Introduction
Foringen epitel af mavetarmkanalen er i konstant fornyelse. Denne proces er udløst af proliferation af intestinale stamceller (HTT), som kontinuerligt producerer afkom hurtigt erstatte tarmepitelet som det vender. Den proliferative rum omfattende individuelle servicekontrakter er begrænset til bunden af krypter. De ISC giver anledning til afkom, der i sidste ende differentiere til absorberende eller sekretorisk afstamninger. Flytning af krypten og på villus eller overfladen epitel celler differentiere gradvist, når de trækker opad før eksfoliering i lumen 1. ISC giver anledning til alle intestinale epitelceller celletyper, herunder enterocytter, microfold celler, enteroendocrine celler, bægerceller, tuftede celler og Paneth celler. Den kolon er præget af langstrakte krypter sammensat hovedsageligt af colonocytter og slimceller, med spredte enteroendokrin og tot celler 2.
Ex vivo cultidige systemer udgør lovende redskab til at studere ISC vedligeholdelse og tarm vævshomeostase. Det er imidlertid vanskeligt at stole på vævskultur teknologier fysiologiske betingelser ikke gengivet i deres helhed, og epitel mikromiljø ofte ændret 3,4. En stor avancement i ISC felt var etableringen af vævsdyrkningsteknikker at fastholde og udbygge de enkelte murine individuelle servicekontrakter hjælp definerede vækstfaktorer til at erstatte de normale tarm niche signaler. Dyrkningsbetingelser Langsigtede blev beskrevet af Sato et al., Hvori en enkelt krypter eller isolerede stamceller fra tarmepitelet vokse til dannelse af 3-dimensionelle epiteliale strukturer, herunder flere crypt-lignende domæner 5-7. Disse tredimensionale strukturer undergår fission arrangementer til løbende udvide. Interessant er alle intestinale celletyper specifikke væv produceret og såvel ekstruderes i et lumen 8. Brug modifikationer af dette system, epithelialorganoids kan genereres fra maven, tyndtarmen og tyktarmen. Mere specifikt epiteliale organoids fra tyndtarmen er enteroids 9, og dem fra tyktarmen er colonoids 9,10. Disse epitelceller organoide kultur er blevet anvendt til at teste evnen af isolerede enkeltceller til at fungere som stamceller in vitro, således at teste "stemness" af isolerede celler 5,6,10-15. Andre forskere har anvendt både enteroids og colonoids at undersøge funktionen af de enkelte epitelceller 16-21. Således kan enteroid og colonoid kulturer anvendes til at evaluere både stamceller og ikke-stamceller funktioner og give ny indsigt i de grundlæggende cellulære interaktioner inden tarmene.
I 2011 Sato og kolleger genereret langsigtede kultur af epitelial organoids afledt af human tyndtarm og tyktarm 22,23. Udover forskelle i medier sammensætning, de humane epiteliale enteroidsog colonoids udviser de samme funktioner som deres murine modstykke. Desuden kan de genereres fra syge væv, såsom Barretts øsofagus, adenom eller adenocarcinom, og cystisk fibrose 22,24. Menneskelige enteroids udgør et værdifuldt system til at studere intestinal stamceller og epithelial mucosal biologi og tjene som et nyt eksperimentelt system til at undersøge både normal og unormal gastrointestinal fysiologi 3.
Her beskriver vi metoder til at etablere enteroids og colonoids fra human tyndtarm og colon krypter (Figur 1). I denne metodiske gennemgang, understreger vi krypten samling fra hele væv og biopsier. Vi rekapitulere kultur- modaliteter, der er afgørende for en vellykket vækst og vedligeholdelse af menneskelige enteroids og colonoids og de mulige eksperimentelle strategier udført af denne model.
Protocol
BEMÆRK: Etik Statement: Alle forsøg anvendes humane væv beskrevet heri blev godkendt af en IRB på CCHMC (IRB # 2012-2858; # 2014 til 0427). Informeret samtykke til væv indsamling, opbevaring og anvendelse af prøverne er indhentet fra donorer på CCHMC.
1. til kultur
BEMÆRK: Alle reagenser er angivet i tabel 1.
- EDTA stamopløsning fremstilles som følger: forberede 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre, pH 8 (EDTA) i ultrarent H2O, filtersteriliseret med 0,22 um filter. Eventuelt gemme EDTA stamopløsning ved stuetemperatur på ubestemt tid.
