Summary
وجود العديد من الطرق المختلفة لقياس الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية) باستخدام التدفق الخلوي (FCM). وينبغي النظر في العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. يتم عرض بروتوكولين لقياس المركبات الكهربائية، وذلك باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة.
Abstract
خارج الخلية الحويصلات (المركبات الكهربائية) هي، الحويصلات المشتقة من غشاء صغيرة وجدت في سوائل الجسم التي تشارك بشكل كبير في التواصل خلية خلية وتساعد على تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد تم تحليل المركبات الكهربائية باستخدام التدفق الخلوي (FCM) بالغ الصعوبة نظرا لصغر حجمها وقلة السكان منفصلة إيجابي لعلامات من الفائدة. طرق للتحليل EV، في حين تحسنت تحسنا كبيرا على مدى العقد الماضي، لا يزال التقدم في العمل. لسوء الحظ، ليس هناك مقاس واحد يناسب الجميع البروتوكول، ويجب اعتبار العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. المقدمة هنا عدة تقنيات مختلفة لمعالجة المركبات الكهربائية وبروتوكولين لتحليل المركبات الكهربائية باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة. الأساليب المذكورة هنا سوف تساعد في القضاء على المجاميع الأجسام المضادة التي توجد عادة في المستحضرات التجارية، وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووضع بوابات في و عقلانيةashion أن يقلل من الكشف عن مضان الخلفية. يستخدم البروتوكول الأول لطريقة الكشف الفردية التي هي خاصة مناسبة تماما لتحليل كميات كبيرة من العينات السريرية، في حين يستخدم بروتوكول الثاني النهج القائم على حبة لالتقاط وكشف المركبات الكهربائية الصغيرة وexosomes.
Introduction
خارج الخلية الحويصلات (المركبات الكهربائية) هي، الحويصلات المشتقة من غشاء صغيرة وجدت في سوائل الجسم التي تشارك بشكل كبير في التواصل خلية خلية وتساعد على تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد تم تحليل المركبات الكهربائية باستخدام التدفق الخلوي (FCM) بالغ الصعوبة نظرا لصغر حجمها وقلة السكان منفصلة إيجابي لعلامات من الفائدة. طرق للتحليل EV، في حين تحسنت تحسنا كبيرا على مدى العقد الماضي، لا يزال التقدم في العمل. لسوء الحظ، ليس هناك مقاس واحد يناسب الجميع البروتوكول، ويجب اعتبار العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. المقدمة هنا عدة تقنيات مختلفة لمعالجة المركبات الكهربائية وبروتوكولين لتحليل المركبات الكهربائية باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة. الأساليب المذكورة هنا سوف تساعد في القضاء على المجاميع الأجسام المضادة التي توجد عادة في المستحضرات التجارية، وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووضع بوابات في و عقلانيةashion أن يقلل من الكشف عن مضان الخلفية. يستخدم البروتوكول الأول لطريقة الكشف الفردية التي هي خاصة مناسبة تماما لتحليل كميات كبيرة من العينات السريرية، في حين يستخدم بروتوكول الثاني النهج القائم على حبة لالتقاط وكشف المركبات الكهربائية الصغيرة وexosomes.
المركبات الكهربائية، المعروف أيضا باسم المجهرية الدقيقة، هي، الحويصلات المشتقة من غشاء صغيرة وجدت في سوائل الجسم التي تشارك في الاتصالات خلية خلية وتساعد على تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية 1. من خلال التعبير عن علامات سطح مختلفة و / أو التحويل المباشر للمواد البيولوجية والمركبات الكهربائية قادرة على تغيير وظيفة الخلايا المتلقية للعب إما تفعيل أو قمع الأدوار في التواصل بين الخلايا 2-4. ومن المعروف سريريا، المركبات الكهربائية المستمدة من الصفائح الدموية لديها نشاط مضاد للتخثر قوي 5، في حين تم أظهرت الآخرين للمساهمة في مجموعة واسعة من الشروط، من تعزيز الورم metastaجهاز الأمن والمخابرات 6 إلى حماية ضد مرض 7. ويمكن تصنيف المركبات الكهربائية إلى فئات صغيرة من الحويصلات المشتقة من الخلايا مثل exosomes وmicrovesicles (MVS)، اعتمادا على حجمها وآلية لتوليد 8. تواصل تسمية المجموعات السكانية الفرعية حويصلة المشتقة من خلية ليكون موضوع النقاش الدائر 8،9، ومع ذلك، تم وصفها exosomes عموما صغيرة، 40-100 نانومتر الجزيئات المستمدة من الانصهار endosomal مع غشاء البلازما، في حين MVS تكون أكبر من 100 إلى 1،000 الجسيمات نانومتر التي شكلتها سفك غشاء البلازما 10. هنا، المصطلح العام "السيارات الكهربائية" سوف تستخدم للإشارة إلى جميع أنواع الحويصلات البيولوجية خارج الخلية التي تحررها الخلايا.
عزل المركبات الكهربائية من الدم الكامل هو إجراء متعددة الخطوات، وقد أظهرت العديد من المتغيرات معالجة مختلفة للتأثير على المحتوى EV، بما في ذلك درجة حرارة التخزين ومدة 11،12، تخثر / حافظة تستخدم 13 وتستخدم طريقة الطرد المركزي 14. وأدى الحاجة إلى توحيد هذه المتغيرات لتوصيات الجمعية الدولية على تخثر الدم والمعالجة وEV العزلة إجراءات تخثر الدم جنة توحيد القياسي (ISTH SSC) لمناسبة العلمية و15،16، ولكن هناك عدم وجود إجماع بين الباحثين على بروتوكول الأمثل لاستخدام 12. معظم توافق، مع ذلك، أن تخضع لرقابة مشددة متغيرات ما قبل التحليلية حاسمة لبيانات دقيقة وقابلة للتكرار.
من أجل تحليل المركبات الكهربائية، واستخدمت الباحثون أساليب مختلفة، بما في ذلك انتقال الإلكترون المجهري 17، المسح الإلكترون المجهري 18،19، مجهر القوة الذرية، وعلى ضوء ديناميكية نثر 20،21 والغربية النشاف 22،23. في حين FCM هو الأسلوب المفضل لكثير من الباحثين 9،24 - 26 نظرا لقدراتها العالية الإنتاجية، وقد تم تحليل المركبات الكهربائية باستخدام FCMمن الصعب المعروف نظرا لحجمها وقلة السكان إيجابي منفصلة 27 - 32. مقارنة تحليل الخلايا، حجم صغير من النتائج المركبات الكهربائية في 1) أقل مضان المنبعثة نتيجة لعدد أقل من المستضدات في الجسيمات و2) الجدوى محدود من الغسيل بعد وصمة عار، وهو أمر ضروري للحد من مضان الخلفية. التحديات المشتركة بين الباحثين وتشمل إشارات الناشئة عن المجاميع المناعي 27،28 والتجميع الذاتي للأجسام 29. وعلاوة على ذلك، أوقات المعالجة طويلة ومطولة إجراءات الغسيل / العزلة التي يستخدمها العديد من البروتوكولات الحالية 33،34 تتطلب التزامات الوقت عدة أيام لتحليل عدد قليل من العينات، مما يجعلها أقل من مثالية لتطبيقات إنتاجية عالية. بعض الباحثين التخلي عن خطوة غسل تماما، مما يجعل المستخدمة تقليديا FCM ضوابط السلبية مثل مضان ناقص واحد (FMO) وisotypes الأجسام المضادة غير مجدية لتقييم بدقة البكالوريامضان kground 30.
