל להקפיא גם אחד ל2-3 cryovials.
- חזור על שלבים 5.1-5.8.
- Resuspend גלולה עם מדיום הקפאה קר. העברה 1 מיליליטר של הקפאת פתרון לכותרת cryovial. הנח את cryovial במכל הקפאה המכיל 500 מיליליטר של אלכוהול איזופרופיל.
- העבר את מיכל ההקפאה במקפיא C ° 80 במשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר cryovial לאחסון חנקן נוזלי.
הערה: Enteroids החנות וColonoids עד 1 שנה.
Representative Results
איור 2 ד מציג דוגמא טיפוסית של מאורות מבודדים טרי מכל הרקמה (איור 2 ד). מספר מאורות המבודדים מביופסיה הוא נמוך יותר מאשר בכל רקמות. בעזרת מלקחיים ביופסית היכולת תקניים עם מחט, אנחנו בדרך כלל לבצע שתי עקיצות ביופסיה במעבר אחד. כל תוצאות ביופסית נגיסה בשטח 10 מ"מ 2 עם ממוצע של 50 עד 100 מאורות לביופסיה (איור 2F).
אחרי התרבות במטריצת קרום במרתף, מאורות לאסוף כדי ליצור enterospheres למעי דק ומעי גס colonospheres ל. קריפטה ניצנים מתרחשת בדרך כלל בתוך 5-6 ימים, לאחר זריעה. עם זאת, הוא לא יוצא דופן לראות גם enteroids (enteroids) או colonoids (colonoids) יוצר כדורים במטריצת הקרום במרתף (איור 3 א-C; 1 סרט). Passaging יכול להיעשות לאחר 7 ימים, תלוי בגודל של enteroids. Establ enteroids או colonoidsished מביופסיות לעבור את אותו פיתוח בתרבות. עם זאת, כפי שצפיפות קריפטה בזריעה נמוכה, passaging נעשה בדרך כלל לאחר 10 עד 12 ימים בתרבות (איור 4 א, ב). Enteroids ותרבויות colonoids להרחיב באופן לשחזור.
enteroids וcolonoids שניהם להציג צד luminal וצופה אפיתל (איור 5 א ', ב'). ניתן להבחין בתאי שגשוג בתוך enteroids ונמצאים בתוך הטיפים הניצן (איור 5 ג, ד). הדמיה של Confocal enteroids מוכתם בE-cadherin (ECAD) מציגה את תאי אפיתל (איור 5E).
ניתן להקים מהרקמה המתקבלת מחולים עם הפרעות גנטיות / מולדים enteroids וcolonoids שניהם. איור 6 מציג enteroids נציג גובר מצד מטופל עם סיסטיק פיברוזיס (איור 6 א) וenteropathy tufting עקב מוטציה מולדת במודעת תאי אפיתלגן מולקולת hesion (EpCAM) (איור 6). ליד הפגם הגנטי, enteroids אינו מציג הבדלים במצב בסיסי.
איור 1. Workflow של דיסוציאציה מאורות ודור של enteroids וcolonoids בתרבות האנושי. מאורות (ממעי דק או מעי גס אנושיים) מבודדים על ידי קלאציה EDTA. מאורות תרבותיים יוצרים enteroids למעי הדק וcolonoids למעי הגס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תהליך איור 2. Dissection לבידוד קריפטה. () specime המעי הדקn נמתח והצמיד שטוח לתוך צלחת פטרי מצופי סיליקון. (ב) הרירית מופרדת מsubmucosa הבסיסי. הרירית גזור (C) נמתחה והצמידה שטוח לתוך צלחת פטרי מצופי סיליקון. (ד) לאחר קלאציה EDTA, מאורות מבודדים מהרקמה. (E) ביופסיה אחת נמתחה והצמידה שטוח לתוך צלחת פטרי מצופי סיליקון. (F) לאחר קלאציה EDTA, מאורות מבודדים מהביופסיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תרבות קריפטה וenteroid אדם ודור colonoid מכל רקמה. () מאורות Jejunal מצופים במטריצת קרום במרתף לאחר בידוד. מאורות סוגרים אחרי 3 עד 4 שעות ולהתחיל לבלון עד ליצירת enterospheres מעבר לכך זמן. בשעת 7 ימים, enteroids jejunal נוצרים. (ב) לאחר בידוד ותרבות, מאורות ileal מתנהגים כמו מאורות jejunal ויוצרים enteroids ileal. מאורות מעי גסים (C) הם מצופים במטריצת