Introduction
gastrointestinal astar epiteli sürekli yenilenmesi olduğunu. Bu süreç sürekli olarak devrediyor hızla bağırsak epitel yerine döl üreten bağırsak kök hücrelerin (ISCs) çoğalması ile tetiklenir. ISCs içeren proliferatif bölmesi kript alt sınırlıdır. ISCs sonunda emici ya da salgı soy içine ayırt döl verirler. Onlar lümen 1 içine pul pul dökülme önce yukarı doğru göç gibi crypt dışarı ve villus veya yüzey epiteli üzerine hareketli, hücreler giderek ayırt. ISCs enterocytes microfold hücreleri enteroendokrin hücreler, goblet hücreleri, püskül hücreleri ve Paneth hücreleri dahil olmak üzere tüm bağırsak epitel hücre türlerine neden olmaktadır. kolon dağınık enteroendokrin ve püskül hücreleri 2 çoğunlukla kolonisitler ve goblet hücre oluşan uzatılmış kriptler ile karakterizedir.
Ex vivo culTure sistemleri ISC bakım ve bağırsak dokusu hemostazını çalışmak için umut verici bir araç oluşturmaktadır. Fizyolojik koşullar tamamen çoğaltılamaz ve epitel mikroçevresinin genellikle 3,4 değişmiş değil gibi Ancak, doku kültürü teknolojileri güvenmek zordur. ISC alanında büyük bir ilerleme sağlamak ve normal bağırsak niş sinyalleri yerine tanımlanan büyüme faktörleri kullanarak bireysel kemirgen ISCs genişletmek için doku kültürü teknikleri kurulması oldu. Uzun süreli bir kültür koşulları Sato ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir., Burada tek bir kript veya intestinal epitelden izole kök hücreler birden fazla kript-benzeri bölgeler 5-7 de dahil olmak üzere 3 boyutlu epitel yapıların oluşturulması için büyür. Bu üç boyutlu yapılar sürekli genişletmek için fisyon olayları tabi. İlginç bir şekilde, kökenli dokuya özgü tüm bağırsak hücre tipleri üretilir ve aynı zamanda bir lümen 8 içine ekstrüde edilir. Bu sistemin modifikasyonlarını kullanılarak, epitelorganoids mide, ince bağırsak ve kolon elde edilebilir. Daha özel olarak ise, ince bağırsak epitel organoids enteroids 9, ve kolondan bu colonoids 9,10 bulunmaktadır. Bu epitel organoid kültür sistemleri Bu şekilde izole edilen hücreler 5,6,10-15 yorum "stemness" test, in vitro olarak, kök hücreler olarak işlev görme izole edilmiş tek hücrelerin kabiliyetini test etmek için kullanılmıştır. Diğer araştırmacılar bireysel epitel hücrelerinin 16-21 işlevini incelemek için enteroids ve colonoids hem kullanmışlardır. Böylece, enteroid ve colonoid kültürler hem kök ve dışı kök hücre fonksiyonlarını değerlendirmek ve bağırsakların içindeki temel hücresel etkileşimleri yeni bir fikir vermek için kullanılabilir.
2011, Şato ve arkadaşları, insan ince bağırsak ve kolon 22,23 türetilmiş epitelyal organoids uzun süreli bir kültür oluşturulur. Medyum kompozisyonu, insan epitel enteroids farklılıkları yanındave colonoids onların kemirgen meslektaşı ile aynı özelliklere sahip. Ayrıca, bu tür Barrett yemek borusu, adenom veya adenokarsinom, ve kistik fibroz 22,24 gibi hastalıklı dokulardan elde edilebilir. İnsan enteroids bağırsak kök-hücre ve epitel mukozal biyoloji çalışma, normal ve anormal hem de gastrointestinal fizyoloji 3 incelemek için yeni bir deneysel sistemi olarak hizmet için değerli bir sistem oluştururlar.
Burada, insan ince bağırsak ve kolon kript (Şekil 1) gelen enteroids ve colonoids kurmak için yöntemleri tarif eder. Bu metodolojik derlemede, biz bütün doku ve biyopsi mahzendeyken koleksiyonu vurgulamak. Biz başarılı büyüme ve insan enteroids ve colonoids ve bu modele göre gerçekleştirilmiştir olası deneysel stratejiler bakımı için gerekli olan kültür yöntemleri özetlemek.
Protocol
NOT: Etik Açıklama: CCHMC bir IRB tarafından onaylanmıştır burada tarif edilen insan dokuları kullanılarak tüm deney (KİK # 2012-2858; # 2014-0427). Doku toplama, depolama ve numunelerin kullanımı için bilgilendirilmiş onam CCHMC de donörlerden elde edilmiştir.
Kültür 1. Hazırlık
NOT: Tüm reaktifler Tablo 1'de verilmiştir.
- Aşağıdaki gibi, EDTA, bir stok çözelti hazırlayın: 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit, son derece saf, H2O, 0.22 um filtre ile steril filtre pH 8 (EDTA) hazırlanması. İsteğe bağlı olarak, süresiz olarak oda sıcaklığında EDTA stok çözeltisi saklayın.
