Summary
De nombreux procédés existent pour la mesure de vésicules extracellulaires (VE) à l'aide de la cytométrie de flux (FCM). Plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Deux protocoles de mesure pour les véhicules électriques sont présentés, en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes.
Abstract
Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d'intérêt. Méthodes d'analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n'y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Présenté voici plusieurs techniques différentes pour les véhicules électriques de traitement et deux protocoles d'analyse véhicules électriques en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. Les méthodes décrites ici vont aider à éliminer les agrégats d'anticorps trouve couramment dans les préparations commerciales, l'augmentation du rapport signal-bruit, et les portes de réglage dans un f rationnelleashion qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l'analyse d'un volume élevé d'échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur bourrelet de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.
Introduction
Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d'intérêt. Méthodes d'analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n'y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Présenté voici plusieurs techniques différentes pour les véhicules électriques de traitement et deux protocoles d'analyse véhicules électriques en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. Les méthodes décrites ici vont aider à éliminer les agrégats d'anticorps trouve couramment dans les préparations commerciales, l'augmentation du rapport signal-bruit, et les portes de réglage dans un f rationnelleashion qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l'analyse d'un volume élevé d'échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur bourrelet de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.
VE, aussi connu comme microparticules, sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques 1. À travers l'expression de différents marqueurs de surface et / ou le transfert direct de matériel biologique, les véhicules électriques sont en mesure de modifier la fonction des cellules réceptrices de jouer soit l'activation ou la suppression de rôles dans la communication intercellulaire 2-4. VE, dérivées des plaquettes cliniquement sont connus pour avoir une forte activité anticoagulante 5, tandis que d'autres ont été montrés pour contribuer à une large gamme de conditions, de la promotion tumorale metasta6 sis à protéger contre la maladie 7. VE peuvent être classés en catégories plus petites vésicules de dérivés de cellules tels que les exosomes et microvésicules (MV), en fonction de leur taille et le mécanisme de génération 8. La nomenclature des sous-populations de vésicules dérivées de cellules continue d'être un sujet de débat en cours 8,9, cependant, les exosomes sont généralement décrits comme petite, de 40 à 100 nm particules provenant de la fusion des endosomes avec la membrane plasmique, tandis que MV sont plus de 100 à 1000 des particules nm formés par l'excrétion de la membrane plasmique 10. Ici, le terme général "VE" sera utilisé pour désigner tous les types de vésicules biologiques extracellulaires libérés par les cellules.
Isolement des véhicules électriques à partir de sang entier est une procédure en plusieurs étapes et de nombreuses variables différentes de traitement se sont révélés affecter le contenu EV, y compris la température et la durée de stockage 11,12, anticoagulant / conservateur utilisé 13 etméthode de centrifugation utilisée 14. Un besoin de standardisation de ces variables a abouti à des recommandations de la Société internationale de thrombose et de traitement du sang et d'isolement EV procédures du Comité de normalisation (ISTH SSC) pour le bon Hémostase scientifiques et 15,16, mais il ne existe aucun consensus parmi les chercheurs sur le protocole optimal à utiliser 12. La plupart conviennent, cependant, que les variables pré-analytiques étroitement contrôlées sont cruciales pour les données précises et reproductibles.
Afin d'analyser les véhicules électriques, les chercheurs ont utilisé diverses méthodes, y compris la microscopie électronique à transmission 17, la microscopie électronique à balayage 18,19, microscopie à force atomique, la lumière diffusion dynamique de 20,21 et 22,23 western blot. Alors que la FCM est la méthode de choix pour de nombreux chercheurs 9,24 - 26 en raison de ses capacités à haut débit, analyse des véhicules électriques en utilisant la FCM a éténotoirement difficile en raison de leur taille et le manque de populations positifs discrets 27-32. Par rapport à l'analyse des cellules, la petite taille des résultats de SVE en 1) moins de fluorescence émise en raison du nombre inférieur d'antigènes par particule et 2) la faisabilité limitée de post-tache lavage, ce qui est nécessaire pour réduire la fluorescence de fond. Défis communs entre les chercheurs comprennent signaux issus agrégats d'immunoglobulines 27,28 et auto-agrégation des anticorps 29. En outre, les longs délais de traitement et procédures de lavage / d'isolement de longs utilisés par un grand nombre de protocoles actuels 33,34 nécessitent des engagements de temps de plusieurs jours pour analyser un petit nombre d'échantillons, ce qui les rend moins idéal pour les applications à haut débit. Certains chercheurs renoncent à une étape de lavage tout à fait, rendant traditionnellement utilisés contrôles négatifs FCM telles que la fluorescence moins un (FMO) et isotypes d'anticorps inutile pour évaluer précisément bacfluorescence kground 30.
Nos protocoles portent sur trois problèmes communs qui peuvent entraver l'analyse de la FCM correcte des véhicules électriques: signaux issus des agrégats d'anticorps et d'autres non-vésicules, de la difficulté à éliminer l'anticorps non lié, et le manque de populations positifs perceptibles. Les techniques décrites ici seront utiles pour éliminer les agrégats d'anticorps on trouve couramment dans les préparations commerciales, l'augmentation du rapport signal-sur-bruit, et la mise en portes de façon rationnelle qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Deux méthodes de détection différentes sont présentés ici: le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l'analyse d'un volume élevé d'échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur des perles-de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.
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Protocol
REMARQUE: Les protocoles suivants ont été réalisées en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. Tous les échantillons des sujets humains ont été testés dans un conseil d'examen institutionnel (IRB) -approuvé protocole et avec le consentement éclairé des sujets.