بروتوكولات عنوان لدينا ثلاث مشاكل المشتركة التي يمكن أن تعوق تحليل FCM السليم من المركبات الكهربائية: إشارات الناشئة عن المجاميع الأجسام المضادة وغيرها من غير الحويصلات، صعوبة في إزالة الأجسام المضادة غير منضم، وعدم وجود السكان إيجابي ملحوظ. سوف التقنيات الموضحة هنا مساعدة في القضاء على المجاميع الأجسام المضادة التي توجد عادة في المستحضرات التجارية، وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووضع البوابات بطريقة عقلانية أن يقلل من الكشف عن مضان الخلفية. يتم عرض اثنين من طرق الكشف مختلفة هنا: يستخدم البروتوكول الأول لطريقة الكشف الفردية التي هي خاصة مناسبة تماما لتحليل كميات كبيرة من العينات السريرية، في حين يستخدم بروتوكول الثاني النهج القائم على حبات لالتقاط وكشف المركبات الكهربائية الصغيرة وexosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: لقد تم تنفيذ البروتوكولات التالية في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية من أجل رفاهية الإنسان. تم اختبار جميع العينات موضوع الإنسان في إطار مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) البروتوكول وافق عليها وللموافقة المسبقة عن موضوع من الموضوعات.
1. طريقة A: كشف فردي طريقة
1.1) تجهيز الدم عينة / عزل المركبات الكهربائية
- سحب الدم من الجهات المانحة / المريض الى قسمين 10 مل أنابيب زجاجية تحتوي على 1.5 مل من ACD-A أو الحل الآخر تخثر مناسبة وعملية على الفور (في غضون 30 دقيقة كحد أقصى) باستخدام 2-خطوة بروتوكول التفاضلي الطرد المركزي التالية.
ملاحظة: هذا البروتوكول تسفر حوالي 10 مل من الصفائح الدموية الفقراء البلازما (PPP) من الجمع ~ 17 مل من الدم المسحوبة. إذا كان هناك حاجة أكثر أو أقل PPP، وعدد من أنابيب الدم التي تم جمعها يمكن تعديلها وفقا لذلك. - أجهزة الطرد المركزي العينات في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة في RTلفصل البلازما من معطف الشهباء وخلايا الدم الحمراء. نقل 1.2 مل aliquots من طاف البلازما إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي، والحرص على عدم تعكير صفو طبقات السفلية تحتوي على معطف الشهباء وخلايا الدم الحمراء.
- تدور 13،000 XG لمدة 10 دقيقة في RT لإزالة الصفائح الدموية وشظايا خلية كبيرة. نقل بعناية PPP، تاركا وراءه 200 ميكرولتر لتجنب إزعاج بيليه وإضافة PPP لأنبوب جديد.
- عند هذه النقطة، استخدم PPP فورا للتحليل أو نقل في 1.0 مل مأخوذة إلى الجديدة 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنتين لتحليلها لاحقا (راجع الشكل 1A لمحة عامة).
- إذا كانت هناك حاجة المركبات الكهربائية النقية للتجارب الفنية، ونقل 6 مل من PPP إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة وإضافة 28 مل من 0.2 ميكرون تصفية الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). تدور لمدة 60 دقيقة في 100،000 x ج في RT باستخدام نابذة فائقة السرعة مجهزة الدوار الدلو المتأرجح. طاف نضح و resuspend EV PELدعونا في 1.5 مل سائل الإعلام.
ملاحظة: للحصول على أعلى استنساخ، ينبغي معالجة عينات الدم وباستمرار ممكن من الجهات المانحة إلى الجهات المانحة. أي تغيير في طريقة EV العزلة يمكن أن يؤثر بشكل كبير من عدد ونوع المركبات الكهربائية الكشف عنها.
1.2) إعداد عينات للتحليل
ملاحظة: من هذه النقطة، توضح الخطوات بروتوكول الإنتاجية العالية لتحليل 12 عينة لمدة 14 علامات في 3 لوحات. ومع ذلك، مجموعات أخرى من الأجسام المضادة يمكن استخدامها هنا. بروتوكول يمكن تكييفها لدراسة السكان EV الآخرين من خلال استبدال علامات المقترحة لتلك المصالح.
- إزالة 12 عينة من الفريزر (إذا المخزنة في -80 ° C)، وذوبان الجليد عند 37 درجة مئوية.
- محتويات ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط. إزالة 320 ميكرولتر من كل عينة وإضافة إلى الصف العلوي من 96 لوحة جيدا.
ملاحظة: A-عرض قابل للتعديل متعددة جيدا الماصة هي مفيدة للغاية لهذا والعديد من الخطوات الأخرى في جميع أنحاء الحمارآه، لا سيما عند تحليل عينات متعددة في وقت واحد.
1.3) عينات تلطيخ EV
- قبل تلطيخ، تصفية جميع الأجسام المضادة (عبس) لإزالة الركام، الذي يمكن أن يسبب اشارات ايجابية.
- الجمع بين الأجسام المضادة لاستخدامها في كل من لوحات منفصلة 3 الى 0.22 ميكرون فلتر أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي باستخدام زاوية ثابتة واحدة الطرد المركزي سرعة (~ 750 x ج) في RT لمدة 2 دقيقة، أو حتى كل من خليط أب قد مرت من خلال مرشح ويبقى أي السائل الأجسام المضادة على سطح المرشح. متجر الكوكتيلات أب في الثلاجة لمدة تصل إلى أسبوعين ولكن إعادة تصفية في كل مرة قبل الاستخدام.
- إضافة كمية مناسبة من تصفيتها أب الخليط إلى كل بئر في الصف 2 (على سبيل المثال، وعينات في لوحة ملطخة أنا مع 2 ميكرولتر من كل أب، لذلك يتم إضافة ما مجموعه 12 ميكرولتر من أب كوكتيل تصفيتها لكل بئر إلى صف 2). الرجوع إلى الشكل 1B للمخطط من لوحة خريطة المقترحة. كرر هذه بالإضافةالصورة إلى الصفوف تحت إذا تم تشغيل المزيد من لوحات (هنا، إضافة 8 ميكرولتر / جيد من كوكتيل لوحة II إلى صف 3 و 11 ميكرولتر / جيد من كوكتيل لوحة III إلى صف 4؛ الرجوع إلى قائمة المواد للحصول على معلومات لوحة محددة).