- Forbered chelaterende buffer som følger: Bland 2% sorbitol, 1% saccharose, 1% bovint serumalbumin fraktion V (BSA) og 1x Gentamicin / Amphotericin opløsning i Dulbeccos phosphatbufrede saltopløsning uden Ca 2+ og Mg 2+ (DPBS), filtersteriliseret med 0,22 um filter. Forbered chelaterende bufFer frisk.
- Forbered Wnt-3A-konditioneret medium som følger: Wnt-3A-konditioneret medium er lavet i huset ved hjælp cellelinien L Wnt-3A i henhold til producentens anvisninger (ATCC, CRL-2647). Supplement mediet med 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 g / ml streptomycin, 1 N2 supplement, 1 B27 supplement, 1% BSA og filtersteriliseret med 0,22 um filter.
BEMÆRK: Test hver batch for Wnt med anvendelse af TOPflash assay. Brug en stabil HEK293 TOPflash cellelinie (Hans Clevers lab) med et Renilla luciferase assay kit ifølge producentens anvisninger. Normalisere TOPflash assay med 100 ng / ml human rekombinant Wnt-3A. Bekræft mindst 10 fold-change aktivitet af de konditionerede medier sammenlignet med kontrol. Opdel frisk Wnt-3A-medium i 10 ml portioner i 15 ml koniske rør og fryse ved -20 ° C i op til 6 måneder. Store optøet portioner op til 5 dage ved 4 ° C uden tab af aktivitet. - Prepare human minigut medium som følger: Supplement Advanced DMEM / F12-medium med 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 g / ml streptomycin, 1 N2 supplement, 1 B27 supplement, 1% BSA og filtersteriliseret med 0,22 um filter.
BEMÆRK: Opdel frisk menneske minigut medium i 10 ml portioner i 15 ml koniske rør og fryse ved -20 ° C i op til 3 måneder. Store optøet portioner op til 5 dage ved 4 ° C uden tab af aktivitet. - Forbered helt menneske minigut medium som følger: Forbered frisk før krypt kultur eller medium ændre den menneskelige minigut medium (se 1.4) suppleret med 50% Wnt-3A-medium (se 1.3), 1 ug / ml R-spondin 1 (1: 1.000 fortynding af 1 mg / ml stock), 100 ng / ml Noggin (1: 1.000 fortynding af 100 g / ml stamopløsning), 50 ng / ml EGF (1: 10.000 fortynding af 500 ug / ml stamopløsning), 500 nM A-83 -01 (1: 1000 fortynding af 500 M materiel), 10 pM SB202190 (1: 3.000 fortynding af 30 mM lager), 10 nM [Leu] 15-Gastrin 1 (1: 10.000 fortynding af 100 ummateriel), 10 mM nicotinamid (1: 100 fortynding af 1 M stamopløsning) og 1 mM N-acetylcystein (1: 1000 fortynding af 1 M stock).
BEMÆRK: Opbevar komplette humane minigut medier op til 2 dage ved 4 ° C uden tab af aktivitet.
2. Crypt Isolering fra Whole Tissue
BEMÆRK: Fra vævet indsamling, er det vigtigt at opretholde prøven i saltvand. Det anbefales at holde væv på is under transporten. Forberedelse af prøven til isolation af krypt skal udføres så hurtigt som muligt.
BEMÆRK: Alle reagenser er angivet i tabel 1, værktøj, udstyr og hjælpematerialer er anført i tabel 2.
- Forbered alle reagenser inden de påbegynder forsøget. Optøs basalmembranmatrix på is og præinkuberes en 24-brønds plade i en CO2-inkubator ved 37 ° C.
BEMÆRK: Alternativt gøre et tyndt lag basalmembranmatrix anvendelse af 15 gl / brønd i midten af en 24-godt plade og læg den i en CO2-inkubator ved 37 ° C. Denne fakultative trin holder basalmembranen matrix som en dråbe under polymerisation. - Vask væv med iskold Dulbeccos phosphatbufrede saltopløsning uden Ca 2+ og Mg 2+ (DPBS). Fortsæt indtil indholdet af DPBS er klar.
- Brug 0,2 mm stifter diameter minutien, fastgøre væv på en silikone-belagt glas petriskål fyldt med iskoldt DPBS. Stræk og pin vævet fladt med slimhinden opad.