1. Méthode A: Méthode de détection individuelle
1.1) Le traitement de l'échantillon de sang / Isolation des véhicules électriques
- Prélever le sang du donneur / patient dans deux tubes de 10 ml en verre contenant 1,5 ml d'ACD-Solution A ou un autre anticoagulant approprié et processus immédiatement (dans les 30 minutes max) en utilisant le 2-step protocole de centrifugation différentielle suivante.
NOTE: Ce protocole donnera environ 10 ml de plasma pauvre en plaquettes (PPP) des combinés ~ 17 ml de sang prélevé. Si plus ou moins PPP est nécessaire, le nombre de tubes de sang collecté peut être ajustée en conséquence. - Centrifuger les échantillons à 1500 g pendant 10 min à température ambiantepour séparer le plasma de la couche leucocytaire et les globules rouges. Transférer 1,2 ml aliquotes du surnageant de plasma pour 1,5 ml tubes de centrifugation, en faisant attention de ne pas déranger les couches inférieures contenant la couche leucocytaire et les globules rouges.
- Tourner à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante pour éliminer les plaquettes et les grands fragments cellulaires. Transférer soigneusement le PPP, laissant derrière 200 pi pour éviter de perturber le culot et ajouter le PPP dans un nouveau tube.
- À ce stade, utiliser PPP immédiatement pour l'analyse ou le transfert dans aliquotes de 1,0 ml à 1,5 ml de nouveaux tubes de centrifugeuse et conserver à -80 ° C pendant jusqu'à deux ans pour une analyse ultérieure (voir la figure 1A pour un aperçu).
- Si VE purifiés sont nécessaires pour les expériences fonctionnelles, transfert 6 ml de PPP à un tube d'ultracentrifugeuse et ajouter 28 ml de 0,2 um filtré la solution tampon phosphate (PBS). Spin pendant 60 min à 100 000 x g à la température ambiante en utilisant une ultracentrifugeuse équipé d'un rotor à godet oscillant. Aspirer le surnageant et remettre en suspension EV pellaisser dans 1,5 ml de milieu.
NOTE: Pour plus reproductibilité, des échantillons de sang doivent être traités de manière aussi cohérente que possible d'un donneur à. Toute variation dans la méthode d'isolement EV pourrait avoir une incidence significative le nombre et le type de véhicules électriques détectés.
1.2) Préparation des échantillons pour analyse
NOTE: A partir de là, les étapes expliquer un protocole à haut débit pour l'analyse de 12 échantillons pour 14 marqueurs en trois panneaux. Cependant, d'autres combinaisons d'anticorps peuvent être utilisés ici; le protocole peut être adapté à l'étude d'autres populations EV en substituant les marqueurs ont été proposées pour ceux d'intérêt.
- Retirer du congélateur 12 échantillons (se il est stocké à -80 ° C) et du dégel à 37 ° C.
- contenu de la pipette de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Retirer 320 pi de chaque échantillon et ajouter à la rangée du haut d'une plaque de 96 puits.
REMARQUE: Un multi-puits pipette réglable en largeur est extrêmement utile pour cela et bien d'autres étapes tout au long de l'âneay, en particulier lors de l'analyse de plusieurs échantillons à la fois.
1.3) Les échantillons coloration EV
- Avant coloration, filtrer tous les anticorps (ABS) pour éliminer les agrégats, ce qui peut provoquer des signaux positifs.
- Moissonneuses anticorps à utiliser dans chacun des trois panneaux à 0,22 um tubes filtrants centrifuges séparées et centrifugation en utilisant une centrifugeuse à angle fixe unique de vitesse (~ 750 x g) à température ambiante pendant 2 min, ou jusqu'à ce que la totalité du mélange Ab a traversé le filtre et qu'aucun liquide ne reste d'anticorps sur la surface du filtre. Magasin Ab cocktails dans le réfrigérateur jusqu'à deux semaines, mais re-filtre à chaque fois avant de l'utiliser.
- Ajouter la quantité appropriée de mélange Ab filtré pour chaque puits dans la rangée 2 (par exemple, des échantillons de Groupe I sont colorées avec 2 pi de chaque Ab, soit un total de 12 ul du cocktail Ab filtrée est ajouté par puits à la ligne 2). Reportez-vous à la figure 1B pour un aperçu de la carte de la plaque suggéré. Répétez ces pluss pour les lignes en dessous si plusieurs panneaux sont exécutés (ici, ajouter 8 pl / puits du cocktail Panel II à la ligne 3 et 11 pl / puits du cocktail Panel III à ramer 4; se référer à la liste de matériaux pour des informations spécifiques du panneau).
- Utilisation de la pipette multicanaux, mélanger les échantillons de PPP dans la rangée 1 de haut en bas et de transférer 100 pi des puits dans la rangée 1 dans les puits dans la rangée 2. Mix de haut en bas. conseils de changement et de répétition, le transfert de 100 pi de la ligne 1 aux lignes 3 et 4. Incuber à 4 ° C pendant 30 min.
1,4) échantillons de MT à laver
- Retirer la plaque de 96 puits de 4 ° C et le transfert au Cabinet de sécurité biologique. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 220 pi de PBS / bien rangées 6-8 (à utiliser pour le rinçage / lavage des puits contenant teinté PPP).
- Transférer le contenu de chaque puits pour tubes filtrants centrifuges pré-étiquetés en utilisant le multicanal pipette réglable en largeur (Pour 12 échantillons, avec 3 panneaux d'anticorps, 12 x 3 = 36 tubes de filtreêtre nécessaire). En utilisant les mêmes conseils, retirer 200 pi de PBS à partir des lignes de lavage et ajouter aux puits correspondants à partir de laquelle PPP a été juste enlevé.
- Mélanger haut et bas pour rincer les puits et transférer la solution de rinçage pour les mêmes filtres à laquelle le PPP a déjà été ajouté. Fermer sommets des filtres centrifuges. Changer conseils.
