Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Published: March 17, 2015 doi: 10.3791/52484

Summary

שיטות שונות רבות קיימות למדידה של שלפוחית ​​תאית (EVS) באמצעות cytometry זרימה (FCM). כמה היבטים יש לשקול בעת קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. שני פרוטוקולים לכלי רכב חשמליים מדידה מוצגים, או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז.

Abstract

תאי שלפוחית ​​(EVS) היא שלפוחית ​​שנמצאה בנוזלי גוף, כי הם מעורבים מאוד בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים קטנה, המופק מקרום. ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות cytometry זרימה (FCM) כבר קשה לשמצה בשל גודלם הקטן וחוסר אוכלוסיות בדידות חיוביות לסמנים של עניין. שיטות לניתוח EV, תוך שיפור ניכר בעשור האחרון, עדיין בתהליך עבודה. למרבה הצער, אין אף אחד בגודל שמתאים לכל פרוטוקול, וכמה היבטים יש לקחת בחשבון בעת ​​קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. מוצג כאן מספר טכניקות שונות לכלי רכב חשמליים עיבוד ושני פרוטוקולים לניתוח כלי רכב חשמליים או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. השיטות שתוארו כאן יסייע בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, יחס אות לרעש גובר, ושערים הגדרה בf רציונליםashion שממזער גילוי של הקרינה רקע. הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוז כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.

Introduction

תאי שלפוחית ​​(EVS) היא שלפוחית ​​שנמצאה בנוזלי גוף, כי הם מעורבים מאוד בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים קטנה, המופק מקרום. ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות cytometry זרימה (FCM) כבר קשה לשמצה בשל גודלם הקטן וחוסר אוכלוסיות בדידות חיוביות לסמנים של עניין. שיטות לניתוח EV, תוך שיפור ניכר בעשור האחרון, עדיין בתהליך עבודה. למרבה הצער, אין אף אחד בגודל שמתאים לכל פרוטוקול, וכמה היבטים יש לקחת בחשבון בעת ​​קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. מוצג כאן מספר טכניקות שונות לכלי רכב חשמליים עיבוד ושני פרוטוקולים לניתוח כלי רכב חשמליים או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. השיטות שתוארו כאן יסייע בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, יחס אות לרעש גובר, ושערים הגדרה בf רציונליםashion שממזער גילוי של הקרינה רקע. הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוז כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.

כלי רכב חשמליים, הידוע גם בmicroparticles, הם שלפוחית ​​שנמצאה בנוזלי גוף שמעורבים בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים 1 קטנה, המופק מקרום. דרך ביטוי של סמנים שונים משטח ו / או העברה ישירה של חומר ביולוגי, כלי רכב חשמליים יכולים לשנות את התפקוד של תאי נמען לשחק או הפעלה או דיכוי תפקידים בתקשורת בין תאית 2-4. כלי רכב חשמליים מבחינה קלינית, platelet-derived ידועים יש פעילות נוגדת קרישה חזקה 5, בעוד שאחרים כבר הוכיחו לתרום למגוון רחב של מצבים, מקידום metasta גידולsis 6 להגנה מפני מחלות 7. כלי רכב חשמליים יכול להיות מסווג לקטגוריות קטנות יותר של שלפוחית ​​שמקורן בתאים כגון exosomes וmicrovesicles (MVS), תלוי בגודל ובמנגנון של דור 8 שלהם. המינוח של תת-אוכלוסיות שלפוחית ​​שמקורן בתאים ממשיך להיות נושא לויכוח מתמשך 8,9, לעומת זאת, exosomes בדרך כלל מתואר כקטנים, 40 עד 100 חלקיקי ננומטר נגזרים מהיתוך endosomal עם קרום הפלזמה, בעוד MVS גדול יותר 100 עד 1,000 חלקיקי ננומטר נוצרו על ידי שפיכה של קרום הפלזמה 10. כאן, המונח הכללי "הרכב החשמלי" ישמש כדי להתייחס לכל הסוגים של שלפוחית ​​ביולוגית תאית שפורסמו על ידי תאים.

בידוד של כלי רכב חשמליים מכל הדם הוא הליך רב-שלבים ומשתני עיבוד רבים ושונים הוכחו משפיעים על תוכן EV, כוללים טמפרטורת אחסון ומשך 11,12, נוגד קרישה / חומר משמר המשמש 13 ושיטת צנטריפוגה משמשת 14. צורך בסטנדרטיזציה של המשתנים הללו הוביל להמלצות על ידי האגודה הבינלאומית על פקקת ותהליכי עיבוד דם ובידוד EV haemostasis מדעיים ותקינת הוועדה (ISTH SSC) לנכון 15,16, עדיין לא קיים הסכמה בין חוקרים על הפרוטוקול האופטימלי להשתמש 12. רובם מסכימים, עם זאת, כי משתנים מראש אנליטיים פיקוח הדוק הם חיוניים לנתונים מדויקים ושחזור.

על מנת לנתח את המכוניות חשמליות, חוקרים נצלו את שיטות שונות, ובכלל זה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים 17, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק 18,19, במיקרוסקופ כוח אטומי, אור דינמי פיזור 20,21 ומערבי סופג 22,23. בעוד FCM הוא שיטת בחירה של חוקרים רבים 9,24 - 26 בשל יכולות התפוקה הגבוהה שלה, ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות FCM היהקשה לשמצה בשל הגודל וחוסר אוכלוסיות חיוביות בדידות 27 - 32. בהשוואה לניתוח של תאים, גודלו הקטן של כלי הרכב החשמליים בתוצאות 1) הקרינה הנפלטת פחות בשל המספר קטן יותר של אנטיגנים לכל חלקיק ו- 2) ההיתכנות מוגבלת של שטיפת הודעה כתם-, שיש צורך להפחית את קרינת רקע. אתגרים משותפים בין חוקרים כוללים אותות הנובעים מאגרגטים אימונוגלובולין 27,28 וצבירה עצמית של נוגדנים 29. יתר על כן, פעמים העיבוד הארוכות ונהלי כביסה / בידוד ממושכים בשימוש על ידי רב של הפרוטוקולים הנוכחיים 33,34 דורשים התחייבויות זמן רב היום לנתח מספר קטן של דוגמאות, שהופך אותם פחות אידיאלי עבור יישומי תפוקה גבוהים. חלק מהחוקרים לוותר שלב לשטוף לגמרי, טיוח בקרות שליליות FCM משמשים באופן מסורתי כמו מינוס הקרינה אחד (FMO) וisotypes נוגדן חסר תועלת עבור במדויק הערכת Bacהקרינה kground 30.