- باستخدام الماصة متعدد القنوات، وخلط العينات PPP في الصف 1 صعودا وهبوطا ونقل 100 ميكرولتر من الآبار في الصف 1 إلى آبار في الصف 2. مزيج صعودا وهبوطا. تغيير النصائح وتكرار، ونقل 100 ميكرولتر من الصف 1 إلى صفوف 3 و 4. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
1.4) عينات غسل MV
- إزالة لوحة 96-جيدا من 4 ° C ونقل إلى خزانة السلامة البيولوجية. باستخدام ماصة متعدد القنوات، إضافة 220 ميكرولتر من PBS / جيد لالصفوف 6-8 (لاستخدامها في الشطف / غسل الآبار التي تحتوي على الملون PPP).
- نقل محتويات كل بئر لأنابيب فلتر الطرد المركزي وصفت ما قبل استخدام متعدد القنوات الماصة ذات العرض قابل للتعديل (لل12 عينة، مع 3 لوحات من الأجسام المضادة، 12 × 3 = 36 أنابيب مرشح سوفأن الحاجة). باستخدام نفس النصائح، وإزالة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني من الصفوف غسل وإضافة إلى الآبار المقابلة التي تمت إزالة PPP فقط.
- مزيج صعودا وهبوطا لشطف الآبار ونقل الحل شطف لنفس الفلاتر التي تكون PPP وأضيف سابقا. قمم قريبة من المرشحات الطرد المركزي. تغيير النصائح.
- كرر هذه العملية مع عينات الملون المتبقية حتى يتم نقل جميع العينات PPP الملون جنبا إلى جنب مع حلول شطف لمرشحات الطرد المركزي.
- نقل المرشحات الطرد المركزي لجهاز للطرد المركزي الدوار الثابتة وتدور في 850 x ج لمدة 3 دقائق في RT.
ملاحظة: تأكد من أنه لا يوجد السائل يبقى على قمم التصفية. بعد الطرد المركزي، يجب أن يظهر مرشح ليكون "الجافة" مع عدم وجود طبقة السوائل واضحة المتبقية على القمة. بينما من غير المحتمل، قد عينات PPP معينة تتطلب وقتا أطول الطرد المركزي للتحرك نحو فعال من خلال التصفية. - إزالة أنابيب الطرد المركزي فلتر والعودة الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.باستخدام الماصة متعدد القنوات، resuspend وقمم من المرشحات في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. نقل محتويات معلق لأنابيب مسبقا المسمى لتحليل FCM فوري.
ملاحظة: من المهم جدا للحفاظ على قوة وعدد من المنخفضات ماصة الغطاس متسقة بين عينات لتجنب تباين العينة إلى العينة. ينبغي من الناحية المثالية أن يتم ذلك باستخدام الماصة الإلكترونية التي تم برمجتها لالماصة صعودا وهبوطا حجم معين (على سبيل المثال، 280 ميكرولتر) رقم دقيق مرات (على سبيل المثال، 8 مرات) لكل عينة.
1.5) الإعداد عداد الكريات
- فتح برنامج FCM. قبل تجربة الإعداد، نفذ معايرة الأدوات اليومية والإعداد باستخدام الخرز الإعداد أداة (بعد تعليمات الشركة الصانعة).
- إذا كان قد تم ملطخة عينات EV مع الأجسام المضادة أكثر من واحد ويتم قياس fluorochromes متعددة في وقت واحد، وحساب القيم التعويض على النحو التالي:
- إضافة 2 قطرات من حبات تعويض ما قبلأنابيب -labeled (1 أنبوب لكل الأجسام المضادة تألقي مترافق) وإضافة الكمية الموصى بها من الأجسام المضادة. إضافة 2 قطرات من حبات تعويض السلبية إلى أنبوب آخر لاستخدامه كقاعدة سيطرة تعويض غير ملوثين.
- احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني و resuspend في 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- باستخدام تدفق عداد الكريات البرمجيات المضمنة مع الصك، تشغيل كل أنبوب التعويض وضبط الفولتية الفلورسنت لوضع كل الذروة في ما يقرب من 10 4 على نطاق وسجل 5 العقد. تأكد من أن ذروة مضان هي أعلى (ألمع) في قناة الفلورسنت الخاصة بها بالمقارنة مع جميع القنوات الأخرى، وضبط الفولتية من المعلمات الفلورسنت مرة أخرى إذا لزم الأمر. تشغيل كل أنبوب شركات الملون بشكل فردي والقبض على ما لا يقل عن 5،000 الأحداث في أنبوب.
- حدد علامة التبويب "تجربة"، ثم حدد "التعويض"، ثم حدد "حساب التعويض" لتطبيق القيم تعويضات لجميع العينات.
- أثناء تشغيل أنبوب من برنامج تلفزيوني تصفيتها ميكرون 0.22، وضبط FSC وSSC الفولتية إلى أعلى القيم التي تستبعد غالبية الضوضاء في الخلفية (أي أقل بقليل من عتبة الجهد الذي يفوق معدل الحدث 5 أحداث / ثانية).
- وبعد ذلك، تشغيل أنبوب يحتوي على 0.2 ميكرون - 1.0 ميكرون الخرز، مخففة في PBS إذا لزم الأمر. في FCS مقابل SSC مؤامرة، رسم بوابة حول السكان حبة لالتقاط الأحداث بين 0.2 ميكرون و 1.0 ميكرون. بدلا من ذلك، في SSC-H الرسم البياني، رسم بوابة لتشمل جميع الأحداث أصغر من حبات 1.0 ميكرون.
- ضبط معدل تدفق عداد الكريات إلى "لو" (حوالي 8-12 ميكرولتر / دقيقة). باستخدام أنبوب الخرز (أو أنبوب الآخرين التي تحتوي على تركيز معروف من الخرز) ضبط معدل تدفق الطلب على عداد الكريات حتى عشيةمعدل الإقليم الشمالي يصل حوالي 200 الأحداث / ثانية. قراءة جميع أنابيب العينات بمعدل تدفق نفسه واستخدام تركيز حبة نفسه في التجارب المستقبلية لضمان أن تظل معدلات تدفق ثابتة بين أشواط.
- تشغيل أنبوب من الجزيئات الفلورسنت قوس قزح مخففة في برنامج تلفزيوني. اكتساب 5،000 الأحداث. تسجيل قيم الكثافة المتوسطة للFSC، SSC، ولكل قناة لون. استخدام هذه القيم لضبط الفولتية في التجارب المستقبلية لضمان أن تظل كثافة مضان متسقة بين التجارب.
1.6) القراءة عينة
- ضبط معدل تدفق عداد الكريات إلى "لو" (حوالي 8-12 ميكرولتر / دقيقة) وتشغيل كل عينة بالضبط 1 أو 2 دقيقة.
- بعد القراءة الأولى، إضافة 20 ميكرولتر من 10٪ NP-40 لكل عينة، ماصة صعودا وهبوطا، وإعادة قراءة لنفس مقدار الوقت (إما 1 أو 2 دقيقة) للسماح الطرح من الأحداث الإيجابية المكتشفة في العينة هي lysed خلال فترة زمنية متساوية.