- Répétez ce processus avec les échantillons colorés restants jusqu'à ce que tous les échantillons PPP colorées ont été transférés avec leurs solutions de rinçage à filtres centrifuges.
- Transférer les filtres centrifuges à rotor d'une centrifugeuse de filage fixe et à 850 g pendant 3 minutes à température ambiante.
REMARQUE: Veiller à ce qu'aucun liquide reste sur les sommets de filtre. Après centrifugation, le filtre doit apparaître comme "sec" sans couche de fluide restant visible sur le dessus. Bien que peu probable, certains échantillons PPP peuvent nécessiter un temps de centrifugation plus à se déplacer efficacement à travers le filtre. - Retirer les tubes de filtre centrifuge et revenir à l'enceinte de sécurité biologique.En utilisant la pipette à canaux multiples, remettre en suspension les sommets des filtres dans 300 ul de PBS. Transférer le contenu remises en suspension dans des tubes pré-étiquetés pour une analyse immédiate FCM.
NOTE: Il est très important de garder la force et le nombre de dépressions pipette à piston cohérentes parmi les échantillons pour éviter la variation échantillon à échantillon. Ce devrait idéalement être fait en utilisant une pipette électronique qui a été programmé pour pipette de haut en bas un volume spécifique (par exemple, 280 pi) d'un nombre exact de fois (par exemple, 8 fois) pour chaque échantillon.
1.5) la configuration du cytomètre
- Ouvrez le logiciel FCM. Avant d'expérimenter l'installation, effectuer l'étalonnage de l'instrument par jour et la configuration utilisant des billes de configuration de l'appareil (en suivant les instructions du fabricant).
- Si les échantillons EV ont été colorées avec plus d'un anticorps et multiples fluorochromes sont à mesurer à la fois, calculer les valeurs de rémunération comme suit:
- Ajouter deux gouttes de perles de compensation de prétubes marqué au (1 tube pour chaque anticorps conjugué à un fluorochrome) et ajouter la quantité recommandée d'anticorps. Ajouter deux gouttes de perles négatifs de compensation dans un autre tube à utiliser comme commande de compensation sans tache.
- Incuber à 4 ° C pendant 30 min, on lave avec du PBS et remettre en suspension dans 400 ul de PBS.
- Utilisation du cytomètre de flux logiciel fourni avec l'appareil, exécutez chaque tube de compensation et de régler les tensions fluorescentes de placer chaque pic à environ 10 4 sur une échelle de 5 log-décennie. Assurez-vous que le pic de fluorescence est le plus élevé (le plus clair) dans son propre canal fluorescente par rapport à tous les autres canaux, et d'ajuster les paramètres de tensions fluorescentes à nouveau si nécessaire. Exécutez chaque tube maquette individuellement colorées et de capturer au moins 5000 événements par tube.
- Sélectionnez l'onglet "Expérience", puis sélectionnez «Rémunération», puis sélectionnez «Calculer la rémunération» pour appliquer les valeurs de rémunération à tous les échantillons.
- Lors de l'exécution d'un tube de 0,22 um filtré PBS, régler les tensions FSC et SSC aux valeurs les plus élevées qui excluent la majorité du bruit de fond (ce est à dire, juste en dessous du seuil de tension à laquelle le taux d'événements dépasse 5 événements / sec).
- Ensuite, exécutez un tube contenant 0,2 um - 1,0 um perles, dilué dans du PBS si nécessaire. Dans un complot FCS vs SSC, dessiner une grille autour de la population de billes pour capturer les événements entre 0,2 um et 1,0 um. Alternativement, dans un histogramme SSC-H, dessiner une porte d'inclure tous les événements plus petits que les 1,0 um perles.
- Réglez le débit du cytomètre à «Lo» (environ 8 à 12 pi / min). En utilisant le tube de perles (ou autre tube contenant une concentration connue de perles) régler le cadran de débit sur le cytomètre jusqu'à la veillent taux atteint environ 200 événements / sec. Lire tous les tubes échantillons au même débit et utiliser la même concentration de billes dans des expériences futures pour se assurer que les débits restent cohérents entre les courses.
- Exécutez un tube de particules fluorescentes arc dilué dans du PBS. Acquérir 5000 événements. Notez les valeurs d'intensité moyenne pour FSC, SSC, et chaque canal de couleur. Utilisez ces valeurs pour ajuster les tensions dans les expériences futures à assurer que les intensités de fluorescence restent cohérents entre les expériences.
1,6) lecture de l'échantillon
- Réglez le débit du cytomètre à «Lo» (environ 8 à 12 pi / min) et tester chaque échantillon pendant exactement 1 ou 2 min.
- Après la première lecture, ajouter 20 ul de 10% de NP-40 à chaque échantillon, une pipette de haut en bas, et pour relire la même quantité de temps (soit une ou deux minutes) pour permettre la soustraction d'événements positifs détectés dans l'échantillon lysées sur un laps de temps égal.
NOTE: Il est extrêmement important que les échantillons soient mélangés à l'aide d'une pipette plutôt que d'un vortex. Dans notre expérience, vortex peut causer l'auto-agrégation de certains anticorps, conduisant à des événements positifs EV-imitant. - Une fois que tous les échantillons ont été lus, l'exportation de tous les fichiers .fcs dans un fichier séparé pour être utilisé pour l'analyse en outre l'utilisation des logiciels d'analyse de la FCM.
1.7) Analyse de données
- Ouvrez le logiciel d'analyse de la FCM. Importer tous les fichiers de .fcs dans un nouveau fichier de l'expérience.
- Ouvrez le perles seule tube. Dans le FSC-A vs SSC-Un complot, dessiner une grille autour de toutes les perles de taille entre 0,2 um et 1,0 um. Ce est la porte d'EV. Faites glisser pour ajouter à tous les échantillons.