- Aşağıdaki gibi kenetleme tamponu hazırlayın:% 2 arasında sorbitol,% 1 sükroz,% 1 sığır serum albümin fraksiyonu V (BSA) ile karıştırmak ve 1x Gentamisin / Dulbecco Fosfat Amfoterisin çözeltisi Ca olmadan tamponlu tuz + 2 ve Mg + 2 (DPBS), filtre ile sterilize 0.22 um'lik bir filtre ile. Kenetleme buf hazırlayınfer taze.
- Wnt-3A-koşullu ortam, üreticinin talimatlarına (ATCC CRL-2647) 'e göre hücre çizgisi L, Wnt-3A ile evde yapılan aşağıdaki gibidir: orta, Wnt-3A durumunu hazırlayın. 0.22 um filtre ile steril, 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1, N2 ek, 1 B27 ek,% 1 BSA ve filtre ortamı Ek.
NOT: Test TOPflash tahlili kullanılarak Wnt faaliyet için her parti. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir Renilla lusiferaz deney kiti ile istikrarlı HEK293 TOPflash, hücre çizgisi (Hans Clevers laboratuar) kullanın. 100 ng / ml insan rekombinant Wnt-3A ile TOPflash deneyi normalize. Kontrole göre koşullu ortamın en azından bir 10 kat değiştirme aktivitesi kontrol edin. En fazla 6 ay süreyle -20 ° C'de 15 ml konik tüp ve dondurularak 10 ml'lik miktarlar halinde taze Wnt-3A-koşullandırılmış bir ortam bölün. Mağaza aktivite kaybı olmadan 4 ° C de 5 gün alikotları kadar çözülmüş. - Pr0.22 sterilize 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / mL penisilin, 100 ug / mL streptomisin, 1, N2 ek, 1 B27 takviyesi,% 1 BSA ve filtre ile Ek Gelişmiş DMEM / F12 ortamı aşağıdaki gibidir: İnsan minigut orta epare mikron filtre.
Not: 3 aya kadar -20 ° C'de 15 ml konik tüp ve dondurularak 10 ml'lik miktarlar halinde taze insan minigut orta bölün. Mağaza aktivite kaybı olmadan 4 ° C de 5 gün alikotları kadar çözülmüş. - Aşağıdaki gibi tam bir insan minigut orta hazırlayın XXXII kültürü ya da% 50, Wnt-3A-koşullu ortam (bakınız 1.3), 1 ug / ml, R-spondin 1 (1 ile takviye edilmiş ortam değişikliklerin insan minigut ortamında (bakınız 1.4) önce taze hazırlayın: 1000 1 mg / ml stok), 100 ng / ml Noggin seyreltilmesi (1: 1,000, 100 g / ml stok), 50 ng / ml EGF (1 seyreltme: 500 ug / ml stok), 10.000 seyreltme, 500 nM A-83 -01: 10 uM SB202190 (1 1000 seyreltme 500 M stok) (1: 3000 seyreltme, 30 mM stoklar), 10 nM [Leu] 15-gastrin 1 (1: 100 uM 10,000 seyreltmestok), 10 mM Nikotinamid (1: 100 seyreltme 1 M stok) ve (1 1 mM N-Asetilsistein: 1,000 seyreltme 1 M stok).
NOT: aktivite kaybı olmaksızın 4 ° C'de 2 gün öncesine kadar saklayın tam insan minigut medya.
Tüm Doku 2. Crypt İzolasyon
NOT: doku toplama kaynaktan bu bölge tuz içerisinde örnek korumak için esastır. Bu taşıma esnasında buz üzerinde doku tutmak için tavsiye edilir. Kriptalarının izolasyonu için numune hazırlanması mümkün olduğu kadar çabuk yapılması gerekir.
NOT: Tüm reaktifler Tablo 1, araç, gereç listelenen ve sarf Tablo 2'de listelenmiştir.
- Deney başlamadan önce tüm reaktifler hazırlayın. Buz üzerinde taban membran matrisi çözülme önceden kuluçkalayın 37 ° C'de bir CO2 kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka.
NOT: Alternatif iyi bir 24 merkezde / 15 ul kullanarak bazal membran matris ince bir katman yapmakeh plaka 37 ° C'de bir CO2 inkübatör içinde koyun. Bu fakültatif aşama polimerizasyon sırasında bir damla olarak bazal membran matrisi tutar. - Ile doku yıkayın buz soğuk Dulbecco Fosfat Ca 2+ ve Mg 2+ (DPBS) olmadan tamponlu tuzlu. DPBS içeriği temizlenene kadar devam edin.
- 0.2 mm çapında minutien işaretçilerini kullanılarak buz-soğuğu DPBS ile doldurulmuş bir silikon kaplı cam bir Petri tabağına doku sabitleyin. Gerin ve mukozal tarafı yukarı bakacak şekilde düz bir doku pin.