הפרוטוקולים שלנו מטפל בשלוש בעיות נפוצות שיכול לעכב ניתוח FCM נאות של כלי רכב חשמליים: אותות הנובעים מאגרגטים נוגדן ולא שלפוחית ​​אחרת, קושי בהסרת נוגדן מאוגד, וחוסר אוכלוסיות חיוביות ניכרו. הטכניקות המתוארות כאן יסייעו בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, הגדלת יחס אות לרעש, וקביעת שערים בצורה רציונלית שממזערת גילוי של הקרינה רקע. שתי שיטות זיהוי שונות מוצגות כאן: הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוזים כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקולים הבאים בוצעו בהתאם לכל הנחיות מוסדיות, לאומיות ובינלאומיות לרווחת אדם. כל דגימות הסובייקט האנושיות נבדקו תחת לוח מוסדי סקירה (IRB) פרוטוקול -approved ועם הסכמה מדעת של הנושאים.

1. שיטה: פרט איתור שיטה

1.1) עיבוד לדוגמא / בידוד דם של כלי רכב חשמליים

  1. להקיז דם מתורם / מטופל לשני 10 מיליליטר צינורות זכוכית המכילים 1.5 מיליליטר של ACD-פתרון או נוגד קרישה מתאימה ותהליך מייד אחרות (תוך 30 מקסימום דקות) באמצעות פרוטוקול צנטריפוגה ההפרש 2-הצעד הבא.
    הערה: פרוטוקול זה יניב כ -10 מיליליטר של פלזמה עניה טסיות דם (PPP) מ~ 17 מיליליטר בשילוב של דם נמשך. אם יש צורך בפחות או יותר PPP, מספר הצינורות של דם שנאסף עשוי להיות בהתאם.
  2. צנטריפוגה דגימות ב1,500 XG במשך 10 דקות ב RTכדי להפריד את הפלזמה מהמעייל באפי ותאים אדומים. העבר 1.2 מיליליטר aliquots של supernatant הפלזמה לצינורות 1.5 מיליליטר צנטריפוגות, נזהר שלא להפריע את השכבות התחתונה המכילות את המעיל באפי ותאים אדומים.
  3. ספין ב13,000 XG במשך 10 דקות ב RT להסיר טסיות דם ושברי תאים גדולים. להעביר בזהירות את PPP, והותיר אחריו 200 μl להימנע להפריע גלולה ולהוסיף PPP לצינור חדש.
  4. בשלב זה, להשתמש PPP מייד לניתוח או להעביר ב1.0 מיליליטר aliquots 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגות חדשים ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד שנתיים לניתוח מאוחר יותר (ראה איור 1 א לסקירה).
  5. אם כלי רכב החשמליים מטוהרים יש צורך בניסויים פונקציונליים, העברה 6 מיליליטר של PPP לצינור ultracentrifuge ולהוסיף 28 מיליליטר של 0.2 ופר פוספט מיקרומטר המסונן (PBS). ספין במשך 60 דקות ב 100,000 XG ב RT באמצעות ultracentrifuge מצויד בהרוטור דלי מתנדנד. לשאוב supernatant וpel EV resuspendבוא ב 1.5 מיליליטר תקשורת.
    הערה: לשחזור הגבוה ביותר, צריכים להיות מעובד דגימות דם באופן עקבי ככל האפשר מתורם לתורם. כל וריאציה בשיטת בידוד EV באופן משמעותי יכולה להשפיע על המספר והסוג של כלי רכב חשמליים שזוהו.

1.2) הכנת דוגמאות לניתוח

הערה: מנקודה זו ואילך, הצעדים להסביר פרוטוקול תפוקה גבוהה לניתוח 12 דגימות במשך 14 סמנים ב 3 לוחות. עם זאת, שילובים אחרים של נוגדנים יכולים לשמש כאן; הפרוטוקול ניתן להתאים ללמוד אוכלוסיות EV אחרות על ידי החלפת הסמנים הציעו לאלה של עניין.

  1. הסר 12 דגימות ממקפיא (אם מאוחסן ב -80 ° C) והפשרה על 37 מעלות צלזיוס.
  2. תוכן פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב. הסר 320 μl מכל מדגם ולהוסיף לשורה העליונה של צלחת גם 96.
    הערה: pipet רב גם רוחב מתכוונן הוא מאוד מועיל לזה וצעדים רבים אחרים ברחבי התחתאיי, במיוחד בעת ניתוח דגימות מרובות בבת אחת.

1.3) דוגמאות מכתים EV

  1. לפני מכתים, לסנן את כל הנוגדנים (שרירי בטן) כדי להסיר אגרגטים, אשר יכול לגרום לאותות חיוביים.
    1. נוגדנים לשלב לשימוש בכל אחד מהפנלים 3 ל0.22 מיקרומטר צינורות נפרדים צנטריפוגלי מסנן צנטריפוגות באמצעות צנטריפוגות זווית קבועה יחידה מהירות (~ 750 XG) ב RT במשך 2 דקות, או עד שכל תערובת Ab עבר דרך המסנן ולא נוזלי נוגדנים נשאר על פני השטח של המסנן. קוקטיילים חנות Ab במקרר לתקופה של עד שבועיים, אך מחדש מסנן בכל פעם לפני השימוש.
  2. הוסף את הכמות המתאימה של תערובת Ab מסוננת היטב כל אחד בשורה 2 (לדוגמא, דגימות בלוח אני מגואלות 2 μl של כל Ab, כך כוללת של 12 μl של קוקטייל Ab המסונן מתווספת לכל גם לשורה 2). עיין באיור 1 ב 'למתווה של מפת הצלחת שהציע. חזור בנוסף אלהים לשורות מתחת אם יותר פנלים מנוהלים (כאן, להוסיף 8 μl / טוב של קוקטייל הלוח השני לחתור 3 ו -11 μl / טוב של קוקטייל הלוח III לחתור 4; מתייחס לחומרי רשימה לקבלת מידע לוח ספציפי).
  3. באמצעות pipet רב ערוצית, לערבב את דגימות PPP בשורת 1 למעלה ולמטה ולהעביר 100 μl מהבארות בשורה 1 לבארות בשורה 2. מערבבים למעלה ולמטה. טיפים שינוי וחוזר, העברת 100 μl מהשורה 1 לשורות 3 ו -4 דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