- En utilisant les échantillons lysées comme témoins négatifs, dessiner portes au bord de la fluorescence de fond dans chaque canal de fluorescence utilisé. Faites glisser portes fluorescents dans la porte EV de chaque échantillon non-lysées correspondant.
NOTE: A ce stade, il est également utile d'examiner fluorescentes deux parcelles bi-paramètres. formes de fuséele quadrant double positif (voir figure 8), en particulier si les marqueurs sont connus pour se trouver sur les types de cellules non liées, peuvent être le signe d'artefact à partir de l'agrégation ou d'autres événements imitant des vésicules. - Pour chaque marqueur fluorescent, soustraire le nombre d'événements dans l'échantillon lysé du nombre d'événements dans l'échantillon non-lysées. Eventuellement, diviser ce nombre par le nombre total de véhicules électriques au sein de la grille non-lysées EV pour obtenir% des valeurs positives.
2. Méthode B: Méthode Perles
2.1) Le traitement de l'échantillon de sang / Isolation des véhicules électriques
- Reportez-vous à la méthode de traitement du sang décrit dans la méthode A (article 1.1).
2.2) Préparation des échantillons pour analyse
- Si vous le souhaitez, fractionner PPP ou EVS ultracentrifugés en exosomes et microvésicules. Ajouter 250 pi de PPP ou EVS ultracentrifugés à 0,22 um filtres centrifuges et transfert à une centrifugeuse à rotor fixe et tournent à 750 xg pendant 2 minutes à température ambiante.
REMARQUE: Veiller à ce qu'aucun liquide reste sur les sommets de filtre. Après centrifugation, le filtre doit apparaître comme "sec" sans couche de fluide restant visible sur le dessus. Bien que peu probable, certains échantillons peuvent nécessiter un temps de centrifugation légèrement plus longue pour le fluide de se déplacer de manière efficace à travers le filtre. - Lavez non couchés 6 um billes de polystyrène (par exemple, perles négatifs ABC) 2x avec les médias RPMI, et remettre en suspension dans 2 ml. Ajouter 6000 perles à chaque tube FACS. Pour le tube de contrôle négatif, ajouter 400 ul de milieu RPMI seul à billes. Pour tous les autres tubes, ajouter 200 pi de PPP ou EVS ultracentrifugés (ou de leurs fractions) et 200 pi de milieu RPMI.
- Ajuster le volume final de tous les tubes avec 400 ul de médias et incuber une nuit à 4 ° C sur un agitateur.
- Le lendemain matin, lavez perles avec 2 ml de milieu. Aspirer le surnageant.
- Bloquer avec 5% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans un milieu (400 ul) pendant 3 heures à 4 &# 176; C sur un agitateur.
- Lavez perles avec 2 ml de milieu. Aspirer et remettre en suspension le culot dans 100 pl de milieu.
2.3) Les échantillons coloration EV
- Filtrer tous les anticorps. Utiliser les mêmes panneaux anticorps utilisé dans la méthode A, ou si on le souhaite, de créer une combinaison différente d'anticorps aussi longtemps que leurs fluorochromes sont compatibles entre eux.
- Mélanger tous les anticorps à utiliser dans un seul panneau dans un tube de filtre centrifuge de 0,22 um. Centrifugeuse utilisant une centrifugeuse à angle fixe à une seule vitesse pendant 2 minutes ou jusqu'à ce que la totalité du mélange Ab a traversé le filtre et qu'aucun liquide ne reste d'anticorps sur la surface du filtre.
- Ajouter le volume approprié de cocktail d'anticorps filtré à tous les tubes et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
- Lavez perles avec 2 ml de médias, remettre en suspension dans 400 pi de milieu et l'exécuter immédiatement (ou dans la même journée) sur cytomètre de flux.
2.4) cytomètre installation et lecture d'échantillon
- Ouvrez le logiciel FCM. Avant d'expérimenter l'installation, effectuer l'étalonnage de l'instrument par jour et la configuration utilisant des billes de configuration de l'appareil (en suivant les instructions du fabricant).
- Si les échantillons EV ont été colorées avec plus d'un anticorps et multiples fluorochromes sont à mesurer à la fois, calculer les valeurs de rémunération comme suit:
- Ajouter deux gouttes de perles de compensation à des tubes pré-étiquetés (1 tube pour chaque anticorps conjugué à un fluorochrome) et ajouter la quantité recommandée d'anticorps. Ajouter deux gouttes de perles négatifs de compensation dans un autre tube à utiliser comme commande de compensation sans tache. Incuber à 4 ° C pendant 30 min, on lave avec du PBS et remettre en suspension dans 400 ul de PBS.
- Utilisation du logiciel de la FCM, exécutez chaque tube de compensation et ajuster tensions fluorescentes de placer chaque pic à environ 10 4 sur une échelle logarithmique 5-décennie. Assurez-vous que le pic de fluorescence est le plus élevé (le plus clair) dans son propre canal fluorescente par rapport à tous les autres canaux, etajuster les tensions de paramètres fluorescentes à nouveau si nécessaire. Exécutez chaque tube maquette individuellement colorées et de capturer au moins 5000 événements par tube.
- Sélectionnez l'onglet "Expérience", puis "rémunération", puis "Calculer la rémunération» pour appliquer les valeurs de rémunération à tous les échantillons.
- Changez le FSC et les paramètres de tension SSC à échelle logarithmique et sélectionnez les seuils les plus bas permis par le cytomètre (FSC et SSC = 200 = 200) pour chaque.
- Échantillons terme, porte sur la population des perles de singlet et acquièrent 2000 événements dans cette porte. Les dossiers de l'exportation.