- Bir mikroskop altında, mikro-diseksiyon makas ve ince nokta kavisli bir forseps kullanarak submukozaya ve bağ dokusundan örten mukozayı çıkarın (Şekil 2A, B).
- Gerin ve mukozal tarafı yukarı bakacak şekilde silikon kaplı cam Petri kabı disseke mukoza düz pin. Kalan submukoza ve bağ dokusu atılır ya da başka deneylerde (Şekil 2C) için kullanılabilir.
- Nazikçekavisli bir forseps ile mukoza yüzeyi kazıyın. Bu aşama, hazırlık kalitesini iyileştirmek için gereklidir.
- Ince bağırsakta için, yavaşça villus kaldırmak için mukoza kazıyın.
- Kolon için, hafifçe mukoza ve enkaz kaldırmak için mukoza kazıyın.
- Villus ve enkaz kaldırmak için buz-soğuk şelasyon tamponu ile mukozayı 3-4 kez yıkayın.
- (49.6 ml şelasyon tamponu 200 ul 0.5 M EDTA) taze hazırlanmış 2mM EDTA şelasyon tamponu ile mukozayı örtün.
- Buz üzerinde bir Petri tabağına yerleştirin ve yatay orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca yavaşça çalkalayın.
- EDTA içermeyen doku buz ile soğutulmuş kenetleme tamponu ile 3-4 kez yıkayın. Yıkamadan sonra, buz soğukluğunda kenetleme tamponu içinde mukoza bırakın.
- Kavisli ve ince forseps kullanarak bir mikroskop altında mukozayı işleyin. Yavaşça kavisli forseps kullanarak bağırsak crypts serbest bırakmak için mukoza kazıyın.
- Yavaşça bir pi kullanarak petri mahzendeyken süspansiyon kaldırmakPette 50 ml konik tüp içine aktarın ve.
NOT: Hemen hemen tüm kriptler mukozasından kaldırılmıştır emin olmak için doku kontrol edin. - 2 kez örgü 150 mikron ile kriptler süspansiyon Filtre.
NOT: Bir mikroskop (Şekil 2B) kapsamında akış yoluyla crypt zenginleştirme için kontrol edin. - 50 x g'de, 4 ° C'de kript süspansiyon 5 dakika santrifüj. Süpernatantı atın.
- 5 ml buz gibi soğuk tampon maddesi içinde kenetleme pelletini.
- Adım 2.15 den süspansiyon 10-ul damla başına kriptalarının sayısını. 5 ml'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe kaplama için gerekli kript sayısı aktarın. Enteroids veya colonoids kurmak için bir 24-çukurlu tabak oyuk başına 200-500 crypts kullanın.
- Santrifüj 150 g de 10 dakika, 4 ° C, kript fraksiyonu. Süpernatantı.
- Daha sonra kültür crypts kullanın.
Biyopsi 3. Crypt İzolasyon
- Önce tüm reaktifler hazırlayınDeneyin başında. Buz üzerinde taban membran matrisi çözülme önceden kuluçkalayın 37 ° C'de bir CO2 kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka.
- Ile biyopsi yıkayın buz soğuk Dulbecco Fosfat Ca 2+ ve Mg 2+ (DPBS) olmadan tamponlu tuzlu.
- 0.1 mm çapında minutien işaretçilerini kullanılarak buz-soğuğu DPBS ile doldurulmuş bir silikon kaplı cam bir Petri tabağına biyopsi sabitleyin. Gerin ve mukozal tarafı (Şekil 2E) yukarı bakacak şekilde düz bir mukoza pin.
- Yavaşça villus ve enkaz kaldırmak için kavisli bir forseps ile mukoza yüzeyi kazıyın. Bu aşama, hazırlık kalitesini iyileştirmek için gereklidir.
- Villus ve enkaz kaldırmak için buz-soğuk şelasyon tamponu ile Biyopsiyi 3-4 kez yıkayın.
- (49.8 ml şelasyon tamponu 200 ul 0.5 M EDTA) taze hazırlanmış 2mM EDTA şelasyon tamponu ile biyopsi örtün.
- Buz üzerinde bir Petri tabağına yerleştirin ve yatay orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca yavaşça çalkalayın. <li> EDTA olmadan Biyopsiyi buz gibi soğuk şelasyon tamponu ile 3-4 kez yıkayın. Yıkamadan sonra, buz soğukluğunda kenetleme tamponu içinde biyopsi bırakın.
- Kavisli ve ince forseps kullanarak bir mikroskop altında biyopsi işleyin. Yavaşça mukoza kavisli bir forseps kullanarak bağırsak crypts serbest kazıyın.
- Yavaşça bir pipet kullanarak petri mahzendeyken süspansiyon çıkarın ve 50 ml konik tüp transfer.
NOT: Hemen hemen tüm kriptler mukozasından kaldırılmıştır emin olmak için doku kontrol edin. - 150 mikron naylon ile crypt süspansiyon 2 kez örgü Filtre.