קרום במרתף לאחר בידוד. מאורות colonoids הקרוב וצורה לאחר 7 ימים (ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תרבות קריפטה וenteroid אדם ודור colonoid מביופסיה. () מאורות התריסריון מצופים במטריצת קרום במרתף לאחר בידוד. מאורות סוגרים אחרי 3 עד 4 שעות ולהתחיל לבלון עד beyond זה זמן ליצור enterospheres. בשעת 7 ימים, enteroids נוצרים. (ב) לאחר בידוד ותרבות, מאורות מעי הגס הם מצופים במטריצת קרום במרתף. מאורות מקרוב כדי ליצור colonospheres אז colonoids לאחר 7 ימים (ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. שושלות מעיים של enteroids האנושי. () Enteroid אדם לאחר 6 ימים בתרבות. (ב) סעיפי Hematoxylin-eosin של enteroids ב() להדגים את האפיתל המצפה (ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר). (CD) ההדמיה Confocal של enteroids לאחר צביעת edu (מגנטה) מראה את הנוכחות של תאי שגשוג. (E אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. תרבות קריפטה ודור enteroid אדם מהרקמה חולה. () Enteroids הוקמו מדגימת סיסטיק פיברוזיס. Enteroids (B) שהוקם מדגימת enteropathy tufting מולדת (ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הסרט 1. Enterosphere להרכיב enteroid אדם בתרבות. בזמן הקפות 32 שעותסרט דואר תערוכות enterosphere הוקם ממעי הדק אדם חוזר בי כדי ליצור enteroid בתרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | ממס | ריכוז המניה | ריכוז סופי | תגובה |
| פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוח Ca 2 +, Mg 2 + חופשי (DPBS) | טכנולוגיות חיים; Gibco | 14190-144 | - | - | 1x | |
| Ethylenediamine חומצת tetraacetic (EDTA) | סיגמא אולדריץ | 431,788 | Ultrapure DH 2 O | 2 מ"מ | ||
| סורביטול | פישר סיינטיפיק | BP439-500 | DPBS | אבקה | 2% | |
| סוכרוז | פישר סיינטיפיק | BP220-1 | DPBS | אבקה | 1% | |
| אלבומין בסרום שור (BSA) V Fraction | פישר סיינטיפיק | BP1600-100 | DPBS | אבקה | 1% | |
| Gzntamycin / Amphotericin B פתרון | טכנולוגיות חיים; Gibco | R-015-10 | - | 500x | 1x | |
| Wnt-3A conditionned בינוני | בבית | - | - | - | - | |
| מתקדם DMEM / F12 | טכנולוגיות חיים; Gibco | 12634-028 | - | - | - | |
| HEPES 1M | טכנולוגיות חיים; Gibco | 15630-080 | - | 1 M | 10 מ"מ | |
| Glutamax (גלוטמין) | טכנולוגיות חיים; Gibco | 35050-061 | - | 100X | 1X | |
| פניצילין, סטרפטומיצין (10,000 U / mL) | טכנולוגיות חיים; Gibco | 15140-148 | - | 100X | 1X | |
| מוסף N2 | טכנולוגיות חיים; Gibco | 17502-048 | - | 100X | 1X | |
| מוסף B27 | טכנולוגיות חיים; Gibco | 17504-044 | - | 50X | 1X | |
| N-acetylcysteine | סיגמא אולדריץ | A9165-5G | DPBS | 1 M | 1 מ"מ | </ Td> |
| Nicotidamide | סיגמא אולדריץ | N0636 | DPBS | 1 M | 10 מ"מ | |
| Matrigel, GFR, (מטריצת קרום במרתף) החופשי פנול | קורנינג | 356,231 | - | - | - | נדרש |
| Noggin רקומביננטי אדם | R & D | 6057-NG / CF | DPBS | 100 מיקרוגרם / מיליליטר | 100 ng / ml | ספקים אחרים: R & D; Anaspec וPreprotech |
| R-Spondin רקומביננטי אדם | Preprotech | 120-38 | DPBS | 1 מ"ג / מיליליטר | 1 מיקרוגרם / מיליליטר | |