- Utilisez le logiciel d'analyse de la FCM pour analyser .fcs fichiers. Porte sur des billes de singlet. Calculer l'intensité de fluorescence moyenne géométrique (IMF) pour chaque fluorochrome et comparer avec l'IMF du contrôle négatif.
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Representative Results
La figure 1 présente le schéma général de traitement pour l'isolement et la détection des véhicules électriques en utilisant soit la méthode de la tringle ou de la méthode de détection utilisée. Détection individuelle des véhicules électriques utilisant FCM fonctionne bien pour l'analyse de grands véhicules électriques mais la plupart des cytomètres sont pas capables de détecter individuellement des particules aussi petites que les exosomes. Une approche basée bourrelet permet aux petits véhicules électriques à détecter, cependant, il existe des inconvénients associés à l'utilisation de cette méthode, comme indiqué dans le tableau 1. En général, l'isolation des véhicules électriques en utilisant une ultracentrifugation (avec ou sans l'addition d'un gradient procédure de fractionnement saccharose) est recommandé lorsque les véhicules électriques sont nécessaires pour des tests fonctionnels. Ultracentrifugation élimine les impuretés, y compris des protéines sériques et d'autres contaminants solubles du plasma, ce qui peut affecter les résultats fonctionnels expérimentaux. Cependant, ultracentrifugation est consommatrice de temps et peut modifier la quantité et la qualité 12 EV.
"> Les résultats attendus pour les deux tests de détection sont représentées dans les figures 2-3. Pour le test de détection individuelle, le contrôle lysées (rangée du bas, Figure 2) est utilisé pour définir portes pour l'échantillon non-lysées correspondant (rangée du haut, figure 2). La majorité des événements doit se situer dans la porte d'EV. portes Quadrant ne devraient pas révéler les événements doubles positifs lorsque les deux marqueurs dans la comparaison ne sont pas normalement trouvé sur la même cellule. Les parcelles de biparameter droite de la figure 2 montrent les marqueurs CD108a et CD235a qui sont deux marqueurs de cellules sanguines rouges connues de coexister sur des cellules. Ici, sur les véhicules électriques, plus de la moitié des événements positifs sont positifs pour les deux marqueurs, comme prévu. De la même manière, les marqueurs de la surface cellulaire connus pour résider sur la même cellule devrait montrer des modèles similaires de double positivité sur les VE. Les parcelles centre de biparameter montrent expression EV de deux marqueurs qui sont connus pour ne pas coexister sur cellules. Dans cette analyse de CD235a (un bloo rouged marqueur cellulaire) et CD41a (un marqueur de plaquettes), les véhicules électriques, les populations montrent, positifs séparées distinctes, ce qui devrait, car ils proviennent de différents types de cellules. Lorsque lysées, événements positifs devraient disparaître. En général, tous les événements restants après lyse positives indiquent la présence de signal provenant de particules non vésiculaires, des agrégats et / ou des véhicules électriques détergentes résistant. La figure 3 montre les résultats escomptés en utilisant le procédé de détection à base de bourrelet. Contrairement à la méthode de détection, ces données ne peuvent pas / ne devraient pas être considérés dans les parcelles bi-paramètres. Dans les parcelles de point supérieur, pas de séparation entre les populations positives et négatives existe, et les événements apparaissent dans les quadrants doubles positifs, même se ils ne sont pas normalement trouvés sur les mêmes types de cellules en raison du fait que les deux types de véhicules électriques vont se lier à un perle unique. Pour la méthode de détection à base de perles, les données sont mieux analysés en utilisant des superpositions d'histogramme avec le témoin négatif (représenté sous les tracés de points). Positivité is mesurée à l'aide de MFI de marqueur (intensité de fluorescence moyenne) et comparé directement avec celle du contrôle négatif. Si un échantillon est positif pour le marqueur en question, son IMF sera plus élevé que le contrôle négatif. Le contrôle négatif pour la méthode de perles perles est tout simplement bloqués avec de la BSA (pas de véhicules électriques ajoutés), qui ont été colorées avec les mêmes anticorps et lavé aux côtés des perles de EV-enduit. Une comparaison des résultats escomptés en utilisant les deux méthodes peut être vu sur la figure 4.La capacité du test de détection individu à évaluer correctement phénotypes EV se appuie fortement sur correcte déclenchement de séparer les événements Ab-positifs de la fluorescence de fond. Par conséquent, il est essentiel de choisir un contrôle négatif qui imite la plus appropriée / prédit la fluorescence de fond pour un échantillon donné. Lorsque les véhicules électriques colorées ne sont pas lavés avant de lire, couramment utilisé contrôles négatifs (par exemple, isotypes) ne parviennent pas à prévoir avec précision fond fluorescence pour tous les marqueurs (figure 5A). Dans ces cas, si le lavage ne est pas une option, échantillons lysées tendance à mieux fonctionner pour prédire la fluorescence de fond. Toutefois, lorsque les véhicules électriques colorées sont lavées avant de lire (en utilisant la filtration centrifuge, dans ce cas), les deux contrôles négatifs (isotypes et échantillons lysées) bien fonctionner pour prédire la fluorescence de fond d'un échantillon (figure 5A). Il convient de noter, toutefois, que si tous les contrôles négatifs "de travail", les contrôles lysées sont préférés car ils fournissent des informations supplémentaires sur un échantillon (par exemple, la présence d'événements et / ou des agrégats non liés à la vésicule détergentes résistant) qui peut entraîner des signaux positifs non-EV et gonfler indûment compte Ab. De plus, les contrôles d'isotype peuvent parfois ne pas être fiable, même dans des échantillons lavés, comme le montre la figure 5B, où l'échantillon taché a moins d'effets positifs que le même échantillon coloré avec des anticorps de contrôle d'isotype correspondant. Sans élimination complète de l'anticorps non lié, FCM parcelles de points de certains marqueurs de EV sont presque impossibles à interpréter, apparaissant comme des nuages de particules faiblement fluorescentes indiscernables de leurs milieux très fluorescentes (Figure 6, top parcelle). Laver échantillons colorés en utilisant des filtres centrifuges améliore la séparation entre les signaux de marqueurs positifs fond et (Figure 6, tracé du bas); Toutefois, les petits véhicules électriques et des exosomes peuvent être perdues à travers les pores du filtre.