ملاحظة: ومن عفريت غايةortant أن عينات تكون مختلطة باستخدام الماصة بدلا من دوامة. في تجربتنا، ويمكن أن يسبب vortexing لتجميع الذاتي من بعض الأجسام المضادة، مما يؤدي إلى الأحداث الإيجابية-محاكاة EV. - وبمجرد قراءة جميع العينات، تصدير جميع الملفات .fcs في ملف منفصل لاستخدامها لمزيد من التحليل باستخدام برنامج التحليل FCM.
1.7) تحليل البيانات
- فتح برامج التحليل FCM. استيراد كافة الملفات .fcs في ملف تجربة جديدة.
- فتح حبات فقط الأنبوب. في FSC-A مقابل SSC-A المؤامرة، ورسم بوابة حول كل الخرز الحجم بين 0.2 ميكرون و 1.0 ميكرون. هذا باب EV. اسحب لإضافة لجميع العينات.
- باستخدام عينات هي lysed والضوابط السلبية، ووضع بوابات على حافة مضان الخلفية في كل قناة مضان المستخدمة. سحب بوابات الفلورسنت في بوابة EV من كل المقابلة عينة غير هي lysed.
ملاحظة: عند هذه النقطة فإنه من المفيد أيضا لدراسة مزدوجة الفلورسنت المؤامرات ثنائية المعلمة. الأشكال الصواريخ فيرباعي مزدوج الموجب (انظر الشكل 8)، لا سيما إذا عرفت علامات الموجودة على أنواع الخلايا لا علاقة لها، قد تكون مؤشرا على قطعة أثرية من تجميع أو غيرها من الأحداث محاكاة حويصلة. - لكل علامة فلوري، طرح عدد من الأحداث في العينة هي lysed من عدد من الأحداث في العينة غير هي lysed. اختياريا، تقسيم هذا العدد على العدد الكلي من المركبات الكهربائية داخل البوابة غير هي lysed EV للحصول على القيم الإيجابية٪.
2. الطريقة ب: الخرز الطريقة
2.1) تجهيز الدم عينة / عزل المركبات الكهربائية
- الرجوع إلى طريقة معالجة الدم وصفها في الأسلوب A (القسم 1.1).
2.2) إعداد عينات للتحليل
- إذا رغبت في ذلك، يجزئ PPP أو المركبات الكهربائية ultracentrifuged في exosomes وmicrovesicles. إضافة 250 ميكرولتر من PPP أو المركبات الكهربائية ultracentrifuged إلى 0.22 ميكرون مرشحات الطرد المركزي ونقلها إلى جهاز للطرد المركزي الدوار ثابت وتدور في 750 سز لمدة 2 دقيقة في RT.
ملاحظة: تأكد من أنه لا يوجد السائل يبقى على قمم التصفية. بعد الطرد المركزي، يجب أن يظهر مرشح ليكون "الجافة" مع عدم وجود طبقة السوائل واضحة المتبقية على القمة. بينما من غير المحتمل، قد عينات معينة تتطلب وقتا أطول قليلا الطرد المركزي لالسائل إلى التحرك على نحو فعال من خلال التصفية. - غسل غير المصقول 6 ميكرومتر الخرز البوليسترين (على سبيل المثال، والخرز ABC السلبية) 2X مع وسائل الاعلام RPMI، وresuspend في 2 مل. إضافة 6،000 حبات لكل أنبوب FACS. إلى أنبوب سيطرة سلبية، إضافة 400 ميكرولتر من RPMI وسائل الإعلام وحدها إلى الخرز. لجميع أنابيب أخرى، إضافة 200 ميكرولتر من PPP أو المركبات الكهربائية ultracentrifuged (أو جزيئاتها) و 200 ميكرولتر من RPMI وسائل الإعلام.
- ضبط مستوى الصوت النهائي لجميع أنابيب إلى 400 ميكرولتر مع وسائل الإعلام واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر.
- في صباح اليوم التالي، وغسل الخرز مع 2 مل من وسائل الإعلام. نضح قبالة طاف.
- منع مع 5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في وسائل الإعلام (400 ميكرولتر) لمدة 3 ساعة على 4 &# 176؛ C على شاكر.
- تغسل حبات مع 2 مل من وسائل الإعلام. نضح و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من المتوسط.
2.3) عينات تلطيخ EV
- تصفية جميع الأجسام المضادة. استخدام نفس وحات الأجسام المضادة المستخدمة في أسلوب A، أو إذا رغبت في ذلك، وخلق مجموعة مختلفة من الأجسام المضادة طالما fluorochromes هم متوافقة مع بعضها البعض.
- الجمع بين جميع الأجسام المضادة لاستخدامها في لوحة واحدة إلى 0.22 ميكرون الطرد المركزي أنبوب التصفية. الطرد المركزي باستخدام زاوية ثابتة سرعة واحدة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة أو حتى كل من خليط أب قد مرت من خلال مرشح ويبقى أي السائل الأجسام المضادة على سطح المرشح.
- إضافة حجم مناسب لتصفيتها كوكتيل الأجسام المضادة لجميع الأنابيب واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- تغسل حبات مع 2 مل من وسائل الإعلام، resuspend في 400 ميكرولتر من وسائل الإعلام وتشغيل مباشرة (أو داخل نفس اليوم) على تدفق عداد الكريات.
2.4) عداد الكريات الإعداد وعينة القراءة
- فتح برنامج FCM. قبل تجربة الإعداد، نفذ معايرة الأدوات اليومية والإعداد باستخدام الخرز الإعداد أداة (بعد تعليمات الشركة الصانعة).
- إذا كان قد تم ملطخة عينات EV مع الأجسام المضادة أكثر من واحد ويتم قياس fluorochromes متعددة في وقت واحد، وحساب القيم التعويض على النحو التالي:
- إضافة 2 قطرات من حبات تعويضات لأنابيب مسبقا المسمى (1 أنبوب لكل الأجسام المضادة تألقي مترافق) وإضافة الكمية الموصى بها من الأجسام المضادة. إضافة 2 قطرات من حبات تعويض السلبية إلى أنبوب آخر لاستخدامه كقاعدة سيطرة تعويض غير ملوثين. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني و resuspend في 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- باستخدام برنامج FCM، تشغيل كل أنبوب التعويض وضبط الفولتية الفلورسنت لوضع كل الذروة في ما يقرب من 10 4 على نطاق وسجل 5 العقد. تأكد من أن ذروة مضان هي أعلى (ألمع) في قناة الفلورسنت الخاصة بها بالمقارنة مع جميع القنوات الأخرى، وضبط الفولتية من المعلمات الفلورسنت مرة أخرى إذا لزم الأمر. تشغيل كل أنبوب شركات الملون بشكل فردي والقبض على ما لا يقل عن 5،000 الأحداث في أنبوب.