1.4) דוגמאות MV כביסה

  1. הסר את צלחת 96-היטב מ4 ° C והעברה לארון בטיחות ביולוגי. בעזרת פיפטה רבה, להוסיף 220 μl של PBS / גם לשורות 6-8 (שישמש לשטיפה / שטיפת הבארות המכילות PPP צבעוני).
  2. העבר את התוכן של כל אחד גם לצינורות מסנן צנטריפוגלי שכותרתו מראש באמצעות pipet רב ערוצית רוחב מתכוונן (במשך 12 דגימות, עם 3 פנלים של נוגדנים, 12 x 3 = 36 צינורות מסנןיהיה צורך). השימוש באותה הטיפים, להסיר 200 μl של PBS מהשורות לשטוף ולהוסיף לבארות המקבילות שממנו PPP רק הוסר.
  3. מערבבים למעלה ולמטה כדי לשטוף את הבארות ולהעביר את פתרון השטיפה לאותו מסננים כדי שPPP נוספו בעבר. צמרות קרובות של מסנני צנטריפוגלי. טיפים שינוי.
  4. חזור על תהליך זה עם הדגימות מוכתמות שנותרו עד שכל דגימות PPP המוכתמות הועברו יחד עם פתרונות שטיפתם למסנני צנטריפוגלי.
  5. העבר את מסנני צנטריפוגלי לצנטריפוגות הרוטור קבוע וספין ב 850 XG במשך 3 דקות ב RT.
    הערה: ודא שאין נוזל נשאר על צמרות המסנן. לאחר צנטריפוגה, המסנן צריך להיראות "יבש" ללא שכבת נוזל גלויה שנותרה על גבי. בעוד סביר, דגימות PPP מסוימות עשויות לדרוש זמן צנטריפוגה יותר לנוע ביעילות דרך המסנן.
  6. הסר את צינורות מסנן צנטריפוגלי ולחזור לארון הבטיחות הביולוגי.באמצעות pipet רב ערוצית, resuspend צמרות המסננים ב300 μl של PBS. העבר את תוכן resuspended מראש שכותרתו צינורות לניתוח FCM מיידי.
    הערה: זה מאוד חשוב לשמור על הכוח ומספר שקעי בוכנת פיפטה עקביים בין דגימות כדי למנוע וריאציה מדגם למדגם. זה אידיאלי צריך להיעשות באמצעות pipet אלקטרוני שכבר מתוכנת לpipet למעלה ולמטה נפח מסוים (לדוגמא, 280 μl) מספר פעמים (לדוגמא, 8 פעמים) עבור כל דגימה מדויקת.

1.5) התקנת Cytometer

  1. פתח את תוכנת FCM. לפני ניסוי התקנה, לבצע כיול מכשיר יומי והתקנה באמצעות חרוזים התקנת מכשיר (להלן הוראות יצרן).
  2. אם דגימות EV כבר מוכתמות נוגדן אחד או יותר וfluorochromes מרובים למדוד אותם בפעם אחת, לחשב ערכי פיצוי כדלקמן:
    1. הוסף 2 טיפות של חרוזים פיצוי מראשצינורות שכותרתו (צינור 1 עבור כל נוגדן fluorochrome מצומדות) ולהוסיף את הכמות המומלצת של נוגדן. הוסף 2 טיפות של חרוזים פיצוי שליליים לצינור אחר שישמשו כפיצוי השליטה בלא כתם.
    2. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לשטוף עם PBS וגלול ב400 μl של PBS.
    3. באמצעות cytometer הזרימה בתוכנות כלולות במכשיר, להפעיל את צינור כל פיצוי ולהתאים מתחי ניאון כדי למקם כל שיא בכ -10 4 בקנה מידת יומן 5 עשורים. ודא ששיא הקרינה הוא הגבוה ביותר (מבריק) בערוץ הניאון שלה בהשוואה לכל ערוצים האחרים, ולהתאים את המתחים של פרמטרים ניאון שוב במידת צורך. הפעל כל צינור comp בנפרד מוכתם וללכוד לפחות 5,000 אירועים לכל צינור.
    4. בחר את "הניסוי", ולאחר מכן בחר בכרטיסייה "פיצוי", ולאחר מכן בחר "חישוב פיצויים" כדי להחיל את ערכי פיצוי לכל הדגימות.
  3. תוך כדי ריצת שפופרת של PBS 0.22 מיקרומטר מסונן, להתאים את מתחי FSC וSSC לערכים הגבוהים ביותר שלא לכלול את רוב רעש רקע (כלומר, ממש מתחת לסף המתח שבקצב אירוע עולה 5 אירועים / sec).
  4. בשלב הבא, לרוץ צינור המכיל 0.2 מיקרומטר - 1.0 מיקרומטר חרוזים, בדילול מלא PBS במידת צורך. בFCS לעומת SSC עלילה, לצייר שער סביב אוכלוסיית חרוז ללכוד אירועים בין 0.2 מיקרומטר ו1.0 מיקרומטר. לחלופין, בהיסטוגרמה SSC-H, לצייר שער שיכלול את כל האירועים קטנים יותר מאשר 1.0 מיקרומטר חרוזים.
  5. להגדיר קצב הזרימה של cytometer ל" Lo "(כ 8-12 μl / min). שימוש בצינור חרוזים (או צינור אחר המכיל ריכוז ידוע של חרוזים) להתאים את קצב זרימה בחיוג על cytometer עד ערבשיעור NT מגיע לכ -200 אירועים / sec. קרא את כל צינורות המדגם באותו קצב הזרימה ולהשתמש באותו ריכוז חרוז בניסויים עתידיים על מנת להבטיח כי הספיקות להישאר עקביות בין ריצות.
  6. הפעל צינור של חלקיקי ניאון קשת מדולל PBS. לרכוש 5,000 אירועים. רשום את ערכי עוצמה הממוצעים לFSC, SSC, וכל ערוץ צבע. להשתמש בערכים אלה כדי להתאים את המתחים בניסויים עתידיים, כדי להבטיח שעוצמות הקרינה להישאר עקביות בין ניסויים.

1.6) קריאה לדוגמא

  1. להגדיר קצב הזרימה של cytometer ל" Lo "(כ 8-12 μl / min) ולהפעיל כל דגימה בדיוק 1 או 2 דקות.
  2. לאחר הקריאה הראשונה, להוסיף 20 μl של 10% NP-40 מדגם זה, פיפטה מעלה ומטה, ולקרוא מחדש לאותה הכמות של זמן (או דקות 1 או 2), כדי לאפשר לחיסור של אירועים חיוביים שזוהו ב מדגם lysed על מסגרת זמן שווה.
    הערה: זה מאוד שדortant כי דגימות להיות מעורבות באמצעות pipet ולא מערבולת. מניסיוננו, vortexing יכול לגרום צבירה עצמית של נוגדנים מסוימים, שהוביל לאירועים חיוביים מחקה-EV.
  3. ברגע שכל הדגימות אשר נקראו, יצוא כל קבצי .fcs לקובץ נפרד שישמשו לניתוח נוסף באמצעות תוכנת ניתוח FCM.

1.7) ניתוח נתונים

  1. פתח את תוכנת ניתוח FCM. לייבא את כל קבצי .fcs לתוך קובץ ניסוי חדש.
  2. פתח את חרוזים רק צינור. בFSC-מול SSC-עלילה, לצייר שער סביב כל חרוזים בגודל בין 0.2 מיקרומטר ו1.0 מיקרומטר. זהו שער EV. גרור כדי להוסיף לכל הדגימות.
  3. שימוש בדגימות lysed כפקדים שליליים, לצייר שערים בקצה של הקרינה רקע בכל ערוץ הקרינה בשימוש. גרור שערי ניאון לתוך שער EV של כל דגימה-lysed שאינו מתאים.
    הערה: בשלב זה הוא גם שימושי לבחון מגרשים דו-פרמטר ניאון כפול. צורות רקטות בברבע הכפול חיובי (ראה איור 8), במיוחד אם הסמנים ידועים מתגוררים בסוגים שאינם קשורים תא, עשויה להצביע על חפץ מצבירה או אירועי מחקי שלפוחית ​​אחרים.
  4. לכל סמן ניאון, להפחית את מספר האירועים במדגם lysed ממספר האירועים במדגם-lysed שאינו. לחלופין, לחלק את המספר הזה במספר הכולל של כלי רכב חשמליים בשער EV-lysed לא לקבל ערכים חיוביים%.