- Under et dissektionsmikroskop, fjerne overliggende slimhinde fra submucosa og bindevæv hjælp mikro-dissekere saks og fin spids buede pincet (figur 2A, B).
- Stræk og pin det dissekerede slimhinde fladt på silikone-belagte glas petriskål med mucosal opad. Den resterende submucosa og bindevæv kan kasseres eller anvendes til yderligere eksperimenter (figur 2C).
- Forsigtigtskrabe overfladen af slimhinden med buede pincet. Dette trin er nødvendigt for at forbedre kvaliteten af præparatet.
- For tyndtarmen, skrab forsigtigt slimhinden for at fjerne villi.
- For kolon, forsigtigt skrabe slimhinden til at fjerne slim og snavs.
- Vask slimhinden 3-4 gange med iskold chelation buffer til fjernelse villi og snavs.
- Dæk slimhinden med frisk fremstillet 2 mM EDTA chelation buffer (200 pi 0,5 M EDTA i 49,6 ml chelation buffer).
- Placer petriskål på is og ryst forsigtigt i 30 minutter på en vandret orbitalryster.
- Vask vævet 3-4 gange med iskold kelation buffer uden EDTA. Efter vask, forlader slimhinden i iskold kelation buffer.
- Proces slimhinden under et dissektionsmikroskop ved hjælp af krumme og fin pincet. Forsigtigt skrabe slimhinden til at frigive intestinale krypter hjælp af buede pincet.
- Fjern forsigtigt krypten suspension fra petriskålen ved hjælp af en piPette og overføre det til en 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: kontroller vævet for at sikre, at næsten alle krypter er blevet fjernet fra slimhinden. - Filtrer krypter suspensionen gennem en 150 um mesh 2 gange.
BEMÆRK: kontroller gennemløbet for krypt berigelse under et mikroskop (figur 2D). - Centrifugeres krypten suspension 5 minutter ved 50 x g, 4 ° C. Supernatanten fjernes.
- Resuspender pellet i 5 ml iskold chelation buffer.
- Tæl antallet af krypter pr 10 pi fald fra suspensionen fra trin 2.15. Overfør antallet af krypter nødvendige for udpladning til en 5 ml rundbundet rør. Brug 200 til 500 krypter pr brønd af en 24-brønds skål til at etablere enteroids eller colonoids.
- Centrifuge krypten fraktion i 10 minutter ved 150 g, 4 ° C. Fjern supernatanten.
- Brug krypter til efterfølgende kultur.
3. Crypt Isolering fra biopsi
- Forbered alle reagenser førbegyndelsen af eksperimentet. Optøs basalmembranmatrix på is og præinkuberes en 24-brønds plade i en CO2-inkubator ved 37 ° C.
- Vask biopsi med iskold Dulbeccos phosphatbufrede saltopløsning uden Ca 2+ og Mg 2+ (DPBS).
- Brug 0,1 mm diameter minutien stifter, fastgøre biopsi på en silikone-belagt glas petriskål fyldt med iskoldt DPBS. Stræk og pin slimhinden flad med slimhinden opad (Figur 2E).
- Forsigtigt skrabe overfladen af slimhinden med buede pincet til at fjerne villi og snavs. Dette trin er nødvendigt for at forbedre kvaliteten af præparatet.
- Vask biopsi 3-4 gange med iskold chelation buffer til fjernelse villi og snavs.
- Dæk biopsi med frisk fremstillet 2 mM EDTA chelation buffer (200 pi 0,5 M EDTA i 49,8 ml chelation buffer).
- Placer petriskål på is og ryst forsigtigt i 30 minutter på en vandret orbitalryster. <li> Vask biopsi 3-4 gange med iskold kelation buffer uden EDTA. Efter vask, forlader biopsi i iskold kelation buffer.
- Proces biopsi under et dissektionsmikroskop ved hjælp af krumme og fin pincet. Forsigtigt skrabe slimhinden at frigive de intestinale krypter hjælp buede pincet.
- Fjern forsigtigt krypten suspension fra petriskål med en pipette og overføres til en 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: kontroller vævet for at sikre, at næsten alle krypter er blevet fjernet fra slimhinden. - Filtrer krypten suspensionen gennem en 150 um nylon mesh 2 gange.