NOT: Bir mikroskop altında akış yoluyla crypt zenginleştirme için kontrol edin. - 50 x g'de, 4 ° C'de kript süspansiyon 5 dakika santrifüj. Süpernatantı atın.
- 1 ml buz gibi soğuk tampon maddesi içinde kenetleme pelletini. 1.5 ml mikrofuge'de tüp kript süspansiyon aktarın.
- Santrifüj 150 x g'de, 4 ° C'de 10 dakika boyunca kript fraksiyonu. Süpernatantı. </ Li>
- Daha sonra kültür crypts kullanın.
Bodrum Membran Matrix 4. Crypt Kültür
- Önceden soğutulmuş pipetlemeyin ipuçları kullanarak, bazal membran matrisi (200 ile 500 kriptler / 50 ul bazal membran matris) olarak (adım 2.18 veya 3.15 den) kript pelletini.
- Önceden ısıtılmış plaka üzerinde oyuk başına taban membran matrisi kript süspansiyonu 50 ul uygulanır. Yavaşça kuyunun ortasında bazal membran matris çıkarmak.
- 30 dakika taban membran matrisi tam bir polimerizasyona olanak sağlamak için 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka koyun.
- 2.5 uM CHIR99021 ile desteklenmiş tam insan minigut ortamının 500 ul bazal membran matrisi Bindirme (1: 4000 seyreltme, 10 mM stoklar) ve 2.5 uM Thiazovivin (1: 4000 seyreltme, 10 mM stok).
- 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin.
- Taze tam huma ile orta değiştirinN minigut ortam her 2 günde.
Kültürlenmiş Enteroids ve Colonoids 5. pasaj.
Not: Geçiş Enteroids ve Colonoids sonra ilk kaplama, her 7-10 gün. Genellikle, 3 ila 4 kuyulara iyi bir bölme.
- Deneyin başlamasından önce bütün reaktifleri hazırlayın. Buz üzerinde taban membran matrisi çözülme önceden kuluçkalayın 37 ° C'de bir CO2 kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka.
- Buz gibi soğuk DPBS 1 ml steril ipuçları ve bindirme kullanarak ortamı çıkarın.
- Ileri geri 1.000 ul ucu ile Pipet. Yeni 15 ml'lik konik tüp çözüm aktarın.
- Ortam 1 ml% 5 FBS ile takviye edilmiş insan minigut orta 2 ml ilave edilir.
- 50 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika boyunca çözelti santrifüjleyin. Süpernatantı atın.
- (: 10 mM stoklar 1000 seyreltme 1), 10 uM-Y-27632 ile takviye edilmiş hücre ayrışma enzimin 2 ml pelletini. 5 m inkübeBir su banyosu içinde 37 ° C 'de de.
- Bir 18-G dolgu / kör iğne ile donatılmış bir 3 mi Luer-Lock şırınga kullanılarak hücre kümeleri ayırmak. Yavaşça enjektörü 10 kez kullanarak ileri ve geri çözüm pipetle.
- 500 xg, 4 ° C'de 5 dakika boyunca bir süspansiyon santrifüjleyin. Süpernatantı atın.
- Önceden soğutulmuş pipetlemeyin ipuçları kullanarak, bazal membran matris içinde hücre pelletini.
- Önceden ısıtılmış plaka üzerinde oyuk başına taban membran matrisi kript süspansiyonu 50 ul uygulanır. Yavaşça kuyunun ortasında bazal membran matris çıkarmak.
- 20 dakika taban membran matrisi tam bir polimerizasyona olanak sağlamak için 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka koyun.
- (: 10 mM stoklar 1000 seyreltme 1), 10 uM-Y-27632 ile desteklenmiş tam insan minigut ortamının 500 ul bazal membran matrisi Bindirme.
- 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin.
- 2 gün sonra,10 uM Y-27632 ile desteklenmiş taze tam bir insan minigut ortamı ile orta yerine (1: 1000 seyreltme, 10 mM stok). Bundan sonra, her gün taze olarak tam olan insan minigut ortamı ile orta yerine.
Kültürlü Enteroids ve Colonoids 6. Donma
NOT: Genellikle 2-3 cryovials içine bir kuyu dondurma.
- Tekrarlayın 5,1-5,8 adımları.
- Soğuk dondurma ortamı ile pelletini. Transfer etiketli cryovial içine çözüm dondurma 1 ml. Izopropil alkol 500 ml ihtiva eden bir dondurma kap içinde dondurarak saklamaya uygun vialler yerleştirin.
- Daha sonra sıvı azot depolama dondurarak saklamaya uygun vialler transferi, 24 saat süre ile 80 ° C'de derin dondurucuda dondurma konteyneri aktarın.
1 yıla kadar Store Enteroids ve Colonoids: NOT.