- حدد علامة التبويب "تجربة"، ثم "التعويض"، ثم "حساب التعويض" لتطبيق القيم تعويضات لجميع العينات.
- تغيير FSC والمعلمات الجهد التعاون بين بلدان الجنوب لتسجيل نطاق وحدد أدنى عتبات يسمح به عداد الكريات (FSC = 200 وSSC = 200) لكل منهم.
- عينات تشغيل، بوابة على السكان الخرز القميص وتكتسب 2،000 الأحداث في هذه البوابة. تصدير .fcs الملفات.
- استخدام برامج التحليل FCM لتحليل .fcs الملفات. البوابة على حبات القميص. حساب كثافة الفلورسنت المتوسط الهندسي (MFI) لكل تألقي ومقارنتها مع مؤسسة التمويل الأصغر للسيطرة سلبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 الخطة الشاملة لعزل وكشف عن المركبات الكهربائية باستخدام إما طريقة القائم على حبة أو طريقة الكشف الفردية المعالجة. كشف الفردية من المركبات الكهربائية باستخدام FCM يعمل بشكل جيد لتحليل المركبات الكهربائية الكبيرة إلا أن معظم cytometers ليست قادرة على كشف فردي جزيئات صغيرة مثل exosomes. النهج القائم على حبة يسمح المركبات الكهربائية الصغيرة ليتم الكشف عن، ومع ذلك، هناك عيوب المرتبطة باستخدام هذه الطريقة، على النحو المبين في الجدول 1. عموما، والعزلة من المركبات الكهربائية باستخدام تنبيذ فائق (مع أو بدون إضافة التدرج إجراءات تجزئة السكروز) هي أوصى عندما تكون هناك حاجة المركبات الكهربائية لفحوصات وظيفية. تنبيذ فائق يزيل الشوائب بما في ذلك البروتينات في الدم والملوثات الأخرى القابلة للذوبان من البلازما، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج التجريبية وظيفية. ومع ذلك، تنبيذ فائق هو مضيعة للوقت، ويمكن تغيير كمية ونوعية EV 12.
"> وصفت النتائج المتوقعة لاثنين من فحوصات الكشف في أرقام 2-3. وبالنسبة لفحص الكشف عن الفردية، والسيطرة هي lysed (الصف السفلي، الشكل 2) يستخدم لتحديد بوابات للغير هي lysed عينة المقابلة (الصف العلوي، الشكل 2) ينبغي للغالبية الأحداث تقع ضمن بوابة EV. يجب بوابات رباعي لا تكشف الأحداث الإيجابية مزدوجة عندما لم يتم العثور على علامات اثنين في المقارنة عادة على نفس الخلية. المؤامرات biparameter الصحيحة في الشكل 2 تظهر علامات CD108a وCD235a ، وهما الحمراء علامات خلايا الدم المعروف أن تتعايش على الخلايا. وهنا، على المركبات الكهربائية، أكثر من نصف الأحداث الإيجابية هي ايجابية لكلا علامات، كما هو متوقع. وبنفس الطريقة، وعلامات سطح الخلية المعروف أن تتواجد على نفس الخلية ينبغي تظهر أنماط مماثلة من الإيجابية مزدوجة على المركبات الكهربائية. وتظهر المؤامرات مركز biparameter التعبير EV اثنين من علامات معروفة لا للتعايش على الخلايا. وفي هذا التحليل من CD235a (أ bloo الأحمرد خلية علامة) وCD41a (علامة الصفائح الدموية)، تظهر السيارات الكهربائية متميزة، والسكان إيجابي منفصل، والتي من المتوقع نظرا لأنها تأتي من أنواع مختلفة من الخلايا. عندما هي lysed، يجب أن تختفي الأحداث الإيجابية. بشكل عام، أي الأحداث الإيجابية المتبقية بعد تحلل تشير إلى وجود إشارة القادمة من الجزيئات غير حويصلة، وحدات، و / أو المركبات الكهربائية مقاومة للالمنظفات. يبين الشكل 3 النتائج المتوقعة باستخدام طريقة كشف القائم على حبة. وخلافا للطريقة الكشف الفردي، لا يمكن / لا ينبغي النظر إلى هذه البيانات في مؤامرات ثنائية المعلمة. في الجزء العلوي نقطة المؤامرات، لا فصل بين السكان الإيجابية والسلبية موجودة، وتظهر الأحداث في الأرباع إيجابية مزدوجة على الرغم من أنها لا توجد عادة على أنواع الخلايا نفسها يرجع ذلك إلى حقيقة أن كلا النوعين من المركبات الكهربائية وربط ل حبة واحدة. للتعرف على طريقة كشف القائم على حبة، ويتم تحليل البيانات باستخدام أفضل تراكب الرسم البياني مع سيطرة سلبية (يصور تحت نقطة المؤامرات). الإيجابية طق قياسها باستخدام MFI علامة ل(يعني كثافة مضان) ومقارنة مباشرة مع أن من السيطرة السلبية. إذا عينة إيجابية للعلامة في سؤال، ومؤسسات التمويل الأصغر التي تكون أعلى من السيطرة السلبية. سيطرة سلبية للأسلوب حبة هو مجرد حبات سدت مع BSA (لا وأضافت المركبات الكهربائية)، والتي تم ملطخة الأجسام المضادة نفسها وغسلها جنبا إلى جنب مع حبات المغلفة EV. ويمكن رؤية مقارنة بين النتائج المتوقعة باستخدام طريقتين في الشكل (4).قدرة فحص الكشف الفردي إلى تقييم سليم الظواهر EV تعتمد بشكل كبير على النابضة الصحيح لفصل الأحداث أب إيجابية من مضان الخلفية. لذا، فمن الأهمية بمكان لاختيار السيطرة السلبية التي يقلد الأنسب / تتوقع مضان الخلفية لعينة معينة. عندما لا يتم غسلها المركبات الكهربائية الملون قبل قراءة، وتستخدم عادة ضوابط السلبية (على سبيل المثال، isotypes) تفشل في التنبؤ بدقة fluorescenc الخلفيةه لجميع علامات (الشكل 5A). في هذه الحالات، إذا غسل ليس خيارا، والعينات هي lysed تميل للعمل بشكل أفضل للتنبؤ مضان الخلفية. ومع ذلك، عندما يتم غسلها المركبات الكهربائية الملون قبل القراءة (باستخدام الترشيح الطرد المركزي، في هذه الحالة)، وكلاهما ضوابط السلبية (isotypes والعينات هي lysed) تعمل بشكل جيد للتنبؤ مضان الخلفية من عينة (الشكل 5A). وتجدر الإشارة، مع ذلك، أنه في حين أن جميع الضوابط السلبية "العمل"، ويفضل الضوابط هي lysed لأنها توفر معلومات إضافية حول عينة (على سبيل المثال، فإن وجود أحداث غير ذات الصلة حويصلة مقاومة للالمنظفات، و / أو المجاميع) أن يمكن أن يؤدي إلى إشارات إيجابية غير EV-وتضخيم غير صحيح التهم أب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الضوابط نمط إسوي في بعض الأحيان يكون غير جدير بالثقة، حتى في عينات غسلها، كما هو مبين في الشكل 5B، حيث العينة الملون ديها الأحداث الإيجابية أقل من نفس العينة ملطخة الأجسام المضادة isotype السيطرة يقابل. دون إزالة شاملة من الأجسام المضادة غير منضم، FCM نقطة مخططات بعض علامات EV من المستحيل تقريبا لتفسير، كما تظهر السحب من جزيئات الفلورسنت بشكل خافت تمييزه عن خلفياتهم الفلورسنت عالية (الشكل 6، اعلى المؤامرة). غسيل عينات الملون باستخدام مرشحات الطرد المركزي يعزز الفصل بين الخلفية وإشارات علامة إيجابية (الشكل 6، مؤامرة القاع)؛ ومع ذلك، قد تفقد المركبات الكهربائية الصغيرة وexosomes من خلال مسام فلتر.