BEMÆRK: kontroller gennemløbet for krypt berigelse under et mikroskop. - Centrifugeres krypten suspension 5 minutter ved 50 x g, 4 ° C. Supernatanten fjernes.
- Pellet resuspenderes i 1 ml iskold kelation buffer. Overfør krypten suspensionen til et 1,5 ml mikrofugerør.
- Centrifuge krypten fraktion i 10 minutter ved 150 xg, 4 ° C. Fjern supernatanten. </ Li>
- Brug krypter til efterfølgende kultur.
4. Crypt Kultur i basalmembranmatrix
- Brug af pre-kølede pipettespidser, resuspender krypten pellet (fra trin 2,18 eller 3,15) i basalmembran matrix (200 til 500 krypter / 50 pi basalmembran matrix).
- Påfør 50 pi krypt suspension i basalmembranmatrix per brønd på forvarmet plade. Langsomt skubbe basalmembranmatrix i centrum af brønden.
- Placer plade med 24 brønde i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator i 30 minutter for at tillade en fuldstændig polymerisation af basalmembranen matrix.
- Overlay basalmembranen matrix med 500 pi helt menneske minigut medium suppleret med 2,5 uM CHIR99021 (1: 4.000 fortynding af 10 mM lager) og 2,5 uM Thiazovivin (1: 4.000 fortynding af 10 mM lager).
- Inkubér pladen i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
- Udskift mediet med frisk komplet human minigut mellemstore hver 2 dage.
5. Passage af dyrkede Enteroids og Colonoids.
BEMÆRK: Passage Enteroids og Colonoids hver 7 til 10 dage efter første plating. Generelt opdele en godt i 3 til 4 brønde.
- Forbered alle reagenser inden begyndelsen af eksperimentet. Optøs basalmembranmatrix på is og præinkuberes en 24-brønds plade i en CO2-inkubator ved 37 ° C.
- Fjern mediet med sterile tips og overlay med 1 ml iskold DPBS.
- Pipette frem og tilbage med en 1.000 pi tip. Opløsningen overføres i en ny 15 ml konisk rør.
- Tilsæt 2 ml humant minigut medium suppleret med 5% FBS pr 1 ml medium.
- Centrifuger opløsningen i 5 minutter ved 50 x g, 4 ° C. Supernatanten fjernes.
- Resuspender pelleten med 2 ml celle dissociation enzym suppleret med 10 pM Y-27632 (1: 1000 fortynding af 10 mM stamopløsning). Inkuber i 5 mi ved 37 ° C i et vandbad.
- Dissociere celleklumper anvendelse af en 3 ml luer-lock sprøjte udstyret med en 18-G påfyldnings- / stump nål. Pipettér forsigtigt opløsningen frem og tilbage ved hjælp af sprøjten 10 gange.
- Centrifugeres suspensionen i 5 minutter ved 500 xg, 4 ° C. Supernatanten fjernes.
- Brug af pre-kølede pipettespidser, resuspender cellepelleten i basalmembran matrix.
- Påfør 50 pi krypt suspension i basalmembranmatrix per brønd på forvarmet plade. Langsomt skubbe basalmembranmatrix i centrum af brønden.
- Placer plade med 24 brønde i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator i 20 minutter for at tillade en fuldstændig polymerisation af basalmembranen matrix.
- Overlay basalmembranen matrix med 500 pi af komplet human minigut medium suppleret med 10 pM Y-27632 (1: 1000 fortynding af 10 mM stamopløsning).
- Inkubér pladen i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
- Efter 2 dagesUdskifte mediet med frisk komplet human minigut medium suppleret med 10 pM Y-27632 (1: 1000 fortynding af 10 mM stamopløsning). Derefter udskiftes mediet med frisk, komplet human minigut medium hver anden dag.
6. Indefrysning af dyrkede Enteroids og Colonoids
BEMÆRK: Normalt fryse et godt stykke ind i 2-3 kryoglas.
- Gentag trin 5.1 til 5.8.
- Resuspender pellet med koldt frysning medium. Overfør 1 ml frysning opløsning i en mærket kryoglas. Placer kryoglas i en frysning beholder indeholdende 500 ml isopropylalkohol.
- Overfør frysning beholder til en 80 ° C fryser i 24 timer, og derefter overføre kryoglas til lagring i flydende nitrogen.
BEMÆRK: Opbevar Enteroids og Colonoids i op til 1 år.