2. שיטה ב ': חרוזים שיטה

2.1) עיבוד לדוגמא / בידוד דם של כלי רכב חשמליים

  1. עיין בשיטת עיבוד דם מתואר בשיטה (סעיף 1.1).

2.2) הכנת דוגמאות לניתוח

  1. אם תרצה, fractionate PPP או מכוניות חשמליות ultracentrifuged לexosomes וmicrovesicles. הוסף 250 μl של PPP או מכוניות חשמליות ultracentrifuged ל0.22 מיקרומטר מסנני צנטריפוגלי ולהעביר לצנטריפוגות קבועה הרוטור וספין ב 750 xז 2 דקות בRT.
    הערה: ודא שאין נוזל נשאר על צמרות המסנן. לאחר צנטריפוגה, המסנן צריך להיראות "יבש" ללא שכבת נוזל גלויה שנותרה על גבי. בעוד סביר, דגימות מסוימות עשויות לדרוש זמן צנטריפוגה מעט יותר לנוזל לנוע ביעילות דרך המסנן.
  2. לשטוף ללא ציפוי 6 מיקרומטר חרוזי פוליסטירן (למשל, חרוזים ABC שליליים) 2x עם תקשורת RPMI, וresuspend ב 2 מיליליטר. להוסיף 6,000 חרוזים לכל צינור FACS. לצינור הבקרה השלילי, להוסיף 400 μl של תקשורת RPMI לבד לחרוזים. לכל צינורות האחרים, להוסיף 200 μl של PPP או מכוניות חשמליות ultracentrifuged (או שברים שלהם) ו -200 μl של תקשורת RPMI.
  3. התאם את הנפח הסופי של כל הצינורות 400 μl עם תקשורת ודגירת הלילה בשעה 4 ° C על שייקר.
  4. למחרת בבוקר, לשטוף החרוזים עם 2 מיליליטר של תקשורת. לשאוב את supernatant.
  5. לחסום עם 5% אלבומין בסרום שור (BSA) בתקשורת (400 μl) במשך 3 שעות ב 4 ו176 #; C על שייקר.
  6. לשטוף חרוזים עם 2 מיליליטר של תקשורת. גלולה לשאוב וגלול במדיום של 100 μl.

2.3) דוגמאות מכתים EV

  1. לסנן את כל הנוגדנים. השתמש באותו לוחות נוגדן המשמשים בשיטה, או אם תרצה בכך, ליצור שילוב של נוגדנים שונים, כל עוד fluorochromes עולה בקנה אחד זו עם זו.
  2. מערבבים את כל הנוגדנים לשימוש בפנל אחד לתוך צינור מסנן צנטריפוגלי 0.22 מיקרומטר. צנטריפוגה באמצעות צנטריפוגות מהירות יחידה זווית קבועה למשך 2 דקות או עד שכל תערובת Ab עברה דרך המסנן ולא נוזלי נוגדנים נשאר על פני השטח של המסנן.
  3. הוספת נפח מתאים של קוקטייל נוגדנים מסוננים לכל צינורות דגירה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. לשטוף חרוזים עם 2 מיליליטר של תקשורת, גלול ב400 μl של תקשורת ולהפעיל באופן מיידי (או באותו היום) על cytometer זרימה.

2.4) Cytometer קריאת התקנה והדוגמא

  1. פתח את תוכנת FCM. לפני ניסוי התקנה, לבצע כיול מכשיר יומי והתקנה באמצעות חרוזים התקנת מכשיר (להלן הוראות יצרן).
  2. אם דגימות EV כבר מוכתמות נוגדן אחד או יותר וfluorochromes מרובים למדוד אותם בפעם אחת, לחשב ערכי פיצוי כדלקמן:
    1. הוסף 2 טיפות של חרוזים פיצוי מראש שכותרתו צינורות (צינור 1 עבור כל נוגדן fluorochrome מצומדות) ולהוסיף את הכמות המומלצת של נוגדן. הוסף 2 טיפות של חרוזים פיצוי שליליים לצינור אחר שישמשו כפיצוי השליטה בלא כתם. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לשטוף עם PBS וגלול ב400 μl של PBS.
    2. השימוש בתוכנת FCM, לרוץ צינור כל פיצוי ולהתאים מתחי ניאון כדי למקם כל שיא בכ -10 4 בקנה מידת יומן 5 עשורים. ודא ששיא הקרינה הוא הגבוה ביותר (מבריק) בערוץ הניאון שלה בהשוואה לכל ערוצים האחרים, ולהתאים מתחים של פרמטרים ניאון שוב במידת צורך. הפעל כל צינור comp בנפרד מוכתם וללכוד לפחות 5,000 אירועים לכל צינור.
    3. בחר בכרטיסייה "הניסוי" ואז "פיצוי" ואז "חישוב פיצויים" כדי להחיל את ערכי פיצוי לכל הדגימות.
  3. לשנות את FSC ופרמטרי מתח SSC להיכנס קנה מידה ובחר את הסף הנמוך ביותר המוותר בcytometer (FSC = 200 וSSC = 200) לכל אחד.
  4. דגימות לרוץ, שער על אוכלוסיית חרוזים גופייה ולרכוש 2,000 אירועים בשער הזה. קבצי .fcs יצוא.
  5. השתמש בתוכנת ניתוח FCM לנתח .fcs קבצים. שער בחרוזי גופייה. לחשב את עוצמת הגיאומטרית הממוצעת ניאון (MFI) עבור כל fluorochrome ולהשוות עם MFI של הביקורת השלילית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מתאר את התכנית הכוללת לעיבוד הבידוד וזיהוי של כלי רכב חשמליים או באמצעות השיטה המבוססת על חרוז או שיטת זיהוי אישית. זיהוי אישי של כלי רכב חשמליים באמצעות FCM עובד היטב לניתוח רכב חשמלי גדול יותר אבל רוב cytometers אינו מסוגל בנפרד גילוי חלקיקים קטנים כמו exosomes. גישה מבוססת חרוז מאפשרת כלי רכב חשמליים קטנים כדי להתגלות, עם זאת, יש חסרונות הקשורים בשימוש בשיטה זו, כפי שמתוארים בטבלה 1. באופן כללי, בידוד של כלי רכב חשמליים באמצעות ultracentrifugation (עם או בלי התוספת של הליך חלוקה שיפוע סוכרוז) הוא מומלץ בעת כלי רכב החשמלי נחוצים למבחנים פונקציונליים. Ultracentrifugation מסיר זיהומים כוללים חלבונים בסרום ומזהמים מסיסים אחרים מהפלזמה, אשר יכול להשפיע על תוצאות ניסוי פונקציונליות. עם זאת, ultracentrifugation הוא זמן רב ועלול לשנות כמות EV ואיכות 12.