استخدام خطوة المنظفات تحلل يكشف، الأحداث الإيجابية-محاكاة الحويصلة من المركبات المناعية والبروتين المجاميع 21. عند تحليل PPP باستخدام الكشف الفردي، ويواجه الأحداث الإيجابية التي لا تختفي مع تحلل هو في كثير من الأحيان إلى حد ما حدوثها. غالبا ما تظهر هذه الأحداث مقاومة للالمنظفات المشبوهة، وإشارات قطري الفلورسنت عالية في كل من المعلمة وbiparameter واحدة المؤامرات (الشكل7). سريريا، هذه المجمعات البروتين و / أو المركبات المناعية غير قابلة للذوبان هي أكثر انتشارا في المرضى المصابين بأمراض مختلفة 21، مثل التهاب المفاصل الروماتويدي 28، 19 المتلازمة الكلوية، والذئبة الحمامية الجهازية 29. ولذلك، اعتمادا على الهدف من البحث، قد يرغب احد لتضمين أو إزالتها من الطريق analysis.Another يمكن إشارات قطري النموذج قبل vortexing العينات، خاصة بعد إضافة كاشف تحلل (الشكل 8). ينبغي دائما أن تكون مختلطة عينات صعودا وهبوطا بواسطة الماصة لمنع تشكيل المجاميع.
الشكل 1: مخطط شامل لعزل وكشف عن المركبات الكهربائية باستخدام إما طريقة القائم على حبة أو طريقة الكشف الفردية المعالجة. ومعالجتها (A) في الدم الجامع لأول مرة في PPP. منإعادة، PPP إما أن تتم معالجتها باستخدام مزيد من تنبيذ فائق لانتاج السيارات الكهربائية المعزولة أو استخدامها كما هو في الكشف الفردي أو المقايسات القائم على حبة. (ب) مخطط خريطة لوحة المقترحة لتحليل عينة إنتاجية عالية باستخدام طريقة الكشف الفردي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج المتوقعة لكشف الفردية التدفق الخلوي نقطة المؤامرات تظهر تلطيخ نموذجي من عينات EV هي lysed وunlysed. تظهر قيم النسب المئوية من الأحداث الإيجابية. غالبية الأحداث تقع ضمن بوابة EV. الأحداث هو مبين في المؤامرات biparameter الصحيحة هي ضمن FSC / بوابات EV التعاون بين بلدان الجنوب على اليسار. يتم استخدام العينة هي lysed (الصف السفلي) لتعيين بوابات مقرها الفلورسنت لعصامالفصل المقابلة (غير هي lysed) عينة. يجب بوابات رباعية لا تكشف الأحداث الإيجابية مزدوجة عندما لم يتم العثور على علامات اثنين في المقارنة عادة على نفس الخلية. هنا، CD235a biparameter وCD41a مؤامرة يظهر فصل واضح بين المركبات الكهربائية التعبير عن علامات حمراء خلايا الدم والذين يعبرون عن علامات خلية الصفائح الدموية. وبالمثل، ينبغي علامات سطح الخلية المعروفة الموجودة على نفس الخلية تظهر أنماط مماثلة من الإيجابية مزدوجة على المركبات الكهربائية. وتظهر الحق في مؤامرة biparameter أن أكثر من نصف المركبات الكهربائية CD235a إيجابية أيضا إيجابية للثانوية خلايا الدم الحمراء (RBC) علامة، CD108a. عندما هي lysed، يجب أن تختفي الأحداث الإيجابية. الأحداث الإيجابية المتبقية بعد تحلل تشير إلى وجود إشارة القادمة من غير حويصلة أو المنظفات الجسيمات مقاومة و / أو المجاميع.
الشكل (3): النتائج المتوقعة باستخدام الكشف القائم على حبةالأسلوب. التدفق الخلوي تظهر نقطة المؤامرات تلطيخ تمثيلي من المركبات الكهربائية بالإضافة إلى الخرز وبالمقارنة مع حبات سدت مع BSA، والتي هي بمثابة السيطرة السلبية. تظهر قيم النسب المئوية من الأحداث الإيجابية. الأحداث هو مبين في المؤامرات biparameter الصحيحة هي ضمن FSC / SSC الخرز بوابات على اليسار. لومقرها الخرز طريقة الكشف، ويتم تحليل البيانات باستخدام أفضل تراكب الرسم البياني مع سيطرة سلبية (يصور تحت نقطة المؤامرات). يتم قياس الإيجابية باستخدام MFI علامة في (يعني كثافة مضان) ومقارنة مباشرة مع أن من السيطرة السلبية.
الشكل 4: مقارنة بين النتائج المتوقعة باستخدام الخرز مقابل الكشف الفردي تدفق نقطة الخلوي تظهر المؤامرات تلطيخ تمثيلي من المركبات الكهربائية بالإضافة إلى الخرز (الصف العلوي)، بالمقارنة مع المركبات الكهربائية باستخدام تحليل الكشف الفردي (الصف السفلي). أحداثهو مبين في حق biparameter المؤامرات تقع ضمن FSC / SSC الخرز بوابات على اليسار.
وتبين المقارنة بين مختلف الضوابط السلبية في تحليل الكشف الفردي القيم النسب المئوية من الأحداث الإيجابية: الرقم 5. الأحداث المعروضة هي ضمن بوابة FSC / SSC EV. (A) مقارنة ضوابط السلبية في مقابل غير مغسولة غسلها العينات. وجرى تقييم نمط إسوي أو الضوابط هي lysed لقدرتها على تقديم مؤشرات مناسبة من مضان الخلفية عبر جهازي علامات مختلفة في عينة الملون بالكامل (الصف السفلي). وقدمت بوابات لكل علامة باستخدام عينة هي lysed (الصف العلوي) ومن ثم نسخها إلى الصفوف تحت. تم غسلها عينات غسلها باستخدام الترشيح بعد وصمة عار. (ب) مثال لعينة ملطخة isotype السيطرة ذات الأحداث أكثر إيجابية من العينة الملون وايث الأجسام المضادة الفعلي.