| EGF רקומביננטי אדם | סיגמא אולדריץ | E9644-.2MG | DBPS | 500 מיקרוגרם / מיליליטר | 50 ng / ml | |
| Y-27632 | סיגמא אולדריץ | Y0503-1MG | DPBS | 10 מ"מ | 10 מיקרומטר | |
| -83-01 | Tocris | 2,939 | DMSO | 500 מיקרומטר | 500 ננומטר | |
| SB202190 | סיגמא אולדריץ | S7067-5MG | DMSO | 30 מ"מ | 10 מיקרומטר | |
| אדם [Leu] 15-Gastrin 1 | סיגמא אולדריץ | G9145-.1MG | DPBS | 100 מיקרומטר | 10 ננומטר | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | DMSO | 10 מ"מ | 2.5 מיקרומטר | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | DMSO | 10 מ"מ | 2.5 מיקרומטר | |
| TrypLE Express אנזים (1X), פנול אדום (אנזים תא דיסוציאציה) | טכנולוגיות חיים; Gibco | 12605-010 | - | - | - | לpassaging |
| בסרום שור עוברי | טכנולוגיות חיים; Gibco | 10082-147 | - | - | - | לpassaging |
| CTS-Synth-הקפאה (מדיום הקפאה) בינונית | טכנולוגיות חיים; Gibco | A13713-01 | - | - | - | להקפאה |
| שורת תאי L Wnt-3A | ATCC | CRL-2,647 | - | - | - | Wnt-3A conditionned ייצור תקשורת |
| assay בלוציפראז Renilla | Promega | E2710 | - | - | - | Wnt-3A conditionned פעילות תקשורת |
| Wnt-3A רקומביננטי אדם | R & D | 5036-WN / CF | DPBS | 100 מיקרוגרם / מיליליטר | 100 ng / ml | |
| שורת תאי HEK293 TOPflash | - | - | - | - | - | Wnt-3A conditionned פעילות תקשורת; מתנה ממעבדת הנס Clevers |
רשימת 1. מגיב מפורט בטבלה עם יצרן מועדף ומספר קטלוג.
| ציוד | מתכלה | כלים |
| הזרימה למינרית | 15 ו -50 מיליליטר צינורות חרוטי | דומון # 5 מלקחיים סטנדרטיים (FST; # 11,251-20) |
| CO 2 חממה | צינורות microfuge | דומון # 7, מלקחיים בסדר מעוקלים (FST; # 11,274-20) |
| סטריאו-מיקרוסקופ | 24 גם צלחות | מספריים פיין (FST; # 14,060-09) | 0.22 מיקרומטר מסננים (Sartorius) | מספריים אביב Vannas (FST; # 15,018-10) |
| ייקר מסלולית | טפטפות סרולוגיות | סיכות קוטר minutien 0.2 מ"מ (FST; # 26,002-20) |
| מיכל הקפאה (Nalgene) | טיפים micropipette | סיכות קוטר minutien 0.1 מ"מ (FST; # 26,002-10) |
| סיליקון Sylgard 184 (Dow Corning) | 150 מיקרומטר פתחי רשת, סינון ניילון (Dynamic Aqua-אספקה) | |
| צלחת פטרי מזכוכית | 5 מיליליטר צינורות פוליפרופילן מסביב לתחתית (Falcon) | |
| pipettor סרולוגיות | מחט מילוי הבוטה 18G (BD) | |
| Micropipette | 3 מיליליטר lsyringes עם טיפים Luer-Lock (BD) | |
| Cryovials |
Discussion
שיטה זו מספקת מערכת שלמה להתרבות שושלות מעיים אפיתל ודינמיקת האפיתל המהוות כלי שימושי ללמוד ביולוגיה אפיתל במעי. השיטה המוצגת במסמך זה הותאמה מהמחקר העכברי המקורי על ידי סאטו ו -22 Clevers שיעילות התוצאות בenteroids וcolonoids האנושיים. כאן, אנו ידני הרימו את מאורות ידי microdissection להימנע מכל מזהמים סלולריים. שיטה זו מאפשרת הדמיה ישירה של מאורות ומובילה לשעות נוספות עקביות בהשוואה לאוסף קריפטה המקורי על ידי "רועד". קבוצות אחרות פיתחו טכניקה דומה תוך שימוש בגישות שונות במקצת במיוחד החלפת קלאציה על ידי EDTA עם collagenase 25. מלבד ההבדלים באוסף קריפטה, טכניקה אלה להשתמש בתקשורת מוגדרת שנדרש לגדול enteroids האדם בתרבות 22. כדי להגביר את יעילות צמיחה בזריעת קריפטה, אנו מוסיפים מעכב GSK3 (CHIR99021)ביומיים הראשונים 12.