L'utilisation d'un détergent étape de lyse révèle événements positifs, des vésicules imitant de complexes immuns et de la protéine 21 agrégats. Lorsque PPP est analysé en utilisant la détection individuelle, à la rencontre des événements positifs qui ne disparaissent pas avec la lyse est une occurrence assez souvent. Ces événements détergents résistant apparaissent souvent comme suspectes signaux diagonales, très fluorescentes dans les deux paramètres et biparameter parcelles individuelles (Figure7). , Ces complexes protéiques cliniquement et / ou complexes immuns insolubles sont plus fréquents chez les patients atteints de diverses maladies 21, comme la polyarthrite rhumatoïde 28, syndrome néphrotique 19, et le lupus érythémateux disséminé 29. Par conséquent, en fonction de l'objectif de la recherche, on peut souhaiter inclure ou retirer de la voie analysis.Another signaux diagonales peuvent former est par vortex les échantillons, en particulier après l'ajout du réactif de lyse (Figure 8). Les échantillons doivent être mélangés toujours de haut en bas par pipette pour éviter la formation d'agrégats.
Figure 1: schéma de traitement global pour l'isolement et la détection des véhicules électriques en utilisant soit la méthode de la tringle ou de la méthode de détection utilisée. (A) Le sang total est d'abord transformé en PPP. Dure, PPP peut être soit traitée en outre l'utilisation ultracentrifugation pour obtenir VE isolées ou utilisé tel quel dans la détection individuelle ou tests à base de billes. (B) Aperçu des suggéré la carte de la plaque pour l'analyse de l'échantillon à haut débit en utilisant la méthode de détection individuelle. Se il vous plaît cliquer sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Résultats attendus pour la détection individuelle cytométrie en flux tracés de points montrent coloration représentatif d'échantillons EV lysées et non lysées. Les valeurs affichent des pourcentages d'événements positifs. La majorité des événements relèvent de la porte d'EV. Événements montrés dans les parcelles biparameter droite sont dans les FSC / SSC portes EV sur la gauche. L'échantillon lysées (rangée du bas) est utilisé pour définir portes fluorescentes-base pour each (non-lysées) échantillon correspondant. portes Quad ne devraient pas révéler les événements doubles positifs lorsque les deux marqueurs dans la comparaison ne sont pas normalement trouvé sur la même cellule. Ici, le CD235a de biparameter et CD41a graphique montre une séparation nette entre les véhicules électriques exprimant des marqueurs de globules rouges et ceux qui expriment des marqueurs de cellules de plaquettes. De même, les marqueurs de surface cellulaire connus de résider sur la même cellule devraient montrer des modèles similaires de double positivité sur les véhicules électriques. L'intrigue de biparameter droite montre que plus de la moitié des véhicules électriques CD235a-positifs sont également positives pour le globule rouge (RBC) marqueur secondaire, CD108a. Lorsque lysées, événements positifs devraient disparaître. Les événements positifs restants après lyse indiquent la présence de signal provenant de particules et / ou des agrégats résistants non-vésicules ou détergents.
Figure 3: Résultats attendus en utilisant la détection à base de billesProcédé. La cytométrie en flux courbes par points présentent la coloration représentant des véhicules électriques couplés à des billes, par rapport aux billes bloqués avec BSA, qui sert de témoin négatif. Les valeurs affichent des pourcentages d'événements positifs. Événements montrés dans les parcelles biparameter droite sont dans les FSC / SSC perles portes sur la gauche. Pour la méthode de détection à base de perles, les données sont mieux analysés en utilisant des superpositions d'histogramme avec le témoin négatif (représenté sous les tracés de points). Positivité est mesurée en utilisant la MFI de marqueur (intensité de fluorescence moyenne) et comparée directement avec celle du contrôle négatif.
Figure 4:. Comparaison des résultats escomptés en utilisant des billes contre détection individuelle cytométrie de flux parsèment parcelles montrent coloration représentant de véhicules électriques couplés à des billes (rangée du haut), par rapport aux VE analyse utilisant la détection individuelle (rangée du bas). Événementsmontré dans la bonne biparameter parcelles sont dans les FSC / SSC perles portes sur la gauche.
Figure 5: Comparaison des différents. Contrôles négatifs dans l'analyse de détection individuelle Valeurs affichent des pourcentages d'événements positifs. Événements affichés sont à la porte FSC / SSC EV. (A) Comparaison des contrôles négatifs dans vs non lavé lavé échantillons. Isotype ou contrôle lysées ont été évalués pour leur capacité à fournir des indications appropriées de la fluorescence de fond sur deux marqueurs différents dans un échantillon entièrement teinté (rangée du bas). Portes pour chaque marqueur ont été faites en utilisant l'échantillon lysées (rangée du haut), puis copiés sur les lignes en dessous. Échantillons lavés ont été lavées en utilisant la filtration post-tache. (B) Exemple d'un échantillon coloré avec le contrôle isotypique ayant événements plus positifs que l'échantillon coloré with anticorps réelle.