"> תוצאות צפויות לשני מבחני האיתור מתוארות בדמויות 2-3. לassay פרט זיהוי, שליטת lysed (בשורה תחתונה, איור 2) משמש להגדרת שערים למדגם הלא-lysed המקביל (שורה העליונה, איור 2). רוב האירועים צריכים ליפול בתוך שער EV. שערי Quadrant לא צריכים לחשוף אירועים חיוביים כפולים כאשר שני סמנים בהשוואה אינם בדרך כלל נמצאים באותו התא. חלקות biparameter תקין באיור 2 מראות הסמנים CD108a וCD235a , שהם שני סמנים של תאי דם אדומים ידועים לדור בכפיפה אחת בתאים. כאן, בכלי רכב חשמליים, יותר ממחצית מהאירועים החיוביים הם חיוביים עבור שני הסמנים, כצפוי. באותו אופן, סמנים פני תא ידועים מתגוררים באותו התא צריך להראות דפוסים דומים של חיוביות כפולה על כלי רכב חשמלי. חלקות biparameter המרכז להראות ביטוי EV של שני סמנים שידועים כי הם לא לדור בכפיפה אחת בתאים. בניתוח זה של CD235a (bloo אדוםסמן ד תא) וCD41a (סמן של טסיות דם), כלי הרכב החשמליים להראות אוכלוסיות שונות, נפרדות, חיוביות, אשר צפוי מכיוון שהם מגיעים מתאים מסוגים שונים. כאשר lysed, אירועים חיוביים צריכים להיעלם. באופן כללי, כל אירועים חיוביים שנותרו לאחר תמוגה להעיד על הנוכחות של אות שמגיעה מחלקיקים שאינן שלפוחית, אגרגטים, ו / או כלי רכב חשמליים חומר ניקוי עמיד. איור 3 מציג את התוצאות צפויות בשיטת זיהוי מבוסס חרוז. בניגוד לשיטת זיהוי האישי, לא יכולים / אין לראות בנתונים אלה במגרשים דו-פרמטר. בחלקות הנקודה העליונות, אין הפרדה בין האוכלוסיות החיוביות ושליליות קיימות, ואירועים מופיעים ברביעים החיוביים הכפול למרות שהם בדרך כלל לא נמצאו באותו סוגי התאים בשל העובדה כי שני הסוגים של כלי רכב חשמלי יהיו לאגד חרוז אחד. לשיטת זיהוי מבוסס חרוז, הנתונים הטובים ביותר נותחו באמצעות שכבות היסטוגרמה עם השליטה השלילית (המתוארת מתחת לחלקות dot). אני חיוביותs נמדד באמצעות MFI של סמן (כלומר עוצמת הקרינה) ולעומת ישירות עם זה של הביקורת השלילית. אם מדגם הוא חיובי עבור הסמן בשאלה, MFI שלה יהיה גבוה יותר מהביקורת השלילית. הבקרה השלילית לשיטת חרוז היא פשוט חרוזים חסמו עם BSA (אין כלי רכב חשמליים נוספים), אשר היו מוכתם באותו הנוגדנים ורחצו לצד חרוזים מצופה EV. השוואה של תוצאות צפויות תוך שימוש בשתי השיטות ניתן לראות באיור 4.

היכולת של assay זיהוי האישי כדי להעריך כראוי פנוטיפים EV מסתמכת במידה רבה על ניתוק נכון להפריד אירועי Ab חיוביים מקרינת רקע. לכן, זה קריטי לבחור בקרה שלילית שרוב כראוי מחקה / צופה הקרינה רקע למדגם נתון. כאשר כלי רכב חשמליים צבעוניים לא שטפו לפני הקריאה, נפוץ בקרות שליליות (לדוגמא, isotypes) אינו מצליח לחזות fluorescenc רקע מדויקדואר לכל הסמנים (איור 5 א). במקרים אלה, אם כביסה היא לא אופציה, דגימות lysed נוטות לעבוד טוב יותר לניבוי הקרינה רקע. , עם זאת, כאשר כלי רכב חשמליים צבעוניים נשטפים לפני הקריאה (באמצעות סינון צנטריפוגלי, במקרה זה), שני פקדים שליליים (isotypes ודגימות lysed) פועל היטב לניבוי הקרינה רקע של מדגם (איור 5 א). יש לציין, עם זאת, כי בזמן שכל הפקדים השליליים "העבודה", בקרות lysed הם העדיפו משום שהם מספקים מידע נוסף על מדגם (למשל, הנוכחות של אירועי חומרי ניקוי עמיד, שאינה שלפוחית ​​הקשורים ו / או אגרגטים) ש יכול לגרום לאותות חיוביים שאינו EV ושלא כדין לנפח ספירות Ab. יתר על כן, בקרות אלוטיפ יכולים לפעמים להיות לא אמינות, אפילו בדגימות שטף, כפי שמוצגים באיור 5, שבו יש לו את המדגם המוכתם אירועים חיוביים פחות מאשר אותו המדגם מוכתם עם נוגדני שליטת isotype מתאימים. ללא הסרה יסודית של נוגדן מאוגד, מגרשי נקודת FCM של כמה סמני EV הם כמעט בלתי אפשריים לפרש, המופיעים כעננים של חלקיקים עמומים ניאון שאין להבחין בין רקע הניאון מאוד (איור 6, עלילה עליונה). כביסה דגימות מוכתמות באמצעות מסנני צנטריפוגלי משפר את ההפרדה בין רקע ואותות סמן חיוביים (איור 6, עלילה תחתונה); עם זאת, עלולים ללכת לאיבוד כלי רכב חשמלי קטנים וexosomes דרך הנקבוביות של המסנן.

השימוש בחומרי ניקוי צעד תמוגה חושף אירועים ממתחמים חיסוניים חיוביים, מחקי שלפוחית ​​וחלבון צובר 21. כאשר PPP מנותח באמצעות זיהוי אישי, נתקל באירועים חיוביים שאינו נעלמים עם תמוגה היא לעתים קרובות למדי התרחשות. אירועי חומרי ניקוי עמיד אלה לעתים קרובות מופיעים אותות חשודים כ, ניאון מאוד אלכסוניים בשתי חלקות הפרמטר וbiparameter אחד (איור7). , מתחמים קליניים אלה חלבון ו / או מכלולים חיסוניים מסיסים הם שכיחים יותר בחולים הסובלים ממחלות שונות 21, כגון דלקת מפרקים שגרונית 28, תסמונת נפרוטית 19, וזאבת אדמנתית מערכתית 29. לכן, בהתאם למטרת המחקר, אחד ייתכן שירצה לכלול או להסיר אותם מדרך analysis.Another אותות אלכסוניים יכולים להיווצר הוא על ידי vortexing הדגימות, במיוחד לאחר התוספת של מגיב תמוגה (איור 8). דוגמאות תמיד צריכים להיות מעורבות למעלה ולמטה על ידי pipet כדי למנוע היווצרות של אגרגטים.