Representative Results
Figur 2D viser et typisk eksempel på frisk isolerede krypter fra hele væv (figur 2D). Antallet af krypter isoleret fra en biopsi er lavere end i hele væv. Brug standard kapacitet biopsi pincet med nål, vi normalt udfører to biopsi bites på en enkelt pass. Hver biopsi bid resulterer i en 10 mm 2 overflade med et gennemsnit på 50 til 100 krypter pr biopsi (figur 2F).
Efter kultur basalmembranmatrix, krypter runde op til at danne enterospheres til tyndtarmen og colonospheres til tyktarmen. Krypten spirende sker normalt inden for 5 til 6 dage efter såning. Men det er ikke usædvanligt at se enten enteroids (enteroids) eller colonoids (colonoids) danner kugler i basalmembranen matrix (figur 3A-C, Movie 1). Den passage kan ske efter 7 dage, afhængigt af størrelsen af enteroids. Den enteroids eller colonoids established fra biopsier gennemgå den samme udvikling i kultur. Men som krypt massefylde ved podning er lavere, passage sker normalt efter 10 til 12 dage i kultur (figur 4a, b). Enteroids og colonoids kulturer ekspandere på en reproducerbar måde.
Både enteroids og colonoids fremlægge et luminale side og er foret med en epitel (figur 5A, B). Proliferative celler kan observeres inden for de enteroids og er placeret inden for de bud tips (figur 5C, D). Konfokal billeddannelse af enteroids farvet med E-cadherin (ECAD) viser de epithelceller (figur 5E).
Kan påvises enteroids og colonoids fra væv opnået fra patienter med genetiske / medfødte lidelser. Figur 6 viser repræsentative enteroids vokser fra en patient med cystisk fibrose (figur 6A) og en tufting enteropati på grund af en medfødt mutation i epitelcelle adsamhørighedslandene molekylgen (EpCAM) (figur 6B). Ved siden af den genetiske defekt, behøver de enteroids ikke udviser forskelle i basal tilstand.
Figur 1. Workflow af krypter dissociation og generering af menneskelige enteroids og colonoids i kultur. Cryptocoryner (fra human tyndtarm eller tyktarm) isoleres ved EDTA chelation. Dyrkede krypter danner enteroids til tyndtarmen og colonoids til tyktarmen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Dissektion fremgangsmåde til krypt isolation. (A) Tyndtarmen specimen er strakt og fastgjort fladt i en silicone-coatet petriskål. (B) Slimhinden er adskilt fra den underliggende submucosa. (C) det dissekerede slimhinde strækkes og fastgjort fladt i en silicone-coatet petriskål. (D) Efter EDTA chelation er krypterne isoleret fra vævet. (E) En biopsi strakt og fastgjort fladt i en silicone-coatet petriskål. (F) Efter EDTA chelation, krypter er isoleret fra biopsi. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Crypt kultur og menneskelig enteroid og colonoid generation fra hele væv. (A) jejunal krypter forgyldt i basalmembranmatrix efter isolering. De krypter lukker op efter 3 til 4 timer og begynder at ballonen op til at danne enterospheres ud over dette tidspunkt. Ved 7 dage, dannes jejunale enteroids. (B) Efter isolering og kultur, ileum krypter opføre sig som de jejunale krypter og danne ileum enteroids. (C) Colon krypter udplades i basalmembranmatrix efter isolering. Krypter tæt og danner colonoids efter 7 dage (Scale barer: 100 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Crypt kultur og menneskelig enteroid og colonoid generation fra biopsi. (A) Ulcus krypter forgyldt i basalmembranmatrix efter isolering. De krypter lukker op efter 3 til 4 timer og begynder at ballonen op beyond denne gang til at danne enterospheres. Ved 7 dage, dannes enteroids. (B) Efter isolering og kultur, er colon krypter forgyldt i basalmembran matrix. De krypter tæt op for at danne colonospheres så colonoids efter 7 dage (Scale barer: 100 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Intestinal slægter af de humane enteroids. (A) Menneskelig enteroid efter 6 dage i kultur. (B) Hematoxylin-eosin dele af enteroids i (A) viser epitelforingen (Scale barer: 100 um). (CD) Konfokal afbildning af enteroids efter edu farvning (magenta) viser tilstedeværelse af proliferative celler. (E Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Crypt kultur og menneskelig enteroid generation fra sygt væv. (A) Enteroids etableret fra en cystisk fibrose prøve. (B) Enteroids etableret fra en medfødt væveri enteropati prøve (Scale barer: 100 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Movie 1. Enterosphere danner menneskelig enteroid i kultur. 32 timers time-omgangee film viser en enterosphere etableret fra human tyndtarm udkørsel at danne en enteroid i kultur. Klik her for at se denne video.