Figure 6:. Effet de post-lavage dans la tache détection individuelle valeurs montrent pourcentage et le nombre d'événements positifs. Événements affichés sont à la porte FSC / SSC EV. Portails de chaque échantillon ont été faites en utilisant la contrepartie de chaque échantillon lysé (non représenté; se référer à la figure précédente pour l'établissement de grille dans non lavé vs échantillons lavés). Haute fluorescence de fond fait la distinction positive des événements négatifs difficile (de tracé du haut). Le lavage, cependant, la population positif est révélé que des anticorps fluorescents non liés sont éliminés et la fluorescence de fond est réduit (tracé du bas).
Figure 7: lyse détergent confirme la présence de non-EV signals. événements indiqués sont à la porte FSC / SCC EV. Les valeurs affichent des pourcentages d'événements positifs. Échantillons EV colorées ont été lues avant (colonne de gauche) et après addition de détergent (colonne de droite) pour identifier les signaux positifs causés par des complexes immuns et d'autres événements non-EV-liés.
Figure 8: vortex provoque l'apparition de signaux non-EV événements indiqués sont à la porte FSC / SCC EV.. Les valeurs affichent des pourcentages d'événements positifs. Échantillons EV colorées ont été lues avant (colonne de gauche) et après addition de détergent (colonne de droite). L'utilisation d'un vortex pour mélanger les échantillons peut causer, les populations diagonales EV-imitant pour former (rangée du haut). Lorsque mélangé doucement monter et descendre à l'aide d'une pipette, cependant, la formation de ces populations peut être évitée (rangée du bas). Vortex ne est pas recommandé pour le mélange, car il peut provoquer une agrégation dans certains échantillons, leaDing Diagonal-apparaissant, les populations positives. En général, le nombre de cas dans un gate positif ne devrait pas augmenter après lyse.
| Détection Bead-Basé | Détection individuelle | |
| EV Tailles | recommandé de <100 nm seulement | recommandé de> 100 nm seulement |
| Temps | requiert une incubation pendant une nuit | peut terminer dans <1 jour |
| Sensibilité | détection pôle | détection de particules unique |
| Résultats | qualitatif | quantitatif |
| Lavage | centrifugation simple et standard | exige filtres centrifuges |
| Contrôle négatif | Des billes revêtues de BSA | échantillons lysées |
Tableau 1: Avantages et inconvénients des deux méthodes de détection.
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Discussion
Deux protocoles différents pour l'isolement, le traitement et l'analyse des véhicules électriques ont été présentés, soit en utilisant une détection individuelle ou une approche à base de billes. Sélection de la méthode la plus appropriée à utiliser ne est pas toujours simple et nécessite une compréhension de l'échantillon testé ainsi que les sous-populations individuelles d'intérêt. En outre, la sensibilité du cytomètre utilisée pour l'acquisition doit être considéré au moment de choisir la méthode la plus appropriée. Souvent il n'y a pas meilleur protocole simple à utiliser, plutôt, une combinaison de méthodes fournit plus d'informations sur un échantillon que toute une seule méthode. Idéalement, plusieurs techniques d'isolation et de détection différents doivent être évaluées en premier afin d'élaborer un protocole sur mesure qui tient compte de la performance individuelle cytomètre par rapport à la population EV spécifique à l'étude. Techniques d'isolation alternatifs comprennent ultracentrifugation, le saccharose fractionnement de densité, b immunomagnétiqueséparation EAD, la Chromatographie et la purification par affinité 12, alors que les méthodes de détection alternatives incluent la microscopie électronique à balayage, microscopie électronique à transmission, la microscopie à force atomique, diffusion de lumière dynamique, et Western blot 8. En combinant différentes techniques, les méthodes présentées ici peuvent être adaptés afin de créer des protocoles les mieux adaptés pour étudier diverses populations EV d'intérêt.
En général, la détection individuelle des véhicules électriques utilisant FCM fonctionne bien pour l'analyse de grands véhicules électriques mais perd la sensibilité que les véhicules électriques deviennent plus petits. Bien que la détection individuelle est plus cohérente dans la détection de grandes véhicules électriques, la détection à base de billes est moins sensible dans la détection des véhicules électriques plus grands et plus sensible pour les exosomes. Grandes véhicules électriques peuvent être lavés facilement par filtration post-tache et détectés individuellement par la FCM. Les petits véhicules électriques et des exosomes, d'autre part, ne sont pas détectés et individuellement à l'aide de la FCM et sont beaucoup plus difficiles à laver post-coloration. La perle de captureprotocole résout ces deux problèmes, permettant VÉ être facilement lavés et plusieurs véhicules électriques à mesurer ensemble pour créer de plus grandes signaux positifs détectables par la FCM. Cependant, il existe des inconvénients associés à l'utilisation de cette méthode, comme indiqué dans le tableau 1.
Lorsque vous travaillez avec un cytomètre moins sensible, la capacité de détection individuelle est limitée. Avant l'analyse EV, la sensibilité du cytomètre devrait être déterminée en utilisant un mélange de perles de tailles allant de 0,1 à 1,0 um. La défaillance du cytomètre de détecter la majorité des particules inférieures à 1,0 pm, nécessiterait l'utilisation du protocole sur la base de bourrelet. Marqueurs fortement exprimés sont facilement détectés en utilisant soit le protocole. Populations rares sont parfois plus facile à détecter à l'aide du protocole de détection de particules isolées plutôt que le protocole perle de capture, cependant, cela peut varier en fonction de variables telles que: la luminosité de l'fluorochrome, EV de l'échantillon: bourrelet ratio, et la taille de l'EV portant le marqueur de surface de cellule rare. La détection de marqueurs multiples sur une seule particule nécessite l'utilisation de la méthode de détection. La méthode basée perles ne est pas capable de détection individuelle EV. Par conséquent, le protocole à base de billes sera de produire des données qui sont de nature plus qualitative, tandis que la méthode de détection donnera davantage de données quantitatives.