Representative Results
Şekil 2D, bütün doku (Şekil 2D) taze izole edilmiş kript tipik bir örneğini gösterir. Bir biyopsisi ile izole edilen kript sayısı tüm dokularda olduğundan daha düşüktür. Iğne ile standart kapasite biyopsi forseps kullanarak, genellikle tek bir geçişte iki biyopsi ısırıkları gerçekleştirmek. Biyopsi başına 50-100 kript ortalama (Şekil 2F) 10 mm2 yüzeyde Biyopsi lokma sonuçlanır.
Bazal membran matris içinde kültürden sonra, kriptler kolon için ince bağırsakta ve colonospheres için enterospheres oluşturmak kadar yuvarlak. Genellikle tomurcuklanma kript tohumlama sonra, 5-6 gün içinde ortaya çıkar. (; Movie 1 Şekil 3A-C) Ancak bazal membran matrisindeki küre oluşturan ya enteroids (enteroids) veya colonoids (colonoids) görmek için alışılmadık bir durum değildir. pasajı enteroids boyutuna bağlı olarak, 7 gün sonra yapılır. enteroids veya colonoids establbiyopsilerinden ished kültüründe aynı gelişmeyi tabi tutulur. Tohumlama ile kript yoğunluğu düşük olduğu, ancak, pasajı Kültürde çoğunlukla 10-12 gün sonra yapılır (Şekil 4a, b). Enteroids ve colonoids kültürler tekrarlanabilir bir şekilde genişletebilir.
Her iki enteroids ve colonoids bir lümen tarafı sunmak ve bir epitel ile kaplı (Şekil 5A, B). Proliferatif hücreler enteroids içinde görülebilir ve tomurcuk ipuçları (Şekil 5C, D) içinde yer almaktadır. E-kadherin (ecad) ile boyanmıştır enteroids Konfokal görüntüleme epitel hücrelerini (Şekil 5E) görülmektedir.
Enteroids ve colonoids Hem genetik / doğuştan bozuklukları olan hastalarda elde edilen dokudan kurulabilir. Şekil 6 nedeniyle epitel hücre reklamda doğuştan mutasyon kistik fibroz (Şekil 6A) ve bir tutam takma enteropati bir hastadan alınan artan temsili enteroids göstermektedirhezyon molekülü geni (EpCAM) (Şekil 6B). Genetik kusur yanında, enteroids bazal durumda farklılık göstermezler.
Kript ayrışma ve insan enteroids ve kültür colonoids nesil Şekil 1. İş Akışı. Crypts (insan küçük bağırsak ve kolonda) EDTA şelasyon ile izole edilmiştir. Kültürlü kriptler kolon için ince bağırsakta ve colonoids için enteroids oluşturur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Crypt izolasyonu için Şekil 2. Diseksiyon işlemi. (A) ince bağırsak specimen gergin ve silikon kaplı Petri kabı içine düz bir tutturulmuş. (B), mukoza altında yatan alt mukozada ayrılır. (C) disseke mukoza gergin ve silikon kaplı Petri kabı içine düz bir tutturulmuş. EDTA şelasyon sonra (D) kript dokudan izole edilmiştir. (E) Bir biyopsi gergin ve silikon kaplı Petri kabı içine düz bir tutturulmuş. (F) EDTA şelasyon sonra, kriptler biyopsi izole edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Crypt kültürü ve bütün dokusundaki insan enteroid ve colonoid üretimi. (A), izole edildikten sonra taban membran matrisi kaplanmıştır jejunal kript. kriptler 3-4 saat sonra kapanış ve bu zamanın ötesine enterospheres oluşturmak üzere balon başlar edilmektedir. 7 gün sonra, ince barsak enteroids oluşturulur. Izolasyon ve kültür sonra (B), ileal kriptler jejunum kriptlerde gibi davranır ve ileal enteroids oluştururlar. (C) Kolon kript izolasyonundan sonra bazal membran matris içinde kaplanır. 7 gün (Ölçek çubukları: 100 mikron) sonra kriptler yakın ve form colonoids. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Biyopsi gelen Şekil 4. Crypt kültürü ve insan enteroid ve colonoid nesil. (A) izolasyondan sonra bazal membran matris içinde kaplı duodenal kriptler. kriptler 4 saat 3 ila sonra kapanış ve Beyo kadar balon başlatmak edilirnd bu kez enterospheres oluşturulur. 