الشكل 6: تأثير الغسيل بعد وصمة عار في الكشف عن القيم الفردية تظهر النسب والأرقام من الأحداث الإيجابية. الأحداث المعروضة هي ضمن بوابة FSC / SSC EV. وقدمت بوابات لكل عينة باستخدام نظيره لكل العينة هي lysed (لا يظهر، تشير إلى الرقم السابق لوضع بوابة في غير مغسولة مقابل عينات غسلها). مضان خلفية عالية يجعل تمييز إيجابي من الأحداث السلبية الصعبة (مؤامرة أعلى). عند غسلها، ومع ذلك، تبين السكان إيجابي كما تتم إزالة الأجسام المضادة الفلورسنت غير منضم ويتم تقليل مضان الخلفية (مؤامرة القاع).
الرقم 7: تحلل المنظفات يؤكد وجود غير EV الصورةignals. الأحداث المعروضة هي ضمن بوابة FSC / SCC EV. تظهر قيم النسب المئوية من الأحداث الإيجابية. تليت عينات EV الملون قبل (العمود الأيسر) وبعد إضافة المنظفات (العمود الأيمن) لتحديد إشارات إيجابية الناجمة عن المركبات المناعية وغيرها من الأحداث غير ذات الصلة EV-.
الرقم 8: vortexing ليتسبب في ظهور إشارات غير EV-الأحداث المعروضة هي ضمن بوابة FSC / SCC EV. تظهر قيم النسب المئوية من الأحداث الإيجابية. كانت تقرأ عينات EV الملون قبل (العمود الأيسر) وبعد إضافة المنظفات (العمود الأيمن). ويمكن استخدام دوامة لخلط العينات يسبب-محاكاة EV، والسكان قطري لتشكيل (الصف العلوي). عندما تمزج بلطف صعودا ونزولا باستخدام الماصة، ومع ذلك، وتشكيل لهؤلاء السكان يمكن تجنبها (الصف السفلي). لا ينصح vortexing لللخلط، لأنها يمكن أن تسبب التجميع في بعض العينات، وليادينغ لقطري-الظهور، السكان إيجابي. بشكل عام، يجب أن عدد الحدث ضمن البوابة الأكيدة لا يزيد بعد الناشر.
| كشف حبة استنادا- | كشف الفردية | |
| مقاسات EV | الموصى بها ل<100 نانومتر فقط | الموصى بها ل> 100 نانومتر فقط |
| مرة | يتطلب الحضانة بين عشية وضحاها | يمكن إكمال في <1 اليوم |
| حساسية | الكشف عن نظام المجموعة | الكشف عن جسيم واحد |
| النتائج | نوعي | كمي |
| غسل | بسيط، الطرد المركزي القياسية | يتطلب مرشحات الطرد المركزي |
| السيطرة السلبية | حبات BSA المغلفة | عينات هي lysed |
الجدول 1: إيجابيات وسلبيات كل من طرق الكشف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقدمت اثنين من بروتوكولات مختلفة لعزل ومعالجة وتحليل المركبات الكهربائية، وذلك باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة. اختيار أنسب طريقة لاستخدام ليست دائما واضحة ويتطلب فهما للعينة التي يجري اختبارها وكذلك مجموعات سكانية فرعية فردية من الفائدة. وعلاوة على ذلك، يجب النظر حساسية عداد الكريات المستخدمة للحصول عند اختيار أنسب طريقة. في كثير من الأحيان ليس هناك أفضل بروتوكول واحد للاستخدام، بل مزيج من الأساليب يوفر مزيد من المعلومات حول عينة من أي طريقة واحدة فقط. من الناحية المثالية، عدة تقنيات العزل والكشف مختلفة يجب تقييم أولا من أجل وضع بروتوكول مصممة تأخذ بعين الاعتبار فرد عداد الكريات الأداء فيما يتعلق السكان EV محددة تجري دراستها. وتشمل تقنيات عزل بديلة تنبيذ فائق، السكروز تجزئة الكثافة، immunomagnetic بالفصل EAD، اللوني، وتنقية تقارب 12، في حين تشمل طرق الكشف بديلة المجهر الإلكتروني، ونقل الإلكترون المجهري، مجهر القوة الذرية، تشتت الضوء الديناميكي، والنشاف الغربي 8. من خلال الجمع بين التقنيات المختلفة، والأساليب المقدمة هنا يمكن تكييفها من أجل خلق بروتوكولات الأنسب لدراسة السكان EV مختلف المصالح.
بشكل عام، والكشف عن الأفراد من المركبات الكهربائية باستخدام FCM يعمل بشكل جيد لتحليل المركبات الكهربائية الكبيرة ولكن يفقد حساسية كما الحصول على المركبات الكهربائية الصغيرة. في حين كشف الفرد هو أكثر اتساقا في الكشف عن المركبات الكهربائية الكبيرة، كشف القائم على حبة هو أقل حساسية في الكشف عن المركبات الكهربائية أكبر وأكثر حساسية لexosomes. المركبات الكهربائية الكبيرة يمكن غسلها بسهولة عن طريق الترشيح بعد وصمة عار والكشف عن منفردة عبر FCM. المركبات الكهربائية وexosomes أصغر، من ناحية أخرى، لا يتم الكشف جيدا على حدة باستخدام FCM وهي أكثر صعوبة لغسل ما بعد تلطيخ. لالتقاط حبةبروتوكول يحل كل من هذه القضايا، والسماح المركبات الكهربائية التي يجب غسلها بسهولة والمركبات الكهربائية متعددة ليتم قياسها معا لخلق اشارات ايجابية اكبر للكشف بواسطة FCM. ومع ذلك، هناك عيوب المرتبطة باستخدام هذه الطريقة، على النحو المبين في الجدول 1.
عند العمل مع عداد الكريات أقل حساسية، والقدرة على كشف الفردية محدودة. قبل التحليل EV، ينبغي تحديد حساسية عداد الكريات باستخدام مزيج من أحجام حبة تتراوح 0،1-1،0 ميكرون. فشل عداد الكريات إلى الكشف عن الغالبية من الجسيمات دون 1.0 ميكرون يستلزم استخدام البروتوكول القائم على حبة. يتم اكتشاف علامات أعرب غاية بسهولة باستخدام البروتوكول. السكان ندرة هي أسهل في بعض الأحيان للكشف باستخدام بروتوكول اكتشاف جسيم واحد بدلا من بروتوكول التقاط حبة، ولكن هذا يمكن أن تختلف تبعا متغيرات مثل: سطوع تألقي، العينة EV: حبة صATIO، وحجم EV تحمل علامة نادرة سطح الخلية. الكشف عن علامات متعددة على جسيم واحد يتطلب استخدام طريقة الكشف الفردي. طريقة القائمة على حبة غير قادر على الكشف EV الفردية. ولذلك، فإن البروتوكول القائم على حبة تسفر البيانات التي هي أكثر نوعية في الطبيعة، في حين أن طريقة الكشف الفردي سوف تعطي المزيد من البيانات الكمية.