| Navn Reagens | Firma | Catalog Number | Opløsningsmiddel | Stock Concentration | Slutkoncentration | Kommentar |
| Dulbeccos phosphatbufrede saltvand Ca 2+, Mg2 + fri (DPBS) | Life teknologier; Gibco | 14190-144 | - | - | 1x | |
| Ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431.788 | Ultrarent dH2O | 2 mM | ||
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | DPBS | Pulver | 2% | |
| Saccharose | Fischer Scientific | BP220-1 | DPBS | Pulver | 1% | |
| Bovint serumalbumin (BSA) Fraktion V | Fischer Scientific | BP1600-100 | DPBS | Pulver | 1% | |
| Gzntamycin / amphotericin B-opløsning | Life teknologier; Gibco | R-015-10 | - | 500x | 1x | |
| Wnt-3A conditionned medium | i hus | - | - | - | - | |
| Avanceret DMEM / F12 | Life teknologier; Gibco | 12634-028 | - | - | - | |
| HEPES 1M | Life teknologier; Gibco | 15630-080 | - | 1 M | 10 mM | |
| GlutaMAX (glutamin) | Life teknologier; Gibco | 35050-061 | - | 100X | 1X | |
| Penicillin-streptomycin (10.000 U / ml) | Life teknologier; Gibco | 15140-148 | - | 100X | 1X | |
| N2 Supplement | Life teknologier; Gibco | 17502-048 | - | 100X | 1X | |
| B27 Supplement | Life teknologier; Gibco | 17504-044 | - | 50X | 1X | |
| N-acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165-5G | DPBS | 1 M | 1 mM | </ Td> |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | DPBS | 1 M | 10 mM | |
| Matrigel, GFR, phenol gratis (basalmembran matrix) | Corning | 356.231 | - | - | - | PÅKRÆVET |
| human rekombinant Noggin | F & U | 6057-NG / CF | DPBS | 100 ug / ml | 100 ng / ml | Andre leverandører: F & U; Anaspec og Preprotech |
| human rekombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 | DPBS | 1 mg / ml | 1 ug / ml | |
| human rekombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | DBP under | 500 ug / ml | 50 ng / ml | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | DPBS | 10 mM | 10 uM | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | DMSO | 500 um | 500 nM | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | DMSO | 30 mM | 10 uM | |
| human [Leu] 15 Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | DPBS | 100 um | 10 nM | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | DMSO | 10 mM | 2,5 uM | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | DMSO | 10 mM | 2,5 uM | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenolrødt (celle dissociation enzym) | Life teknologier; Gibco | 12605-010 | - | - | - | For passage |
| Kalvefosterserum | Life teknologier; Gibco | 10082-147 | - | - | - | For passage |
| CTS Synth-a-Freeze Medium (frysemedium) | Life teknologier; Gibco | A13713-01 | - | - | - | Til frysning |
| L Wnt-3A cellelinie | ATCC | CRL-2647 | - | - | - | Wnt-3A conditionned medieproduktion |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2710 | - | - | - | Wnt-3A conditionned medieaktivitet |
| human rekombinant Wnt-3A | F & U | 5036-WN / CF | DPBS | 100 ug / ml | 100 ng / ml | |
| HEK293 TOPflash cellelinie | - | - | - | - | - | Wnt-3A conditionned medier aktivitet; Gave fra Hans Clevers laboratorium |
Tabel 1. Detaljerede reagenslisten med foretrukne producent og katalognummer.