הטיפול ברקמה או הביופסיות חשוב ובידוד קריפטה צריכה להתבצע בהקדם הרקמה מגיעה במעבדה. עם זאת, בידוד קריפטה מתעכב ותרבות יכולים להתבצע עד 24 שעות לאחר איסוף רקמות (מידע לא מוצג) כפי שתואר לעיל לרקמה עכברית 26. רקמת המעי צריכה להיות ממוקמת בצינור חרוטי מלאים לחלוטין עם DPBS על מנת למנוע פגיעה ברקמות ויש לשמור על 4 מעלות צלזיוס. ההכנה מתעכבת מאפשרת משלוח רקמות אך יש להימנע וריאציה הטמפרטורה במהלך הובלה. הזמן הכולל נדרש לציפוי קריפטה הראשוני הוא כ 2 שעות עם 15 עד 30 דקות כדי לעבד את הרקמה ו1-2 שעות לבודד וצלחת קריפטה. Microdissection של הרקמה הוא הקובע ונשוא קריטיים של הכנת קריפטה נקייה. עם זאת, שחרור קריפטה ביד רועדת, כמתואר בפרוטוקולים שונים אפשרי 22,23.
למרות קווי הדמיון עם מערכת enteroid העכברי (enteroids), enteroids האדם דורש מולקולות ספציפיות כדי לשפר ולשמר את הצמיחה שלהם לאורך זמן. גורמי הגדילה, EGF, Noggin, R-spondin משמשים באופן דומה לorganoids אפיתל העכברי. עם זאת, השימוש בWnt-3A הוא קריטי. שציינו כי ההיווצרות כמו גם את יעילות הצמיחה גדולה באמצעות מדיום מותנה Wnt-3A מאשר חלבון רקומביננטי האנושי. במקביל, הפגנו תנאי תרבות משופרים באמצעות מעכבי של קינאז synthase גליקוגן 3 (CHIR99021) 12. גורמי גדילת רקומביננטי יכולים להיות מוחלפים על ידי Wnt-3A, R-spondin, וNoggin מזגן תקשורת. קו L-תא Wnt-להביע 3A הוא זמין באופן מסחרי (ATCC). קבוצות אחרות פיתחו R-spondin 1 23,27, Noggin- 19, וWnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 להביע שורות תאים. שני מעכבי מולקולה קטנים המשמשים בתרבותיdia ונחוץ לשמירה על התרבות 29. -83-01 הוא מעכב סלקטיבי של הפיכת β גורם הגדילה וActivin / קולטנים קטרים (כמו Activin-kinase 4, 5, 7) וSB202190 הוא מעכב החלבון kinase מופעל-mitogen p38 (MAPK). שני המעכבים שימשו בהתאמה לקיים אנושי תאי גזע עצמי והתחדשות pluripotent מושרה ולהקים תאים אנושיים נאיביים pluripotent גזע 30-32. כמו כן, nicotinamide, מבשר של dinucleotide nicotinamide אדנין, נדרש לשמור enteroids והרחבת colonoids באופן ארוך טווח 22,29.
קלאציה EDTA הוא צעד חשוב שיקבע את התשואה מהכנת קריפטה. אנחנו כבר מוצלחים עם 2 טיפול mM EDTA. עם זאת, ריכוז EDTA יכול להיות שונה מ2 מ"מ עד 15 מ"מ לגבי הסוג של רקמה. במקרה זה, זמן דגירה צריך להיקבע באופן אמפירי. לאחר הציפוי הראשוני, קריפטה תעגל u-p וסופו של דבר יוצר enteroids. עם זאת, enteroids או colonoids לעתים קרובות להפגין פנוטיפ "גזע" על ידי יצירת התחומים עם לא מעט תאים מובחנים. במקרה זה, בידול יכול להיות יזם על ידי נסיגת Wnt-3A, nicotinamide ומעכב MAPK p38. השימוש במעכבי Notch כגון DAPT או DBZ עוזר לשפר את הבידול בתוך enteroids 22.