يجب استخدام تقنيات عزل إضافية كلما هناك حاجة إلى المركبات الكهربائية لتطبيقات المصب. يجب ultracentrifuged المركبات الكهربائية المستخدمة في المقايسات الفنية باستخدام 3-خطوة بروتوكول التفاضلي الطرد المركزي، منذ بروتينات مصل القابلة للذوبان في البلازما يمكن أن تؤثر على النتائج التجريبية وظيفية. لتوصيف المركبات الكهربائية، ومع ذلك، لا ينصح تنبيذ فائق، حيث أن هذه الخطوة قد تؤثر على جودة وأضاف EV وكمية يرجع ذلك إلى قوات عالية المنقولة على جسيمات 12.
بروتوكول الكشف الفردي يحتوي الصورةالخطوات الرئيسية everal الأمثل لاختبار الإنتاجية العالية، بما في ذلك: 1) تنفيذ الفلاتر الطرد المركزي لإزالة سريعة وفعالة من الأحداث الإيجابية الناجمة عن المجاميع أب، 2) استخدام مرشحات كبديل عملي أكثر لتنبيذ فائق أو السكروز التدرج تجزئة لغسل غير منضم أب من عينات EV بعد تلطيخ، و3) استخدام المنظفات تحلل كعنصر تحكم السلبية، الذي يكشف ليس فقط الأحداث الإيجابية الناجمة عن عدم المركبات الكهربائية، ولكنها توفر تقريب جيد من مضان الخلفية للتمييز إيجابي من السكان السلبي للرسم البوابات. وأوصى بروتوكول الكشف الفردي كلما يحتاج إلى عدد كبير من العينات الاختبار لأنه لا يمكن أن يؤديها في يوم واحد، في حين يتطلب طريقة القائم على حبة والحضانة بين عشية وضحاها.
الضوابط السلبية في كل بروتوكول لها مزايا وعيوب اعتمادا على الطريقة التي كشف يستخدم مختلفة. واحد الفائدة من استخدام القائم على حبةssay هو أن نفس الأجسام المضادة وحيدة النسيلة يمكن استخدامها لأنابيب السلبية والإيجابية ونفس سيطرة سلبية يمكن استخدامها لجميع العينات. طريقة الكشف الفردي، من ناحية أخرى، يتطلب ضوابط منفصلة أن تقرأ عن كل عينة تم اختبارها. يستخدم عنصر التحكم السلبية التي يستخدمها بروتوكول الكشف الفردي عينات هي lysed، والتي لا تتطلب استخدام / استهلاك الأجسام المضادة إضافية ولكن لا تتطلب أن كل أنبوب أن يقرأ مرة ثانية بعد إضافة وكيل الناشر. الضوابط هي lysed لها فائدة إضافية تتمثل في القدرة على تحديد نسبة إشارة الإيجابية التي يمكن أن تعزى إلى أحداث غير ذات الصلة حويصلة مثل المركبات المناعية 21. ليس لدى فحص القائم على حبة هذه القدرة todistinguish بين الإشارات الإيجابية الناتجة عن المركبات الكهربائية الحقيقية وتلك التي تنشأ من غير الحويصلات.
القيود المفروضة على تقنية
وبينما لا يوجد طريقة موحدة لعزل المركبات الكهربائية، التفاضليةالطرد المركزي هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع بين الباحثين EV. وتستند هذه الطريقة التفاضلية الطرد المركزي الموصوفة هنا على بروتوكولات مشتركة لعزل PPP، والتي تتطلب عادة على الطرد المركزي الأولي بين 1،200-1،500 x ج لمدة 10-20 دقيقة لإزالة الخلايا، تليها الطرد المركزي الثاني بين 10،000-13،000 x ج لمدة 10-30 دقيقة لإزالة الصفائح الدموية 35. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم الطرد المركزي في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة تليها الطرد المركزي في 13،000 x ج لمدة 10 دقيقة. بينما القوات أعلى من 25،000-100،000 x ج عادة ما تكون مطلوبة لتكوير المركبات الكهربائية، وبعض من المركبات الكهربائية الكبيرة يمكن إزالتها مع بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي قدمناه.
ما يصل الى 90٪ من المركبات الكهربائية الكشف عنها بواسطة FCM تضيع مع ساعة واحدة تنبيذ فائق في 100،000 x ج (لا تظهر البيانات). وينبغي النظر في الأوقات الطرد المركزي أطول، ولو بحذر، لأن هذا قد يؤثر سلبا على تكوين العينة. إذا كان هناك حاجة معالجة إضافية وأو دراسات التوصيف، والترشيح لا يمكن أن يؤديها بعد 2-خطوة الطرد المركزي (قبل تلطيخ) لمواصلة يجزئ عينات بناء على حجم الجسيمات. وعلى غرار الطرد المركزي فائقة، ويمكن الترشيح يؤدي إلى خسارة تصل إلى 50٪ من الأحداث علامة إيجابية وتصل إلى 90٪ من إجمالي جزيئات الكشف عنها بواسطة FCM (لا تظهر البيانات). في حين أن الزيادة في نسبة الإشارة إلى الضوضاء هي من فائدة واضحة، وفقدان المركبات الكهربائية الصغيرة تمثل قيدا كبيرا عند النظر في أي الغسيل أو العزلة الأسلوب.
وأخيرا، فإن تخثر تستخدم (على سبيل المثال، الهيبارين، ACD، حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، وما إلى ذلك) خلال جمع الدم قد تؤثر على نوعية وكمية المحتوى EV. في حين أثبت ACD أن يكون تخثر جيدة وموثوق بها لدراساتنا، واختبار حلول متعددة يوصى للتأكد من أن تخثر الأنسب لتطبيق يتم اختيار. هذا مهم بشكل خاص عند وسوف تستخدم المركبات الكهربائية في المقايسات المصبحيث تخثر المستخدمة يمكن أن تؤثر على النتيجة. على سبيل المثال، ومن المعروف أن بعض مضادات التخثر (على سبيل المثال، EDTA والهيبارين) لتتدخل في تفاعلات PCR في حين ثبت الآخرين (على سبيل المثال، الثيوفيلين، الأدينوزين وديبيريدامول) لمنع إطلاق سراح EV من الصفائح الدموية 12.
طرق للتحليل EV، في حين تحسنت تحسنا كبيرا على مدى العقد الماضي، لا يزال التقدم في العمل. في نهاية المطاف، فإن أفضل الطرق لتحليل المركبات الكهربائية سيعتمد على البحوث التي أجريت والأدوات المتاحة للباحث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر دايل Hirschkorn من معهد بحوث النظم الدم لمساعدته مع تدفق عداد الكريات ضبط الصك. كان مدعوما من المعاهد الوطنية للصحة هذا العمل يمنح HL095470 وU01 HL072268 وعقود وزارة الدفاع W81XWH-10-1-0023 وW81XWH-2-0028.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
- Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
- Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
- Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
- Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
- Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
- Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
- Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
- Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
- Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
- Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
- Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
- György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
- György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
- Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
- Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).