7 gün sonra, enteroids oluşturulur. (B) izole edilmesi ve kültürün ardından, kolon kript bazal membran matris içinde kaplanır. .: kriptler sonra 7 gün (100 mikron Ölçek çubukları) sonra colonoids colonospheres oluşturmak kadar yakın bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Kültür içinde 6 günden sonra, Şekil 5, insan enteroids Bağırsak soyları (A). İnsan enteroid. (B) (A) astar epitelyum göstermek içinde enteroids arasında Hematoksilen-eozin bölümleri (Ölçek çubukları: 100 mikron). (CD) edu boyama (kırmızı) sonra enteroids Konfokal görüntüleme proliferatif hücrelerin varlığını gösterir. (E Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hastalıklı dokudan Şekil 6. Crypt kültürü ve insan enteroid üretimi. (A), kistik fibroz örnekten kurulmuş Enteroids. (B) Enteroids doğuştan tufting enteropatisi örneğinden kurulan (Ölçek çubukları: 100 mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1. Enterosphere kültüründe insan enteroid oluşturan. 32 saat zaman turE film kültüründe bir enteroid oluşturmak için retracting insan ince bağırsaktan kurulmuş bir enterosphere gösterir. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog Numarası | Çözücü | Hazır Konsantrasyon | Nihai Konsantrasyon | Yorum |
| Dulbecco Fosfat tuzlu Ca 2+, Mg 2+ ücretsiz (DPBS) tamponlu | Hayat teknolojileri; Gıbco | 14190-144 | - | - | 1x | |
| Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), | Sigma-AIdrich | 431.788 | Ultrasaf dH 2 O | 2 mM | ||
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | DPBS | Toz | % 2 | |
| Sakaroz | Fischer Scientific | BP220-1 | DPBS | Toz | % 1 | |
| Sığır serum albümini (BSA) Fraksiyon V | Fischer Scientific | BP1600-100 | DPBS | Toz | % 1 | |
| Gzntamycin / Amfoterisin B çözeltisi | Hayat teknolojileri; Gıbco | R 015-10 | - | 500x | 1x | |
| Wnt-3A orta conditionned | evde | - | - | - | - | |
| Gelişmiş DMEM / F12 | Hayat teknolojileri; Gıbco | 12634-028 | - | - | - | |
| HEPES 1M | Hayat teknolojileri; Gıbco | 15630-080 | - | 1M | 10 mM | |
| GlutaMAX (glutamin) | Hayat teknolojileri; Gıbco | 35050-061 | - | 100X | 1X | |
| Penisilin-Streptomisin (10,000 U / mL) | Hayat teknolojileri; Gıbco | 15140-148 | - | 100X | 1X | |
| N2 Ek | Hayat teknolojileri; Gıbco | 17502-048 | - | 100X | 1X | |
| B27 Ek | Hayat teknolojileri; Gıbco | 17504-044 | - | 50X | 1X | |
| N-Asetilsistein | Sigma-AIdrich | A9165-5G | DPBS | 1M | 1 mM | </ Td> |
| Nicotidamide | Sigma-AIdrich | N0636 | DPBS | 1M | 10 mM | |
| Matrigel, GFH, Fenol ücretsiz (bazal membran matris) | Corning | 356.231 | - | - | - | GEREKLİ |
| İnsan yeniden birleştirici Noggin | Ar-Ge | 6057-NG / CF | DPBS | 100 ug / ml | 100 ng / ml | Diğer tedarikçiler: Ar-Ge; AnaSpec ve Preprotech |
| İnsan yeniden birleştirici R Spondin | Preprotech | 120-38 | DPBS | 1 mg / ml | 1 ug / ml | |
| İnsan yeniden birleştirici EGF | Sigma-AIdrich | E9644-.2MG | HAA | 500 ug / ml | 50 ng / ml | |
| Y-27632 | Sigma-AIdrich | Y0503-1MG | DPBS | 10 mM | 10 uM | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | DMSO | 500 uM | 500 nM | |
| SB202190 | Sigma-AIdrich | S7067-5MG | DMSO | 30 mM | 10 uM | |
| İnsan [Leu] 15-gastrin 1 | Sigma-AIdrich | G9145-.1MG | DPBS | 100 uM | 10 nM | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | DMSO | 10 mM | 2.5 uM | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | DMSO | 10 mM | 2.5 uM | |
| TrypLE Hızlı Enzim (1X), fenol kırmızısı (hücre ayrışma enzim) | Hayat teknolojileri; Gıbco | 12605-010 | - | - | - | Geçirilmesi için |
| Fetal Sığır Serumu | Hayat teknolojileri; Gıbco | 10082-147 | - | - | - | Geçirilmesi için |
| CTS Synth-a-Freeze Orta (donma orta) | Hayat teknolojileri; Gıbco | A13713-01 | - | - | - | Donma için |
| L Wnt-3A hücre hattı | ATCC | CRL-2647 | - | - | - | Wnt-3A medya üretimini conditionned |
| Renilla lusiferaz deneyi | Promega | E2710 | - | - | - | Wnt-3A ortam etkinliğini conditionned |
| İnsan yeniden birleştirici Wnt-3A | Ar-Ge | 5036-WN / CF | DPBS | 100 ug / ml | 100 ng / ml | |
| HEK293 TOPflash, hücre çizgisi | - | - | - | - | - | Wnt-3A ortam etkinliğini conditionned; Hans Clevers laboratuvar Hediye |
Tercih üretici ve katalog numarası ile Tablo 1. Detaylı reaktif listesi.