מודל זה מסכם את הפיסיולוגיה מעיים עם אירועים מתמשכים ניצנים-קריפטה הנובעים מתא בתאי גזע, כמו גם תחומים כמו אפיתל-סיסי המכילים את שני הקליטה ושושלות הפרשה מובחנת. מעניין, מערכת זו אינה מכילה את כל תאי mesenchymal ומשתמשת תנאי תקשורת ספציפיים כדי לעמוד בדרישות אות נישה.
כמו המודל העכברי, יכול להיות שנוצר מתאי אפיתל במעי מבודדים enteroids אדם כדי לבדוק את יכולתם של תאים אלה לתפקד כתאי גזע. Seveמחקרי RAL השתמשו מקבץ של סמני בידול (CD44, CD24 או CD166) ותאים חיוביים EPHB2 להעשיר לתאים עם תכונות גזע 12,23,33. יחד, מחקרים אלה להדגים את התועלת של תרבויות enteroids אדם לבדיקת stemness. חוקרים אחרים משתמשים במודל זה כדי לחקור מחלות מעיים כגון מחלות זיהומיות שלשולים, סיסטיק פיברוזיס, או סרטן מעי גס 22,34-37. מחקרים אלה מראים כי enteroids האנושי מהווה מודל מחלה אנושי אמין עם אפשרות לנוע לעבר הקרנה אישית. enteroids אדם יכול להיות מהונדס גנטי באמצעות transfection DNA או זיהום בחלקיקים נגיפיים 38. זה מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד פונקציות גן ספציפי בתוך organoids אפיתל האדם או מוטציות גנטיות נכונות. לאחרונה, שוונק ועמיתים הדגימו את האפשרות לערוך את הגנום עם CRISPR / מערכת Cas9 ולתקן את המוטציה בגן CFTR ac גורםסיסטיק ystic 24. enteroids האנושי מהווה מערכת רבת ערך כדי ללמוד בתאי גזע במעי וביולוגיה רירית אפיתל וישמש כמערכת ניסיונית רומן ללמוד פיזיולוגיה של מערכת העיכול הן נורמלית ולא נורמלית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | |
| Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Fischer Scientific | BP1600-100 | |
| Gzntamycin/Amphotericin B solution | Life technologies; Gibco | R-015-10 | |
| Wnt-3A conditioned medium | in house | ||
| Advanced DMEM/F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 | |
| HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 | |
| GlutaMAX (glutamine) | Life technologies; Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies; Gibco | 15140-148 | |
| N2 Supplement | Life technologies; Gibco | 17502-048 | |
| B27 Supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| human recombinant Noggin | R&D | 6057-NG/CF | |
| human recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 | |
| human recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | |
| human [Leu]15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) | Life technologies; Gibco | 12605-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 | |
| CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 | |
| L Wnt-3A cell line | ATCC | CRL-2647 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2710 | |
| human recombinant Wnt-3A | R&D | 5036-WN/CF | |
| HEK293 TOPflash cell line |
References
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).
- Shroyer, N. F., Kocoshis, S. Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases. Hyams, J. R. W. III , Elsevier. 324-336 (2010).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. , (2014).
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).
- Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).
- Furstenberg, R. J., et al. Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).
- Wang, F., et al. Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay. Gastroenterology. , (2013).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).
- Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Akcora, D., et al. The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche. Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).
- Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
- Lau, W., et al. Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts. Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. , (2014).
- Fuller, M. K., et al. Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage. Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Koo, B. K., Clevers, H. Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5. Gastroenterology. , (2014).
- Li, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).
- Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).
- Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med (Maywood). , (2014).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Kovbasnjuk, O., et al. Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S3 (2013).
- Fujii, M., Sato, T. Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research. Front Genet. 5, 169 (2014).
- Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. Retroviral gene expression control in primary organoid cultures. Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).