איור 1
איור 1: ערכת עיבוד בסך הכל לבידוד וזיהוי של כלי רכב חשמליים או באמצעות השיטה המבוססת על חרוז או שיטת זיהוי אישית. (א) דם שלם מעובד ראשון לPPP. ממחדש, יכול גם להיות מעובד PPP נוסף באמצעות ultracentrifugation להניב כלי רכב חשמליים מבודדים או בשימוש כמות שהוא בזיהוי האדם או מבחני מבוססי חרוז. מתאר (B) של מפת הצלחת הציעה לניתוח מדגם תפוקה גבוהה תוך שימוש בשיטת זיהוי אישי. אנא לחץ על כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. תוצאות צפויות לאיתור פרט Cytometry זרימת חלקות dot להראות מכתים נציג של דגימות EV lysed וunlysed. ערכים להראות האחוזים של אירועים חיוביים. רוב האירועים ליפול בתוך שער EV. אירועים מוצגים בחלקות biparameter תקין נמצאים בFSC / שערי EV SSC בצד השמאל. מדגם lysed (בשורה תחתונה) משמש להגדרת שערים מבוססי ניאון לeach מקביל מדגם (לא lysed). שערי Quad לא צריכים לחשוף אירועים חיוביים כפולים כאשר שני סמנים בהשוואה אינם בדרך כלל נמצאים באותו התא. כאן, CD235a biparameter ועלילת CD41a תערוכות הפרדה ברורה בין כלי הרכב החשמליים המבטאים סמנים של תאי דם אדומים וטסיות דם סמני תא להביע אלה. כמו כן, סמנים פני תא ידוע מתגורר באותו התא צריכים להראות דפוסים דומים של חיוביות כפולה על כלי רכב חשמלי. עלילת biparameter ימין מראה כי למעלה ממחצית מכלי הרכב החשמלי CD235a החיובי גם חיובית עבור הסמן המשני של תאי דם אדומים (RBC), CD108a. כאשר lysed, אירועים חיוביים צריכים להיעלם. אירועים חיוביים שנותרו לאחר תמוגה להעיד על הנוכחות של אות שמגיעה מחלקיקים עמידים שאינה שלפוחית ​​או חומר ניקוי ו / או אגרגטים.

איור 3
תוצאות צפויות באמצעות זיהוי מבוסס חרוז: איור 3שיטה. Cytometry זרימת חלקות dot להראות מכתים נציג של כלי רכב חשמליים בשילוב חרוזים, בהשוואה לחרוזים חסמו עם BSA, המשמש כביקורת השלילית. ערכים להראות האחוזים של אירועים חיוביים. אירועים מוצגים בחלקות biparameter תקין נמצאים בFSC / שערי חרוזים SSC בצד השמאל. לשיטת זיהוי מבוסס חרוזים, הנתונים הטובים ביותר נותחו באמצעות שכבות היסטוגרמה עם השליטה השלילית (המתוארת מתחת לחלקות dot). חיוביות נמדדת באמצעות MFI של סמן (כלומר עוצמת הקרינה) ולעומת ישירות עם זה של הביקורת השלילית.

איור 4
איור 4:. השוואה של תוצאות צפויות באמצעות חרוזים לעומת גילוי פרט הזרימה dot cytometry חלקות להראות מכתים נציג של כלי רכב חשמליים בשילוב חרוזים (שורה העליונה), בהשוואה לכלי רכב חשמלי ניתוח באמצעות זיהוי אישי (בשורה תחתונה). אירועיםמוצג בפינה הימנית biparameter חלקות נמצאות בFSC / שערי חרוזים SSC בצד השמאל.

איור 5
איור 5:. השוואה של בקרות שליליות שונות בניתוח זיהוי פרט ערכים להראות האחוזים של אירועים חיוביים. אירועים המוצגים הם בתוך שער FSC / SSC EV. () השוואה של בקרות שליליות בלעומת רחוץ שטפה דגימות. אלוטיפ או בקרות lysed הוערכו ביכולתם לספק אינדיקציות מתאימות של הקרינה רקע על פני שני סמנים שונים במדגם מוכתם באופן מלא (בשורה תחתונה). שערי כל סמן נעשו באמצעות מדגם lysed (שורה העליונה) ולאחר מכן הועתק לשורות מתחת. דוגמא דגימות שטפו נשטפו באמצעות סינון דואר כתם. (B) של מדגם מוכתם בשליטה אלוטיפ יש אירועים חיוביים יותר מהמדגם מוכתם with נוגדן בפועל.

איור 6
איור 6:. אפקט של שטיפת הודעה כתם-בגילוי פרט ערכי אחוזי תכנית ומספרים של אירועים חיוביים. אירועים המוצגים הם בתוך שער FSC / SSC EV. גייטס עבור כל דגימה נעשה באמצעות העמית של כל מדגם lysed (לא מוצג; מתייחס לדמות קודמת לשער-הגדרה ברחוצה vs דגימות נשטפו). הקרינה רקע גבוהה עושה הבחנה חיובית מאירועים שליליים (חלקה עליונה) קשה. כאשר שטף, לעומת זאת, האוכלוסייה החיובית מתגלה כנוגדני ניאון מאוגד יוסרו וקרינת רקע מופחתת (חלקה תחתונה).

איור 7
איור 7: תמוגה דטרגנט מאשר את נוכחותם של לא-EV שלignals. אירועים מוצגים הם בתוך שער FSC / SCC EV. ערכים להראות האחוזים של אירועים חיוביים. דגימות EV ויטראז היו לקרוא לפני (עמודה שמאלית) ולאחר תוספת של חומרי ניקוי (עמודה ימנית) כדי לזהות אותות חיוביים שנגרמו על ידי קומפלקסים חיסוניים ואירועים הקשורים ל- EV-לא אחרים.

איור 8
איור 8: vortexing גורם להופעה של אותות לא-EV אירועים המוצגים הם בתוך שער FSC / SCC EV.. ערכים להראות האחוזים של אירועים חיוביים. דגימות EV ויטראז היו לקרוא לפני (עמודה שמאלית) ולאחר תוספת של חומרי ניקוי (עמודה ימנית). בעזרת מערבולת לערבב דגימות יכול לגרום, אוכלוסיות אלכסוניות מחקה-EV ליצירת (שורה העליונה). כאשר מערבבים בעדינות מעלה ומטה באמצעות pipet, לעומת זאת, ניתן להימנע מהיווצרותן של אוכלוסיות אלה (בשורה תחתונה). Vortexing אינו מומלץ לערבוב, כפי שהוא יכול לגרום לצבירה בכמה דוגמאות, לאהדינג ל, אוכלוסיות חיוביות המופיע באלכסון. באופן כללי, מספר אירוע בתוך שער חיובי לא צריך להגדיל לאחר lysing.