| Ekipman | Tüketilir | Araçlar |
| Laminer akış kaputu | 15 ve 50 ml konik tüp | Dumont # 5 standart forseps (FST; # 11251-20) |
| CO 2 İnkübatör | Mikrofüj tüplerine | Dumont 7., kavisli ince forseps (FST; # 11274-20) |
| Stereo mikroskop | 24 oyuklu plakalar | İnce makaslar (FST; # 14060-09) | 0.22 mikron filtreler (Sartorius) | Vannas yaylı makas (FST; # 15018-10) |
| Orbital çalkalayıcı | Serolojik pipetler | 0.2 mm çapında minutien pim (FST; # 26002-20) |
| Donma kap (Nalgene) | Mikropipet ipuçları | 0.1 mm çapında minutien pimleri (FST; # 26002-10) |
| Sylgard 184 Silikon (Dow Corning) | 150 mikron örgü açıklıklar, naylon tarama (Dinamik Aqua-arz) | |
| Cam petri | 5 ml'lik yuvarlak dipli bir polipropilen tüpler (Falcon) | |
| Serolojik pipet | 18G künt dolgu iğnesi (BD) | |
| Mikropipet | Luer-Lock ipuçları 3 ml'lik lsyringes (BD) | |
| Cryovials |
Discussion
Bu yöntem bağırsak epitel biyoloji okumak için yararlı bir araç teşkil bağırsak epitel soyları ve epitel dinamikleri üreyen bir tam sistem sağlar. Burada sunulan yöntem, verimli insan enteroids ve colonoids sonuçlanır Sato ve Clevers 22 orijinal kemirgen çalışmanın uyarlanmıştır. Burada, biz elle herhangi bir hücresel kirletici önlemek için mikrodiseksiyon ile crypts aldı. Bu yöntem crypts doğrudan görselleştirme sağlar ve "sallama" orjinal kript toplama göre tutarlılık mesai yol açar. Diğer gruplar, özellikle kollajenaz 25 EDTA ile şelasyon değiştirilmesi biraz farklı yaklaşımlar kullanılarak benzer teknikleri geliştirdi. Kript toplama farklılıkları yanında, bu teknik kültür 22 insan enteroids büyümesi için gerekli olan belirli bir ortamı kullanmaktadır. Crypt tohumlama büyüme verimliliğini artırmak için, biz (CHIR99021) bir GSK3 inhibitörü ekleyinİlk iki gün 12.
doku veya biyopsi işleme önemlidir ve kript izolasyon kısa sürede doku laboratuarda geldiğinde yapılmalıdır. Ancak gecikmiş kript izolasyonu ve kültürü, doku toplama sonrası 24 saate kadar gerçekleştirilebilir olabilir, daha önce sıçangil doku 26 için tarif edildiği gibi (veri gösterilmemiştir). bağırsak dokusu bütünüyle doku bozulmasını önlemek ve 4 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir DPBS ile doldurulmuş bir konik bir tüp içinde yerleştirilmelidir. gecikmeli hazırlık doku nakliye için izin verir, ancak sıcaklık değişimi taşıma sırasında kaçınılmalıdır. İlk kript kaplama için gerekli olan toplam zaman izole ve kript plaka doku ve sonra 1 saat ila 2 işlem 15-30 dakika ile yaklaşık 2 saattir. doku mikrodissek- temiz bir crypt hazırlık kritik belirleyicisi ve önermedir. Ancak, çeşitli protokoller anlatıldığı gibi el-sallayarak crypt serbest mümkündür 22,23.
Kemirgen enteroid (enteroids) sistemi ile benzerliklere rağmen, insan enteroids geliştirmek ve zaman içinde kendi büyümesini sürdürmek için belirli molekülleri gerektirir. büyüme faktörleri, EGF, Noggin, R spondin sıçangil epitel organoids için benzer şekilde kullanılır. Bununla birlikte, Wnt-3A kullanılması önemlidir. Biz oluşumu yanı sıra büyüme verimliliği insan rekombinant protein daha Wnt-3A klimalı ortam kullanılarak büyük olduğunu kaydetti. Bağlantılı olarak, biz glikojen sentaz kinaz 3 (CHIR99021) 12 inhibitörü ile geliştirilmiş bir kültür koşulları gösterdi. Rekombinant büyüme faktörleri, Wnt-3A, R spondin ve Noggin, koşullu ortam tarafından değiştirilebilir. Wnt-3A-ifade eden L-hücre hattı (ATCC), ticari olarak temin edilebilir. Diğer gruplar, R-spondin 1 23,27, Noggin- 19 geliştirilmiştir ve Wnt-3A / R spondin3 / Noggin- 28, hücre soyunun ifade var. İki küçük molekül inhibitörleri kültüründe kullanılan Benidia ve kültür 29 bakım için gereklidir. A 83-01 büyüme faktörü β ve aktivin / Düğüm reseptörleri dönüştürme seçici bir önleyicisidir (aktivin-benzeri kinaz 4, 5, 7) ve SB202190, bir p38 mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz inhibitörleri (MAPK) 'dir. Her iki inhibitörleri insan uyarılmış pluripotent kök hücreler kendini yenileme sürdürmek ve insan naif pluripotent kök hücreleri 30-32 kurmak için sırasıyla kullanılmıştır. Aynı zamanda, nikotinamid, nikotinamid adenin dinükleotidinin bir ön-madde, uzun vadeli bir şekilde 22,29 içinde enteroids ve colonoids genişleme sağlamak için gereklidir.