| Udstyr | Forbrugsstoffer | Værktøj |
| Laminar flow hætte | 15- og 50 ml koniske rør | Dumont # 5 standard pincet (FST; # 11251-20) |
| CO2-inkubator | Mikrocentrifugerør | Dumont # 7, buede fine pincet (FST; # 11274-20) |
| Stereomikroskop | 24-brønds plader | Fin saks (FST; # 14060-09) | 0,22 um filtre (Sartorius) | Vännäs foråret saks (FST; # 15018-10) |
| Orbital shaker | Serologiske pipetter | 0,2 mm stifter diameter minutien (FST; # 26002-20) |
| Frysning beholder (Nalgene) | Mikropipette tips | 0,1 mm stifter diameter minutien (FST; # 26002-10) |
| Sylgard 184 Silicone (Dow Corning) | 150 um maskestørrelse, nylon screening (Dynamic Aqua-forsyning) | |
| Glas petriskål | 5 ml rundbundet polypropylenrør (Falcon) | |
| Serologisk pipettor | 18G stump fyld nål (BD) | |
| Mikropipette | 3 ml lsyringes med Luer-Lock tips (BD) | |
| Kryoglas |
Discussion
Denne metode giver et komplet system gengivelse tarm epiteliale slægter og epiteliale dynamik, der udgør et nyttigt redskab til at studere intestinal epitel biologi. Den præsenteret heri metode blev tilpasset fra den oprindelige murine undersøgelse fra Sato og Clevers 22, der effektivt resulterer i menneskelige enteroids og colonoids. Her har vi manuelt hentet krypter af mikrodissektion at undgå cellulære kontaminanter. Denne metode giver en direkte visualisering af krypter og fører til ensartethed overarbejde i forhold til den oprindelige krypten samling ved "ryste". Andre grupper har udviklet lignende teknik hjælp lidt forskellige tilgange især erstatter chelatering af EDTA med collagenase 25. Ud over de forskelle i krypt samling disse teknikker anvender et definerede medier, der kræves til dyrkning af humane enteroids i kultur 22. For at øge væksten effektivitet på krypt såning, tilføjer vi en GSK3 hæmmer (CHIR99021)for de første to dage 12.
Håndteringen af væv eller biopsier er vigtig, og krypten isolation skal udføres, så snart vævet ankommer i laboratoriet. Imidlertid kunne forsinket crypt isolation og kultur udføres op til 24 timer efter væv indsamling (data ikke vist) som tidligere beskrevet for murine væv 26. Tarmvævet bør placeres i et konisk rør helt fyldt med DPBS at undgå vævsødelæggelse og bør holdes på 4 ° C. Den forsinkede forberedelse tillader væv skibsfart men temperaturudsving bør undgås under transport. Den samlede tid, der kræves til den indledende krypt plating er ca. 2 timer med 15 til 30 min at behandle vævet og 1 til 2 timer for at isolere og pladen krypten. Den mikrodissektion af vævet er en kritisk determinant og prædikat af en ren krypt præparat. Imidlertid krypten frigivelse ved hånd-omrystning som beskrevet i forskellige protokoller er muligt 22,23.
På trods af de ligheder med systemet murine enteroid (enteroids), de menneskelige enteroids kræver specifikke molekyler kan styrke og bevare deres vækst over tid. De vækstfaktorer er EGF, Noggin, R-spondin bruges på samme måde som de murine epitel organoids. Men anvendelsen af Wnt-3A er kritisk. Vi bemærkede, at formationen samt effektiviteten vækst er større ved anvendelse af et Wnt-3A konditioneret medium end det humane rekombinante protein. Sideløbende har vi demonstreret forbedrede dyrkningsbetingelser under anvendelse af en inhibitor af glycogen synthase kinase 3 (CHIR99021) 12. Rekombinante vækstfaktorer kunne erstattes af Wnt-3A, R-spondin, og Noggin konditioneret-medier. En Wnt-3A-udtrykkende L-cellelinie er kommercielt tilgængelig (ATCC). Andre grupper har udviklet R-spondin 1- 23,27, Noggin- 19, og Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 udtrykker cellelinjer. To små molekyle inhibitorer anvendes i kulturen migdia og er nødvendige til opretholdelse af kulturen 29. A-83-01 er en selektiv inhibitor af transformerende vækstfaktor β og activin / Nodal receptorer (activin-lignende kinase 4, 5, 7) og SB202190 er en p38 mitogen-aktiveret protein kinase inhibitor (MAPK). Begge inhibitorer er blevet anvendt henholdsvis at opretholde menneskeskabte pluripotente stamceller selvfornyelse og etablere menneskelige naive pluripotente stamceller 30-32. Også nikotinamid, en forløber for nikotinamidadenindinucleotid, er forpligtet til at opretholde enteroids og colonoids ekspansion i en langsigtet måde 22,29.