איתור מבוסס חרוז איתור בודד
גדלי EV מומלץ ל< 100 ננומטר רק מומלץ ל> 100 ננומטר רק
זמן דורש דגירה הלילה יכול להשלים ב< יום 1
רגישות זיהוי אשכול גילוי חלקיק יחיד
תוצאות איכותי כמותי
כביסה צנטריפוגה פשוטה, סטנדרטית דורש מסנני צנטריפוגלי
בקרה שלילית חרוזים מצופים BSA דגימות lysed

טבלה 1: יתרונות וחסרונות של שני שיטות זיהוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שני פרוטוקולים שונים לבידוד, הטיפול והניתוח של כלי רכב חשמליים הוצגו, תוך שימוש בזיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. בחירה בשיטה המתאימה ביותר לשימוש היא לא תמיד פשוטה ודורש הבנה של המדגם נבדק, כמו גם תת-האוכלוסיות בודדות של עניין. יתר על כן, את הרגישות של cytometer שימש לרכישה יש לקחת בחשבון בעת ​​בחירת השיטה המתאימה ביותר. לעתים קרובות אין פרוטוקול בודד הטוב ביותר לשימוש, ולא, בשילוב של שיטות מספק מידע נוסף על מדגם מכל שיטה אחת בלבד. באופן אידיאלי, יש להעריך כמה טכניקות בידוד וזיהוי שונות ראשונה על מנת לפתח פרוטוקול מותאם שלוקח בחשבון פרט cytometer ביצועים ביחס לנחקרת אוכלוסיית EV הספציפית. טכניקות בידוד אלטרנטיביות כוללות ultracentrifugation, חלוקה צפיפות סוכרוז, ב immunomagneticהפרדת EAD, כרומטוגרפיה, וטיהור זיקת 12, ואילו שיטות זיהוי חלופיות כוללות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, במיקרוסקופ כוח אטומי, פיזור אור דינאמי, ומערבי סופג 8. על ידי שילוב של טכניקות שונות, ניתן להתאים את השיטות שהוצגו כאן על מנת ליצור פרוטוקולים מתאימים ביותר ללימוד אוכלוסיות EV שונות של עניין.

באופן כללי, זיהוי אישי של כלי רכב חשמליים באמצעות FCM עובד היטב לניתוח רכב חשמלי גדול יותר אבל מאבד את הרגישות ככלי רכב חשמלי מקבלים יותר. בעוד זיהוי אישי הוא עקבי יותר באיתור כלי רכב חשמלי גדול יותר, זיהוי מבוסס חרוז הוא פחות רגיש בגילוי מכוניות חשמליים גדולות יותר ורגישות יותר לexosomes. ניתן לכבס מכוניות חשמליות גדולות יותר בקלות באמצעות סינון דואר כתם-וזוהו ביחידות באמצעות FCM. כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר, לעומת זאת, אינם מזוהים גם בנפרד באמצעות FCM והם הרבה יותר קשים כדי לשטוף לאחר צביעה. חרוז-הלכידהפרוטוקול פותר את שני בעיות אלה, המאפשר לכלי רכב החשמליים להישטף בקלות ובמכוניות החשמליות מרובות כדי למדוד יחד כדי ליצור אותות חיוביים גדולים יותר לזיהוי על ידי FCM. עם זאת, יש חסרונות הקשורים בשימוש בשיטה זו, כפי שמתוארת בטבלה 1.

כאשר עובדים עם cytometer פחות רגיש, היכולת לגילוי פרט היא מוגבלת. לפני ניתוח EV, הרגישות של cytometer צריכה להיקבע באמצעות תערובת של גדלי חרוז החל 0.1-1.0 מיקרומטר. כישלון של cytometer לזהות רוב החלקיקים מתחת 1.0 מיקרומטר יחייב את השימוש בפרוטוקול המבוסס על חרוז. סמנים מאוד הביעו בקלות זוהו או באמצעות פרוטוקול. אוכלוסיות נדירות הן לפעמים קלים יותר לזהות באמצעות פרוטוקול גילוי חלקיקים הבודד ולא בפרוטוקול לכידת חרוז, לעומת זאת, זה יכול להשתנות בהתאם למשתנים כגון: הבהירות של fluorochrome, EV של המדגם: r חרוזatio, ואת הגודל של הערך הגלום הנושא את סמן תא שטח הנדיר. זיהוי של סמנים מרובים על חלקיק יחיד מחייב שימוש בשיטת זיהוי האישי. השיטה מבוססת חרוז היא לא מסוגל זיהוי EV הבודד. לכן, הפרוטוקול המבוסס על חרוז יניב נתונים שהם יותר איכותיים בטבע, ואילו שיטת זיהוי האישית תיתן נתונים כמותיים יותר.

טכניקות בידוד נוספות חייבים להיות מנוצלים בכל פעם שכלי רכב החשמלי נחוצים ליישומים במורד הזרם. כלי רכב חשמליים המשמשים במבחנים פונקציונליים צריכים להיות ultracentrifuged באמצעות פרוטוקול צנטריפוגה ההפרש 3 שלבים, מאז החלבונים בסרום המסיסים בפלזמה יכולים להשפיע על תוצאות ניסוי פונקציונליות. לאפיון של כלי רכב חשמליים, לעומת זאת, ultracentrifugation אינו מומלץ, שכן צעד הוסיף זה עלול להשפיע על איכות וכמות EV בשל הכוחות הגבוהים הנחילה על החלקיקים 12.

פרוטוקול זיהוי הפרט מכיל sצעדי everal מפתח מותאמים לבדיקת תפוקה גבוהה, ובם: 1) היישום של מסנני צנטריפוגלי להסרת מהירה ויעילה של אירועים חיוביים הנגרמים על ידי אגרגטים Ab, 2) שימוש במסננים כחלופה מעשית יותר לultracentrifugation או חלוקה שיפוע סוכרוז לשטיפת Ab מאוגד מדגימות EV פוסט מכתים-, ו 3) ניצול תמוגה חומרי הניקוי כביקורת שלילית, שלא רק חושפת אירועים חיוביים שנגרמו על ידי כלי רכב חשמלי שאינם אלא מספק קירוב טוב של הקרינה רקע להבחין חיובי מאוכלוסיות שליליות לציור שערים. פרוטוקול זיהוי האישי מומלץ בכל פעם שמספר גדול של דגימות צריך בדיקה כפי שהוא יכול להתבצע ביום אחד, ואילו בשיטה המבוססת-חרוז דורשת דגירה לילה.