O crypt hazırlık verim belirler gibi EDTA şelasyon önemli bir adımdır. Biz 2 mM EDTA tedavisi ile başarılı olmuştur. Bununla birlikte, EDTA konsantrasyonu doku tipine ilişkin 15 mM 2 mM'den değiştirilebilir. Bu durumda, inkübasyon süresi deneysel olarak tespit edilmelidir. İlk kaplama sonra, crypt yuvarlak-u olacaks ve en sonunda enteroids oluşturur. Ancak, enteroids veya colonoids genellikle hiçbir farklılaşmış hücrelere çok az olan küreler oluşturarak bir "kök" fenotip göstermektedir. Bu durumda, farklılaşma, Wnt-3A, nikotinamid ve p38 MAPK inhibitörü çekilmesi ile başlatılabilir. Böyle DAPT veya DBZ gibi Notch inhibitörü kullanımı enteroids 22 içinde farklılaşma artırılması yardımcı olur.
Bu model, özümseme ve salgı farklılaşmış soy hem de içeren bir kök hücre bölmesinden kaynaklanan sürekli kript-tomurcuklanan olaylar yanı sıra villus benzeri epitel etki ile bağırsak fizyolojisi tartışıldı. İlginçtir, bu sistem herhangi bir mezenkimal hücreler içeren ve niş sinyal gereksinimlerini karşılamak için özel ortam koşulları kullanır.
Kemirgen modeli gibi, insan enteroids kök hücresi gibi işlev için, bu hücrelerin kapasitesini test etmek için izole edilen bağırsak epitelial hücreler elde edilebilir. Several çalışmalar kök özellikleri 12,23,33 hücrelerin zenginleştirilmesi için farklılaşma markörünü (CD44, CD24 veya CD166) ile EPHB2'ye pozitif hücrelerin küme kullandık. Bununla birlikte, bu çalışmalar stemness test etmek için, insan enteroids kültürlerinin kullanımı ortaya koyan. Diğer araştırmacılar, bulaşıcı ishalli hastalıklar, kistik fibroz, ya da kolorektal kanserler 22,34-37 gibi bağırsak hastalıkları araştırmak için bu modeli kullanıyor. Bu çalışmalar, insan enteroids kişiselleştirilmiş tarama doğru taşımak için bir olasılık ile güvenilir bir insan hastalık modeli oluşturduğunu göstermektedir. İnsan enteroids genetik viral parçacıkların 38 DNA transfeksiyon ya da enfeksiyon ile değiştirilebilir. Bu insan epitel organoids veya doğru genetik mutasyonlar içinde gen-özel işlevlerini incelemek için güçlü bir araç sağlar. Son zamanlarda, Schwank ve arkadaşları CFTR gen neden ac üzerinde mutasyon CRISPR / Cas9 sistemi ile genomu düzenlemek ve düzeltmek imkanı gösterdiystic fibroz 24. İnsan enteroids bağırsak kök-hücre ve epitel mukozal biyoloji çalışma, normal ve anormal hem de gastrointestinal fizyoloji incelemek için yeni bir deneysel sistemi olarak hizmet için değerli bir sistem oluştururlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | |
| Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Fischer Scientific | BP1600-100 | |
| Gzntamycin/Amphotericin B solution | Life technologies; Gibco | R-015-10 | |
| Wnt-3A conditioned medium | in house | ||
| Advanced DMEM/F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 | |
| HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 | |
| GlutaMAX (glutamine) | Life technologies; Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies; Gibco | 15140-148 | |
| N2 Supplement | Life technologies; Gibco | 17502-048 | |
| B27 Supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| human recombinant Noggin | R&D | 6057-NG/CF | |
| human recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 | |
| human recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | |
| human [Leu]15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) | Life technologies; Gibco | 12605-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 | |
| CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 | |
| L Wnt-3A cell line | ATCC | CRL-2647 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2710 | |
| human recombinant Wnt-3A | R&D | 5036-WN/CF | |
| HEK293 TOPflash cell line |
References
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).
- Shroyer, N. F., Kocoshis, S. Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases. Hyams, J. R. W. III , Elsevier. 324-336 (2010).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. , (2014).
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).
- Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).
- Furstenberg, R. J., et al. Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).
- Wang, F., et al. Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay. Gastroenterology. , (2013).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).
- Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Akcora, D., et al. The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche. Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).
- Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
- Lau, W., et al. Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts. Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. , (2014).
- Fuller, M. K., et al. Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage. Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Koo, B. K., Clevers, H. Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5. Gastroenterology. , (2014).
- Li, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).
- Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).
- Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med (Maywood). , (2014).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Kovbasnjuk, O., et al. Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S3 (2013).
- Fujii, M., Sato, T. Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research. Front Genet. 5, 169 (2014).
- Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. Retroviral gene expression control in primary organoid cultures. Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).