Techniques d'isolement supplémentaires doivent être utilisés à chaque fois que les véhicules électriques sont nécessaires pour les applications en aval. VE utilisées dans des dosages fonctionnels doivent être ultra-centrifugés en utilisant le protocole de centrifugation différentielle en 3 étapes, puisque les protéines sériques solubles dans le plasma peuvent affecter les résultats fonctionnels expérimentaux. Pour la caractérisation des véhicules électriques, cependant, ultracentrifugation ne est pas recommandé, car cette étape supplémentaire peut affecter la qualité et la quantité EV à cause des hautes forces appliquées sur les particules 12.
Le protocole de détection individuelle contient slusieurs étapes clés optimisés pour les tests à haut débit, y compris: 1) la mise en œuvre de filtres centrifuges pour l'élimination rapide et efficace des événements positifs causés par des agrégats Ab, 2) l'utilisation de filtres comme une alternative plus pratique d'ultracentrifugation ou gradient de saccharose fractionnement pour laver non liée Ab à partir d'échantillons EV post-coloration, et 3) l'utilisation de détergent lyse comme contrôle négatif, qui ne révèle pas seulement des événements positifs causés par le non-VE, mais fournit une bonne approximation de la fluorescence de fond de distinguer positive des populations négatives pour le dessin portes. Le protocole de détection individuel est recommandée quand un grand nombre d'échantillons doit être testée comme il peut être réalisé en une seule journée, tandis que le procédé à base de bourrelet nécessite une incubation pendant une nuit.
Les contrôles négatifs dans chaque protocole ont des avantages et des inconvénients différents en fonction de la méthode de détection est utilisée. L'un des avantages de l'utilisation de l'un à base de billeséssayé est que les mêmes anticorps monoclonaux peuvent être utilisés pour les tubes négatifs et positifs et le même témoin négatif peut être utilisé pour tous les échantillons. La méthode de détection, d'autre part, nécessite des contrôles séparés à lire pour chaque échantillon testé. Le contrôle négatif utilisé par le protocole de détection individu utilise échantillons lysées, qui ne nécessitent pas l'utilisation / la consommation d'anticorps supplémentaires, mais ne nécessitent que chaque tube soit lu une deuxième fois après addition de l'agent de lyse. Les contrôles lysées ont l'avantage supplémentaire d'être en mesure d'identifier la proportion de signal positif qui peut être attribuée à des événements non liés à des vésicules telles que des complexes immuns 21. Le dosage à base de perles n'a pas cette capacité todistinguish entre les signaux positifs découlant de vrais véhicules électriques et ceux découlant du non-vésicules.
Limites de la technique
Bien qu'il ne existe pas de méthode normalisée pour l'isolement des véhicules électriques, différentielcentrifugation est une technique largement utilisée parmi les chercheurs EV. La méthode de centrifugation différentielle décrit ici est basé sur des protocoles communs pour isoler PPP, qui nécessitent généralement une centrifugation initiale entre 1.200-1.500 x g pendant 10 à 20 min pour éliminer les cellules, suivie d'une deuxième centrifugation entre 10,000-13,000 xg pendant 10 à 30 min à éliminer les plaquettes 35. Le protocole décrit ici utilise une centrifugation à 1500 xg pendant 10 min suivie d'une centrifugation à 13 000 xg pendant 10 min. Alors que les forces supérieures de 25,000-100,000 XG sont généralement nécessaires pour sédimenter VE, quelques-uns des plus grands véhicules électriques peuvent être enlevées avec le protocole de centrifugation différentielle nous avons présenté.
Jusqu'à 90% des véhicules électriques détectées par la FCM sont perdus avec ultracentrifugation d'une heure à 100 000 xg (données non présentées). Prolongement de la durée de centrifugation doivent être considérées, quoique prudemment, car cela pourrait avoir un impact défavorable sur la composition de l'échantillon. Si un traitement supplémentaire est nécessaire fou des études de caractérisation, la filtration peut être réalisée après la centrifugation deux étapes (avant la coloration) de fractionner des échantillons en outre basées sur la taille des particules. Similaires à l'ultra-centrifugation, la filtration peut aboutir à une perte pouvant atteindre 50% des événements de marqueurs positifs et jusqu'à 90% des particules totales détectées par FCM (données non présentées). Bien que l'augmentation du rapport signal-sur-bruit est un avantage évident, la perte de petits véhicules électriques constitue une limitation significative lorsque l'on considère tout procédé de lavage ou d'isolement.
Enfin, l'anticoagulant utilisé (par exemple, héparine, ACD, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), etc.) lors de la collecte de sang peut influer sur la qualité et la quantité de contenu EV. Bien ACD se est avéré être un bon et fiable anticoagulant pour nos études, tester plusieurs solutions est recommandé de veiller à ce que l'anticoagulant le plus approprié pour l'application est choisi. Ceci est particulièrement important lorsque les véhicules électriques seront utilisés dans des dosages en avaloù l'anticoagulant utilisé peut influer sur le résultat. Par exemple, certains anticoagulants (par exemple, EDTA et héparine) sont connus pour interférer avec des réactions PCR ont été alors montré d'autres (par exemple, la théophylline, adénosine et dipyridamole) pour inhiber EV libération de plaquettes 12.
Méthodes d'analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. En fin de compte, les meilleures méthodes d'analyse des véhicules électriques dépendra de la recherche effectuée et les outils à la disposition du chercheur.
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Disclosures
Les auteurs ne ont aucun conflit d'intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Dale Hirschkorn de Blood Systems Research Institute pour son aide avec cytomètre de flux réglages de l'appareil. Ce travail a été soutenu par le NIH et accorde HL095470 U01 HL072268 et contrats DoD W81XWH-10-1-0023 et W81XWH-2-0028.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
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