EDTA chelation er et vigtigt skridt, da det bestemmer udbyttet fra præparatet krypt. Vi har haft succes med 2 mM EDTA-behandling. Imidlertid kan EDTA koncentrationen ændres fra 2 mM til 15 mM med hensyn til typen af væv. I dette tilfælde inkubationstid skal bestemmes empirisk. Efter den første plating, vil krypten runde-up og i sidste ende danne enteroids. Men enteroids eller colonoids ofte demonstrere en "stamme" fænotype ved at danne kugler med lidt at ingen differentierede celler. I dette tilfælde kan differentiering initieres ved at trække Wnt-3A, nicotinamid og p38 MAPK inhibitor. Brugen af Notch inhibitor såsom DAPT eller DBZ hjælper øge differentieringen inden for enteroids 22.
Denne model rekapitulerer tarmens fysiologi med løbende krypt-spirende hændelser skyldes en knoglemarven samt villus-lignende epiteliale domæner, der indeholder både absorberende og sekretoriske differentierede afstamninger. Interessant, er dette system ikke indeholder nogen mesenkymale celler og bruger særlige medieforhold at opfylde niche signal krav.
Ligesom murin model kan humane enteroids genereres fra isolerede intestinale epitelceller til at teste kapaciteten af disse celler til at fungere som en stamcelle. SeveRAL undersøgelser har brugt klynge af differentieringsmarkører (CD44, CD24 eller CD166) og EPHB2 positive celler til at berige for celler med stamceller egenskaber 12,23,33. Tilsammen udgør disse undersøgelser viser nytten af menneskelige enteroids kulturer for at teste stemness. Andre forskere bruger denne model til at undersøge tarmsygdomme såsom smitsomme diarrésygdomme, cystisk fibrose eller kolorektale cancere 22,34-37. Disse undersøgelser viser, at menneskelige enteroids udgør en pålidelig sygdomsmodel menneske med mulighed for at arbejde hen imod en personlig screening. Menneskelige enteroids kan genetisk modificeret ved hjælp af DNA-transfektion eller infektion med virale partikler 38. Dette giver et kraftfuldt værktøj til at studere gen-specifikke funktioner i det menneskelige epiteliale organoids eller rette genetiske mutationer. For nylig Schwank og kolleger viste muligheden for at redigere genomet med CRISPR / Cas9 systemet og korrigere mutationen på CFTR-genet forårsager acystic fibrose 24. Menneskelige enteroids udgør et værdifuldt system til at studere intestinal stamceller og epithelial mucosal biologi og tjene som et nyt eksperimentelt system til at undersøge både normal og unormal gastrointestinal fysiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | |
| Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Fischer Scientific | BP1600-100 | |
| Gzntamycin/Amphotericin B solution | Life technologies; Gibco | R-015-10 | |
| Wnt-3A conditioned medium | in house | ||
| Advanced DMEM/F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 | |
| HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 | |
| GlutaMAX (glutamine) | Life technologies; Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies; Gibco | 15140-148 | |
| N2 Supplement | Life technologies; Gibco | 17502-048 | |
| B27 Supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| human recombinant Noggin | R&D | 6057-NG/CF | |
| human recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 | |
| human recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | |
| human [Leu]15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) | Life technologies; Gibco | 12605-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 | |
| CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 | |
| L Wnt-3A cell line | ATCC | CRL-2647 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2710 | |
| human recombinant Wnt-3A | R&D | 5036-WN/CF | |
| HEK293 TOPflash cell line |
References
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).
- Shroyer, N. F., Kocoshis, S. Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases. Hyams, J. R. W. III , Elsevier. 324-336 (2010).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. , (2014).
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).
- Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).
- Furstenberg, R. J., et al. Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).
- Wang, F., et al. Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay. Gastroenterology. , (2013).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).
- Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Akcora, D., et al. The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche. Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).
- Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
- Lau, W., et al. Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts. Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. , (2014).
- Fuller, M. K., et al. Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage. Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Koo, B. K., Clevers, H. Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5. Gastroenterology. , (2014).
- Li, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).
- Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).
- Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med (Maywood). , (2014).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Kovbasnjuk, O., et al. Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S3 (2013).
- Fujii, M., Sato, T. Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research. Front Genet. 5, 169 (2014).
- Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. Retroviral gene expression control in primary organoid cultures. Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).