יש לי הבקרות השליליות בכל פרוטוקול יתרונות וחסרונות בהתאם לגילוי שיטה משמש שונים. אחד יתרונות של שימוש מבוסס חרוזssay הוא שאותו נוגדנים חד שבטיים יכולים לשמש לצינורות שליליים וחיוביים ואת אותה השליטה שלילית יכולה לשמש לכל הדגימות. שיטת זיהוי האישית, לעומת זאת, דורשת בקרות נפרדות לקריאה עבור כל דגימה נבדקה. הביקורת השלילית בשימוש על ידי פרוטוקול זיהוי האישי משתמשת דגימות lysed, שאינו דורשות שימוש / הצריכה של נוגדנים נוספים אבל דורשות שכל צינור לקרוא בפעם שנייה לאחר תוספת סוכן lysing של. יש לי בקרות lysed המוסף של להיות מסוגל לזהות את חלקם של איתות חיובית שניתן לייחס לאירועים שאינן קשור לשלפוחית ​​כגון מתחמים חיסוניים 21. Assay מבוסס חרוז אין todistinguish היכולת זו בין אותות חיוביים הנובעים מכלי רכב חשמליים אמיתיים ואלה הנובעים מהלא שלפוחית.

מגבלות של הטכניקה

אמנם אין שיטה סטנדרטית לבידוד של כלי רכב חשמליים, ההפרשצנטריפוגה היא טכניקה נפוצה בקרב חוקרי EV. שיטת צנטריפוגה ההפרש המתוארת כאן מבוססת על פרוטוקולים נפוצים לבידוד PPP, אשר בדרך כלל דורש צנטריפוגה ראשונית בין 1,200-1,500 XG במשך 10-20 דקות כדי להסיר תאים, ואחריו צנטריפוגה שנייה בין 10,000-13,000 XG במשך 10-30 דק ' כדי להסיר טסיות 35. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בצנטריפוגה ב 1500 XG במשך 10 דקות ואחריו צנטריפוגה ב13,000 XG במשך 10 דקות. בעוד כוחות גבוהים יותר של 25,000-100,000 XG נדרשים בדרך כלל לגלולת כלי רכב חשמלי, חלק מכלי הרכב החשמלי הגדול יותר ניתן להסיר עם פרוטוקול צנטריפוגה ההפרש שהצגנו.

עד 90% מכלי הרכב חשמליים זוהה על ידי FCM הולכים לאיבוד עם ultracentrifugation שעה אחת ב100,000 XG (מידע לא מוצג). פעמים צנטריפוגה כבר יש לשקול, אם כי בזהירות, מאחר והדבר עלול להשפיע לרעה על ההרכב של המדגם. אם יש צורך בעיבוד נוסף ואו לימודי אפיון, סינון יכול להתבצע לאחר צנטריפוגה 2-הצעד (לפני הצביעה) לfractionate נוסף דוגמאות המבוססות על גודל חלקיקים. בדומה לאולטרה-צנטריפוגה, סינון יכול לגרום לאובדן של עד 50% מאירועי סמן חיוביים ועד 90% מחלקיקים כולל זוהו על ידי FCM (מידע לא מוצג). בעוד שהעלייה ביחס אות לרעש היא תועלת ברורה, האובדן של כלי רכב חשמליים קטנים מייצג מגבלה משמעותית כאשר בוחן כל שיטת שטיפה או בידוד.

לבסוף, נוגד הקרישה המשמשת (למשל, הפרין, ACD, חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), וכו ') במהלך איסוף דם עלולה להשפיע על האיכות וכמות של תוכן EV. בעוד ACD הוכיח להיות נוגד קרישה טובה ואמינה ללימודים שלנו, בדיקת פתרונות מרובים מומלץ לוודא שנוגד הקרישה המתאימה ביותר ליישום נבחרה. זה חשוב במיוחד כאשר כלי רכב חשמליים ישמשו במבחנים במורד הזרםשבו נוגד הקרישה המשמשת יכול להשפיע על התוצאה. לדוגמא, כמה תרופות נגד קרישת דם (למשל, EDTA והפרין) ידועים להתערב עם תגובות PCR, בעוד שאחרים (למשל, תאופילין, אדנוזין וdipyridamole) הוכחו לעכב שחרור EV מטסיות 12.

שיטות לניתוח EV, תוך שיפור ניכר בעשור האחרון, עדיין בתהליך עבודה. סופו של דבר, את השיטות הטובות ביותר לניתוח רכב חשמלי יהיה תלוי במחקר מתנהלות וכלים העומדים לרשות החוקרת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אי לנו ניגוד עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לדייל הירשקורן מהדם מערכות מכון מחקר על עזרתו עם cytometer זרימת הגדרות מכשיר. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי HL095470 וHL072268 U01 וחוזי DoD W81XWH-10-1-0023 וW81XWH-2-0028.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSR II benchtop flow cytometer BD Biosciences 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)
FACS Diva software  BD Biosciences PC version 6.0
FlowJo software  Treestar US Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particles BD Biosciences 556298 used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency 
Ultra Rainbow fluorescent particles  Spherotech URFP-10-5 used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beads Biocytex 7803 used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead Kit Life Technologies A-10344 used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) Santa Cruz  sc-281108 used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT Tubes BD Biosciences 340334 used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units Millipore  UFC30GVNB used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A BD Biosciences 364606
Facs tubes 12x75 polystrene BD Biosciences 352058
50 ml Reservoirs individually wrapped  Phenix RR-50-1s
Green-Pak pipet tips - 10 µl Rainin GP-L10S
Green-Pak pipet tips -200 µl  Rainin GP-L250S
Green -Pak pipet tips - 1,000 µl  Rainin GP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilized Rainin SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer  Rainin LA8-300XLS
96 well tissue culture plates E&K Scientific EK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes) UCSF Cell Culture Facility CCFAE001 media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered UCSF Cell Culture Facility CCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear BECKMAN COULTER INC 344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5 Biolegend 344808 2 µl
CD14 APC-Cy7 Biolegend 301820 2 µl
CD16 V450 BD Biosciences 560474 2 µl
CD28 FITC biolegend 302906 2 µl
CD152 APC BD Biosciences 555855 2 µl
CD19 A700 Biolegend 302226 2 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 340930 2 µl
CD62L APC Biolegend 304810 2 µl
CD108 PE  BD Biosciences 552830 2 µl
CD235a FITC biolegend 349104 2 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7 Biolegend 301322 2 µl
CD62p APC Biolegend 304910 2 µl
CD66b PE  Biolegend 305106 2 µl
CD15 FITC exalpha X1496M 5 µl
CD9 PE Biolegend 555372
CD63 APC Biolegend 353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ Biolegend 400230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  2. Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
  3. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
  5. Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  6. Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
  7. Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  8. Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
  9. Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
  10. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  11. Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
  12. Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  13. Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
  14. Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
  15. Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
  16. Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
  17. Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
  18. Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
  19. Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
  20. Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
  21. György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  22. Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
  23. Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
  24. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
  25. Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
  26. Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
  27. György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
  28. György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
  29. György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
  30. Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
  31. Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
  32. Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
  33. Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
  34. Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  35. Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 97 microvesicles cytometry זרימה exosomes שלפוחית ​​תאית תפוקה גבוהה microparticles
טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Inglis, H., Norris, P., Danesh, A.More

Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (97), e52484, doi:10.3791/52484 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter