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Biology

फ्लो का प्रयोग कोशिकी vesicles के विश्लेषण के लिए तकनीक

Published: March 17, 2015 doi: 10.3791/52484
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,3
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

Summary

कई अलग अलग तरीकों फ्लो (FCM) का उपयोग कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस) की माप के लिए मौजूद हैं। उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि का निर्धारण करते समय कई पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए। मापने ईवीएस के लिए दो प्रोटोकॉल व्यक्ति का पता लगाने या एक मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर प्रस्तुत कर रहे हैं।

Abstract

कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस) सेल सेल संचार में अत्यधिक शामिल कर रहे हैं और जैविक प्रक्रियाओं की एक विविध रेंज को विनियमित करने में मदद कि शारीरिक तरल पदार्थों में पाया छोटे, झिल्ली व्युत्पन्न पुटिकाओं हैं। फ्लो (FCM) का उपयोग कर ईवीएस के विश्लेषण के कारण उनके छोटे आकार और ब्याज की मार्करों के लिए सकारात्मक असतत आबादी की कमी के कारण बेहद मुश्किल हो गया है। काफी पिछले एक दशक से अधिक सुधार हुआ है, जबकि ईवी विश्लेषण के लिए तरीके, अभी भी प्रगति में एक काम कर रहे हैं। दुर्भाग्य से, वहाँ कोई एक आकार फिट सभी प्रोटोकॉल है, और उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि का निर्धारण करते समय कई पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए। कई अलग अलग प्रसंस्करण ईवीएस के लिए तकनीक और व्यक्ति का पता लगाने या एक मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग ईवीएस विश्लेषण करने के लिए दो प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं। एक तर्कसंगत च में आमतौर पर व्यावसायिक तैयारी में पाया एंटीबॉडी समुच्चय को नष्ट करने के साथ सहायता करेंगे यहाँ वर्णित विधियों, बढ़ती संकेत करने वाली शोर अनुपात, और स्थापना के फाटकोंपृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का पता लगाने कि कम से कम ashion। दूसरा प्रोटोकॉल पर कब्जा करने और छोटे ईवीएस और exosomes पता लगाने के लिए एक मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करता है, जबकि पहले प्रोटोकॉल, नैदानिक ​​नमूने की एक उच्च मात्रा का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है कि एक व्यक्ति का पता लगाने की विधि का उपयोग करता है।

Introduction

कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस) सेल सेल संचार में अत्यधिक शामिल कर रहे हैं और जैविक प्रक्रियाओं की एक विविध रेंज को विनियमित करने में मदद कि शारीरिक तरल पदार्थों में पाया छोटे, झिल्ली व्युत्पन्न पुटिकाओं हैं। फ्लो (FCM) का उपयोग कर ईवीएस के विश्लेषण के कारण उनके छोटे आकार और ब्याज की मार्करों के लिए सकारात्मक असतत आबादी की कमी के कारण बेहद मुश्किल हो गया है। काफी पिछले एक दशक से अधिक सुधार हुआ है, जबकि ईवी विश्लेषण के लिए तरीके, अभी भी प्रगति में एक काम कर रहे हैं। दुर्भाग्य से, वहाँ कोई एक आकार फिट सभी प्रोटोकॉल है, और उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि का निर्धारण करते समय कई पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए। कई अलग अलग प्रसंस्करण ईवीएस के लिए तकनीक और व्यक्ति का पता लगाने या एक मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग ईवीएस विश्लेषण करने के लिए दो प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं। एक तर्कसंगत च में आमतौर पर व्यावसायिक तैयारी में पाया एंटीबॉडी समुच्चय को नष्ट करने के साथ सहायता करेंगे यहाँ वर्णित विधियों, बढ़ती संकेत करने वाली शोर अनुपात, और स्थापना के फाटकोंपृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का पता लगाने कि कम से कम ashion। दूसरा प्रोटोकॉल पर कब्जा करने और छोटे ईवीएस और exosomes पता लगाने के लिए एक मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करता है, जबकि पहले प्रोटोकॉल, नैदानिक ​​नमूने की एक उच्च मात्रा का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है कि एक व्यक्ति का पता लगाने की विधि का उपयोग करता है।

यह भी microparticles के रूप में जाना जाता ईवीएस, सेल सेल संचार में शामिल हैं और जैविक प्रक्रियाओं एक की एक विविध रेंज को विनियमित करने में मदद कर रहे हैं कि शारीरिक तरल पदार्थों में पाया छोटे, झिल्ली व्युत्पन्न पुटिकाओं हैं। 4 - विभिन्न सतह मार्करों और / या जैविक सामग्री का सीधा हस्तांतरण की अभिव्यक्ति के माध्यम से, ईवीएस को सक्रिय या कहनेवाला संचार 2 में भूमिका को दबा या तो खेलने के लिए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के समारोह में परिवर्तन करने में सक्षम हैं। दूसरों ट्यूमर metasta को बढ़ावा देने से, स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए योगदान करने के लिए दिखाया गया है, जबकि चिकित्सकीय, प्लेटलेट व्युत्पन्न ईवीएस, मजबूत थक्का-रोधी गतिविधि 5 है जाना जाता हैरोग सात के खिलाफ की रक्षा करने के लिए बहन 6। ईवीएस उनके आकार और पीढ़ी 8 के तंत्र पर निर्भर करता है, इस तरह के exosomes और microvesicles (MVS) के रूप में सेल व्युत्पन्न vesicles के छोटे श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है। MVS 100 से 1000 बड़े होते हैं, जबकि सेल व्युत्पन्न पुटिका उप-जनसंख्या का नामकरण चल रही बहस 8,9 का विषय बना हुआ है, हालांकि, exosomes आम तौर पर, छोटे रूप में प्लाज्मा झिल्ली के साथ endosomal संलयन से निकाली गई 40 से 100 एनएम कणों वर्णित हैं एनएम कणों प्लाज्मा झिल्ली 10 में बहा द्वारा गठित। इधर, सामान्य शब्द "ईवीएस" कोशिकाओं द्वारा जारी कोशिकी जैविक vesicles के सभी प्रकार का उल्लेख करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

पूरे रक्त से ईवीएस के अलगाव एक बहु कदम प्रक्रिया है और कई अलग अलग प्रसंस्करण चर भंडारण तापमान और अवधि 11,12, थक्कारोधी / परिरक्षक 13 का इस्तेमाल किया और सहित ईवी सामग्री, को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया हैcentrifugation के विधि 14 का इस्तेमाल किया। इन चर के मानकीकरण के लिए एक की जरूरत है घनास्त्रता और Haemostasis वैज्ञानिक और उचित लिए मानकीकरण समिति (ISTH एसएससी) रक्त प्रसंस्करण और ईवी अलगाव प्रक्रियाओं 15,16 पर इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा सिफारिशें करने के लिए नेतृत्व, अभी तक इष्टतम प्रोटोकॉल पर शोधकर्ताओं के बीच कोई आम सहमति वहां मौजूद गया है 12 उपयोग करने के लिए। अधिकांश कसकर नियंत्रित पूर्व विश्लेषणात्मक चर सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा के लिए महत्वपूर्ण हैं, हालांकि, कि सहमत हैं।

ईवीएस का विश्लेषण करने के लिए, शोधकर्ताओं 20,21 और 22,23 सोख्ता पश्चिमी बिखरने संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 17, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 18,19, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी, गतिशील प्रकाश सहित विभिन्न तरीकों का उपयोग किया है। FCM के कई शोधकर्ताओं 9,24 के लिए पसंद की विधि है - इसकी वजह से उच्च throughput क्षमताओं के लिए 26, FCM का उपयोग कर ईवीएस का विश्लेषण किया गया है32 - वजह से उनके आकार और असतत सकारात्मक आबादी 27 की कमी के कारण बेहद मुश्किल। कोशिकाओं के विश्लेषण की तुलना में, जो आवश्यक है कण प्रति एंटीजन की कम संख्या के कारण उत्सर्जित 1) कम प्रतिदीप्ति में ईवीएस परिणामों के छोटे आकार के और बाद के दाग धोने के 2) सीमित व्यवहार्यता, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम करने के लिए। शोधकर्ताओं के बीच आम चुनौतियों इम्युनोग्लोबुलिन समुच्चय 27,28 और एंटीबॉडी 29 के आत्म-एकत्रीकरण से उत्पन्न होने वाले संकेतों में शामिल हैं। इसके अलावा, लंबे समय प्रसंस्करण बार और मौजूदा प्रोटोकॉल 33,34 के कई द्वारा इस्तेमाल किया लंबा धोने / अलगाव प्रक्रियाओं उन्हें उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए आदर्श से कम नहीं है, जिससे नमूने की एक छोटी संख्या का विश्लेषण करने के लिए बहु-दिन के समय प्रतिबद्धताओं की आवश्यकता होती है। कुछ शोधकर्ताओं का सही रूप में बीएसी का आकलन करने के लिए इस तरह के प्रतिदीप्ति शून्य से एक (FMO) और एंटीबॉडी आइसोटाइप बेकार के रूप में पारंपरिक रूप से इस्तेमाल FCM के नकारात्मक नियंत्रण प्रतिपादन, कुल मिलाकर एक धोने कदम त्यागनाkground प्रतिदीप्ति 30।

एंटीबॉडी समुच्चय और अन्य गैर-पुटिकाओं, अनबाउंड एंटीबॉडी को दूर करने में कठिनाई है, और प्रत्यक्ष सकारात्मक आबादी की कमी से उत्पन्न होने वाले संकेतों: हमारी प्रोटोकॉल ईवीएस के समुचित FCM के विश्लेषण बाधित कर सकते हैं कि तीन आम समस्याओं का समाधान। यहाँ वर्णित तकनीक, सामान्यतः व्यावसायिक तैयारी में पाया एंटीबॉडी समुच्चय को नष्ट करने के संकेत करने वाली शोर अनुपात में वृद्धि, और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का पता लगाने कि कम से कम एक तर्कसंगत फैशन में फाटकों की स्थापना के साथ मदद करेंगे। दो अलग अलग तरीकों का पता लगाने यहां प्रस्तुत कर रहे हैं: दूसरा प्रोटोकॉल पर कब्जा करने और छोटे ईवीएस और exosomes पता लगाने के लिए एक मोती-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करता है, जबकि पहले प्रोटोकॉल, नैदानिक ​​नमूने की एक उच्च मात्रा का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है कि एक व्यक्ति का पता लगाने की विधि का उपयोग करता है।

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Protocol

नोट: निम्न प्रोटोकॉल मानव कल्याण के लिए सभी, संस्थागत राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया है। सभी मानव विषय नमूने एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) -approved प्रोटोकॉल के तहत और विषयों की सूचित सहमति के साथ परीक्षण किया गया।

1. विधि एक: व्यक्तिगत जांच विधि

ईवीएस का रक्त नमूना / अलगाव का 1.1) प्रसंस्करण

  1. निम्नलिखित 2-कदम अंतर centrifugation के प्रोटोकॉल का उपयोग एसीडी-समाधान के लिए एक या एक से दूसरे तुरंत उपयुक्त थक्कारोधी और प्रक्रिया (30 भीतर न्यूनतम अधिकतम) के 1.5 मिलीग्राम से युक्त दो 10 एमएल ग्लास ट्यूब में दाता / रोगी से रक्त ड्रा।
    नोट: इस प्रोटोकॉल तैयार की रक्त की संयुक्त ~ 17 मिलीलीटर से लगभग 10 मिलीलीटर प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा (पीपीपी) के निकलेगा। कम या ज्यादा पीपीपी की जरूरत है, एकत्र रक्त की नलियों की संख्या के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
  2. आरटी पर 10 मिनट के लिए 1500 XG पर नमूने अपकेंद्रित्रBuffy कोट और लाल कोशिकाओं से प्लाज्मा अलग करने के लिए। Buffy कोट और लाल कोशिकाओं से युक्त नीचे की परत को परेशान करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा, 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए प्लाज्मा सतह पर तैरनेवाला के 1.2 मिलीलीटर aliquots स्थानांतरण।
  3. प्लेटलेट्स और बड़े सेल टुकड़े को हटाने के लिए आरटी पर 10 मिनट के लिए 13,000 XG पर स्पिन। ध्यान से गोली परेशान बचने के लिए और एक नया ट्यूब पीपीपी जोड़ने के लिए 200 μl पीछे छोड़ रहा है, पीपीपी हस्तांतरण।
  4. इस बिंदु पर, बाद में विश्लेषण के लिए साइन अप करने के लिए दो साल (अवलोकन के लिए 1 ए चित्रा देखें) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर विश्लेषण या नया 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए 1.0 मिलीलीटर aliquots में स्थानांतरण और स्टोर के लिए तुरंत पीपीपी का उपयोग करें।
  5. शुद्ध ईवीएस एक ultracentrifuge ट्यूब के लिए कार्यात्मक प्रयोगों, स्थानांतरण पीपीपी के 6 मिलीलीटर के लिए की जरूरत है और 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर फॉस्फेट बफर खारा के 28 मिलीलीटर (पीबीएस) जोड़ रहे हैं। एक झूलते बाल्टी रोटर के साथ सुसज्जित एक ultracentrifuge का उपयोग कर आरटी पर 100.000 XG पर 60 मिनट के लिए स्पिन। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend ईवी PEL1.5 मिलीलीटर मीडिया में करते हैं।
    नोट: उच्चतम reproducibility के लिए, रक्त के नमूने दाता को दाता से ही लगातार जल्द कार्यवाही की जानी चाहिए। ईवी अलगाव विधि में किसी भी बदलाव के लिए काफी पता लगाया ईवीएस की संख्या और प्रकार को प्रभावित कर सकता है।

1.2) विश्लेषण के लिए नमूने की तैयारी

नोट: इस बिंदु पर से, चरणों तीन पैनलों में 14 मार्करों के लिए 12 नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक उच्च throughput प्रोटोकॉल समझाओ। हालांकि, एंटीबॉडी के अन्य संयोजन यहां इस्तेमाल किया जा सकता है; प्रोटोकॉल के हित के उन लोगों के लिए सुझाव दिया मार्करों प्रतिस्थापन द्वारा अन्य ईवी आबादी का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस और पिघलना (-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अगर) फ्रीजर से 12 नमूने निकालें।
  2. पिपेट सामग्री को ऊपर और नीचे कई बार मिश्रण करने के लिए। प्रत्येक नमूने से 320 μl निकालें और एक 96 अच्छी तरह से थाली की शीर्ष पंक्ति में जोड़ें।
    ध्यान दें: एक चौड़ाई समायोज्य बहु अच्छी तरह से pipet का इस और गधे भर में कई अन्य कदम के लिए अत्यंत उपयोगी हैप्र, एक ही बार में कई नमूने का विश्लेषण करने, खासकर जब।

1.3) धुंधला ईवी नमूने

  1. धुंधला करने से पहले, सकारात्मक संकेतों का कारण बन सकती है, जो समुच्चय को दूर करने के लिए सभी एंटीबॉडी (एबीएस) फिल्टर।
    1. अब मिश्रण के सभी फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया गया जुडा एंटीबॉडी 2 मिनट के लिए आरटी पर एक निश्चित कोण एकल गति अपकेंद्रित्र (~ 750 XG) का उपयोग कर अलग 0.22 केन्द्रापसारक फिल्टर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में तीन पैनलों में से प्रत्येक में इस्तेमाल किया जाएगा, या जब तक और कोई एंटीबॉडी तरल फिल्टर की सतह पर बनी हुई है। स्टोर अब दो सप्ताह के लिए फ्रिज में कॉकटेल लेकिन फिर से फिल्टर उपयोग करने से पहले हर बार।
  2. अच्छी तरह से पंक्ति 2 में प्रत्येक के लिए फ़िल्टर अब मिश्रण की उचित मात्रा में जोड़ें (उदाहरण के लिए, मैं हर अब के 2 μl साथ दाग रहे हैं पैनल में नमूने, तो फ़िल्टर्ड अब कॉकटेल के 12 μl की कुल दो पंक्ति के लिए अच्छी तरह से प्रति जोड़ा जाता है)। सुझाव थाली मानचित्र की एक रूपरेखा के लिए 1 बी चित्रा का संदर्भ लें। इन के अलावा दोहराएँअधिक पैनलों चलाए जा रहे हैं अगर नीचे पंक्तियों के लिए एस (यहाँ, अच्छी तरह से चार पंक्ति पैनल तृतीय कॉकटेल के 3 और 11 μl / पंक्ति को 8 μl / अच्छी तरह से पैनल द्वितीय कॉकटेल के जोड़ने, विशिष्ट पैनल जानकारी के लिए सामग्री की सूची को देखें)।
  3. मल्टीचैनल pipet का प्रयोग, ऊपर और नीचे पंक्ति 1 में पीपीपी के नमूने मिश्रण और 2. मिक्स ऊपर और नीचे पंक्ति में कुओं के लिए पंक्ति 1 में कुओं से 100 μl हस्तांतरण। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पंक्तियाँ 3 और 4 सेते पंक्ति 1 से 100 μl स्थानांतरित करने के बदले सुझावों और दोहराने।

1.4) धुलाई एमवी नमूने

  1. जैविक सुरक्षा कैबिनेट के लिए 96 अच्छी तरह से चार डिग्री सेल्सियस से थाली और हस्तांतरण निकालें। / अच्छी तरह पंक्तियों 6-8 पीबीएस के 220 μl जोड़ने के लिए, एक multichannel विंदुक का प्रयोग (/ rinsing दाग पीपीपी युक्त कुओं को धोने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)।
  2. एंटीबॉडी के तीन पैनलों, 12 एक्स 3 = 36 फिल्टर ट्यूबों के साथ, 12 नमूने लिए चौड़ाई समायोज्य मल्टीचैनल pipet (का उपयोग करते हुए पूर्व लेबल केन्द्रापसारक फिल्टर ट्यूबों के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक की सामग्री हस्तांतरण होगा) की जरूरत हो। एक ही सुझाव का प्रयोग, धोने पंक्तियों से पीबीएस के 200 μl को हटाने और पीपीपी बस हटा दिया गया था, जिसमें से इसी कुओं में जोड़ें।
  3. कुओं कुल्ला और पीपीपी पहले से जोड़ा गया है, जो करने के लिए एक ही फिल्टर करने के लिए कुल्ला समाधान हस्तांतरण करने के लिए ऊपर और नीचे मिक्स और। केन्द्रापसारक फिल्टर के बंद में सबसे ऊपर है। बदले सुझाव।
  4. सभी दाग ​​पीपीपी के नमूने केन्द्रापसारक फिल्टर करने के लिए उनके कुल्ला समाधान के साथ स्थानांतरित कर दिया गया है जब तक शेष दाग नमूनों के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  5. आरटी पर 3 मिनट के लिए 850 XG पर एक निश्चित रोटर सेंट्रीफ्यूज और स्पिन करने के लिए केन्द्रापसारक फिल्टर स्थानांतरण।
    नोट: कोई तरल फिल्टर टॉप पर बनी हुई है कि सुनिश्चित करें। Centrifugation के बाद, फिल्टर नहीं दिखाई द्रव परत शीर्ष पर शेष के साथ "" सूखी होने के लिए प्रकट करना चाहिए। संभावना नहीं है, जबकि कुछ पीपीपी के नमूने प्रभावी रूप से फिल्टर के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए एक लंबे समय तक centrifugation के समय की आवश्यकता हो सकती है।
  6. केन्द्रापसारक फिल्टर ट्यूबों निकालें और जैविक सुरक्षा कैबिनेट में लौटने।मल्टीचैनल pipet का प्रयोग, पीबीएस के 300 μl में फिल्टर के सबसे ऊपर resuspend। Resuspended सामग्री को तत्काल FCM के विश्लेषण के लिए ट्यूब लेबल पूर्व करने के लिए स्थानांतरण।
    नोट: यह नमूना नमूना विभिन्नता से बचने के लिए नमूने के बीच लगातार पिपेट सवार गड्ढों की शक्ति और संख्या रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। यह आदर्श अप और एक विशिष्ट मात्रा नीचे pipet के लिए प्रोग्राम किया गया है कि एक इलेक्ट्रॉनिक pipet का उपयोग किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, 280 μl) प्रत्येक नमूने के लिए टाइम्स (जैसे, आठ बार) का एक सटीक संख्या।

1.5) कोशिकामापी सेटअप

  1. FCM सॉफ्टवेयर खोलें। सेटअप प्रयोग (निर्माता के निर्देशों का पालन) साधन सेटअप मोती का उपयोग दैनिक साधन अंशांकन और सेटअप प्रदर्शन करने के लिए पहले।
  2. ईवी नमूने एक से अधिक एंटीबॉडी के साथ दाग किया गया है और यदि कई fluorochromes के रूप में निम्नानुसार मुआवजा मूल्यों की गणना, एक ही बार में मापा जा रहे हैं:
    1. पूर्व की मुआवजा मोतियों की दो बूँदें जोड़ें-labeled ट्यूब (प्रत्येक fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए एक ट्यूब) और एंटीबॉडी की सिफारिश की राशि जोड़ सकते हैं। बेदाग मुआवजा नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए एक और ट्यूब के लिए नकारात्मक मुआवजा मोतियों की दो बूँदें जोड़ें।
    2. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं पीबीएस के 400 μl में पीबीएस और resuspend से धो लें।
    3. साधन के साथ शामिल सॉफ्टवेयर प्रवाह का उपयोग करना, प्रत्येक मुआवजा ट्यूब चलाने के लिए और 5 दशक प्रवेश पैमाने पर लगभग 10 4 में प्रत्येक शिखर स्थान के लिए फ्लोरोसेंट voltages के समायोजित करें। प्रतिदीप्ति शिखर अन्य सभी चैनलों की तुलना में अपने स्वयं के फ्लोरोसेंट चैनल में उच्चतम (प्रतिभाशाली) है कि सुनिश्चित करने, और यदि आवश्यक हो तो फिर फ्लोरोसेंट मापदंडों के voltages के समायोजित करें। प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से सना हुआ कंप्यूटर अनुप्रयोग ट्यूब चलाने के लिए और ट्यूब अनुसार कम से कम 5000 की घटनाओं पर कब्जा।
    4. उसके बाद का चयन, "प्रयोग" टैब का चयन "मुआवजा," तो सभी नमूनों को मुआवजा मूल्यों को लागू करने के लिए "गणना मुआवजा" का चयन करें।
  3. 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर पीबीएस की एक ट्यूब चल रहा है, जबकि (यानी, सिर्फ घटना दर 5 घटनाओं / सेकंड से बढ़कर है, जिस पर वोल्टेज सीमा से नीचे) पृष्ठभूमि शोर के बहुमत को बहिष्कृत कि उच्चतम मूल्यों के FSC और एसएससी voltages के समायोजित करें।
  4. यदि आवश्यक हो तो पीबीएस में पतला 1.0 माइक्रोन मोती, - अगला, 0.2 माइक्रोन से युक्त एक ट्यूब चलाते हैं। एक एफसीएस एसएससी बनाम साजिश में, माइक्रोन माइक्रोन 0.2 के बीच और 1.0 घटनाओं पर कब्जा करने के लिए मनका आबादी के चारों ओर एक गेट आकर्षित। वैकल्पिक रूप से, एक एसएससी-एच हिस्टोग्राम में, 1.0 माइक्रोन मोतियों की तुलना में छोटे सभी घटनाओं में शामिल करने के लिए एक गेट आकर्षित।
  5. "लो" (लगभग 8-12 μl / मिनट) के लिए कोशिकामापी के प्रवाह की दर निर्धारित करें। मोती ट्यूब का उपयोग (या मोतियों की एक ज्ञात एकाग्रता युक्त अन्य ट्यूब) की पूर्व संध्या तक कोशिकामापी पर प्रवाह की दर डायल समायोजितNT दर लगभग 200 घटनाओं / सेकंड तक पहुँचता है। एक ही प्रवाह दर पर सभी नमूना ट्यूब पढ़ें और उस प्रवाह दरों रन के बीच लगातार रहना सुनिश्चित करने के लिए भविष्य प्रयोगों में एक ही मनका एकाग्रता का उपयोग करें।
  6. पीबीएस में पतला इंद्रधनुष फ्लोरोसेंट कणों की एक ट्यूब चलाएँ। 5000 की घटनाओं के मोल। FSC, एसएससी, और प्रत्येक रंग चैनल के लिए मतलब तीव्रता मूल्यों रिकार्ड। कि प्रतिदीप्ति तीव्रता के प्रयोगों के बीच लगातार रहना सुनिश्चित करने के लिए भविष्य प्रयोगों में voltages के समायोजित करने के लिए इन मूल्यों का प्रयोग करें।

1.6) नमूना पढ़ना

  1. "लो" (लगभग 8-12 μl / मिनट) के लिए कोशिकामापी के प्रवाह की दर निर्धारित है और वास्तव में एक या दो मिनट के लिए प्रत्येक नमूने चलाते हैं।
  2. पहले पढ़ने के बाद, एनपी-40 नीचे प्रत्येक नमूने, पिपेट अप करने के लिए और 10% से 20 μl जोड़ें, और में पाया सकारात्मक घटनाओं के घटाव के लिए अनुमति देने के लिए समय की एक ही राशि (या तो एक या दो मिनट) के लिए फिर से पढ़ने एक समान समय सीमा पर lysed नमूना।
    नोट: यह बेहद छोटा सा भूत हैनमूने एक pipet के बजाय एक भंवर का उपयोग कर मिलाया जा कि ortant। हमारे अनुभव में, vortexing के ईवी-नकल उतार सकारात्मक घटनाओं के लिए अग्रणी, कुछ एंटीबॉडी के आत्म-एकत्रीकरण का कारण बन सकता है।
  3. एक बार सभी नमूनों निर्यात एक अलग फाइल में सभी .fcs फ़ाइलों FCM के विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, पढ़ने के लिए दिया गया है।

1.7) डेटा विश्लेषण

  1. FCM के विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें। एक नया प्रयोग फ़ाइल में .fcs फ़ाइलों के सभी आयात करें।
  2. मोती केवल-ट्यूब खोलें। एसएससी-एक भूखंड बनाम FSC-ए में, चारों ओर 0.2 माइक्रोन और 1.0 माइक्रोन के बीच आकार सभी मोतियों एक गेट आकर्षित। इस ईवी गेट है। खींचें सभी नमूनों में जोड़ने के लिए।
  3. के रूप में नकारात्मक नियंत्रण lysed नमूने का उपयोग, प्रयोग प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के किनारे पर फाटक आकर्षित। प्रत्येक इसी गैर lysed नमूने की ईवी गेट में फ्लोरोसेंट फाटकों खींचें।
    नोट: इस बिंदु पर यह भी दोहरी फ्लोरोसेंट द्वि-पैरामीटर भूखंडों की जांच के लिए उपयोगी है। रॉकेट आकृतियों मेंमार्करों असंबंधित प्रकार की कोशिकाओं पर निवास करने के लिए जाना जाता है, खासकर अगर डबल सकारात्मक वृत्त का चतुर्थ भाग एकत्रीकरण या अन्य पुटिका-नकल उतार घटनाओं से विरूपण साक्ष्य का संकेत हो सकता है,, (8 चित्रा देखें)।
  4. प्रत्येक फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए, गैर lysed नमूने में घटनाओं की संख्या से lysed नमूने में घटनाओं की संख्या घटाना। वैकल्पिक रूप से,% सकारात्मक मूल्यों को प्राप्त करने के लिए गैर-lysed ईवी फाटक के भीतर ईवीएस की कुल संख्या से इस संख्या में विभाजित करते हैं।

2. पद्धति B: मोती विधि

ईवीएस का रक्त नमूना / अलगाव की 2.1) प्रसंस्करण

  1. (धारा 1.1) विधि ए में वर्णित रक्त प्रसंस्करण विधि का संदर्भ लें।

2.2) विश्लेषण के लिए नमूने की तैयारी

  1. अगर वांछित, exosomes और microvesicles में पीपीपी या ultracentrifuged ईवीएस fractionate। 0.22 केन्द्रापसारक फिल्टर करने के लिए पीपीपी या ultracentrifuged ईवीएस के 250 μl जोड़ें और 750 एक्स पर एक निश्चित रोटर सेंट्रीफ्यूज और स्पिन करने के लिए स्थानांतरणआरटी पर 2 मिनट के लिए जी।
    नोट: कोई तरल फिल्टर टॉप पर बनी हुई है कि सुनिश्चित करें। Centrifugation के बाद, फिल्टर नहीं दिखाई द्रव परत शीर्ष पर शेष के साथ "" सूखी होने के लिए प्रकट करना चाहिए। संभावना नहीं है, जबकि कुछ नमूने द्रव को प्रभावी ढंग से फिल्टर के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए एक थोड़ा अब centrifugation के समय की आवश्यकता हो सकती है।
  2. 2 मिलीलीटर में uncoated 6 माइक्रोन polystyrene मोती (जैसे, नकारात्मक एबीसी मोती) RPMI मीडिया के साथ 2x, और resuspend धो लें। प्रत्येक FACS ट्यूब 6000 मोती जोड़ें। नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब, मोतियों के लिए अकेले RPMI मीडिया के 400 μl जोड़ें। अन्य सभी ट्यूबों के लिए, पीपीपी या ultracentrifuged ईवीएस (या उनके अंशों) के 200 μl और RPMI मीडिया के 200 μl जोड़ें।
  3. मीडिया के साथ 400 μl करने के लिए सभी ट्यूबों के अंतिम मात्रा समायोजित करें और एक प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  4. अगली सुबह, मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ मोती धो लें। सतह पर तैरनेवाला बंद aspirate।
  5. 4 & पर तीन घंटे के लिए मीडिया (400 μl) में 5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ ब्लॉक# 176; एक प्रकार के बरतन पर सी।
  6. मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ मोती धो लें। मध्यम के 100 μl में महाप्राण और resuspend गोली।

2.3) धुंधला ईवी नमूने

  1. सभी एंटीबॉडी फ़िल्टर। विधि एक में इस्तेमाल एक ही एंटीबॉडी पैनलों का प्रयोग करें, या अगर वांछित है, जब तक उनके fluorochromes एक दूसरे के साथ संगत कर रहे हैं के रूप में एंटीबॉडी का एक अलग संयोजन बनाएँ।
  2. कम्बाइन सभी एंटीबॉडी 0.22 माइक्रोन केन्द्रापसारक फिल्टर ट्यूब में एक पैनल में इस्तेमाल किया जाएगा। 2 मिनट के लिए या अटल बिहारी मिश्रण के सभी जब तक एक निश्चित कोण एकल गति सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर अपकेंद्रित्र फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया गया है और एंटीबॉडी तरल फिल्टर की सतह पर बनी हुई है।
  3. सभी ट्यूबों के लिए फ़िल्टर एंटीबॉडी कॉकटेल का उचित मात्रा में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. प्रवाह पर मीडिया के 400 μl में मीडिया, resuspend के 2 मिलीलीटर के साथ मोती धो लें और तुरंत चलाने के (या एक ही दिन के भीतर)।

2.4) सेटअप और नमूना पढ़ना कोशिकामापी

  1. FCM सॉफ्टवेयर खोलें। सेटअप प्रयोग (निर्माता के निर्देशों का पालन) साधन सेटअप मोती का उपयोग दैनिक साधन अंशांकन और सेटअप प्रदर्शन करने के लिए पहले।
  2. ईवी नमूने एक से अधिक एंटीबॉडी के साथ दाग किया गया है और यदि कई fluorochromes के रूप में निम्नानुसार मुआवजा मूल्यों की गणना, एक ही बार में मापा जा रहे हैं:
    1. ट्यूब लेबल पूर्व को मुआवजा मोतियों की दो बूँदें (प्रत्येक fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए एक ट्यूब) जोड़ें और एंटीबॉडी की सिफारिश की राशि जोड़ सकते हैं। बेदाग मुआवजा नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए एक और ट्यूब के लिए नकारात्मक मुआवजा मोतियों की दो बूँदें जोड़ें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं पीबीएस के 400 μl में पीबीएस और resuspend से धो लें।
    2. FCM के सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रत्येक मुआवजा ट्यूब चलाने के लिए और 5 दशक प्रवेश पैमाने पर लगभग 10 4 में प्रत्येक शिखर स्थान के लिए फ्लोरोसेंट voltages के समायोजित करें। प्रतिदीप्ति शिखर अन्य सभी चैनलों की तुलना में अपने स्वयं के फ्लोरोसेंट चैनल में (प्रतिभाशाली) सबसे ज्यादा है कि सुनिश्चित करने, औरयदि आवश्यक हो तो फिर फ्लोरोसेंट मापदंडों के voltages के समायोजित करें। प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से सना हुआ कंप्यूटर अनुप्रयोग ट्यूब चलाने के लिए और ट्यूब अनुसार कम से कम 5000 की घटनाओं पर कब्जा।
    3. टैब का चयन करें "प्रयोग," फिर "मुआवजा," तो "गणना मुआवजा" सभी नमूनों को मुआवजा मूल्यों को लागू करने के लिए।
  3. पैमाने लॉग इन करें और प्रत्येक के लिए कोशिकामापी (एफएससी = 200 और एसएससी = 200) द्वारा अनुमति निम्नतम थ्रेसहोल्ड का चयन करने के FSC और एसएससी वोल्टेज पैरामीटर बदलें।
  4. स्वेटर मोती जनसंख्या पर चलाने के नमूने, गेट और इस फाटक में 2000 की घटनाओं के अधिग्रहण। निर्यात .fcs फ़ाइलें।
  5. फाइलों .fcs विश्लेषण करने के लिए FCM के विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। स्वेटर मनकों पर गेट। प्रत्येक fluorochrome के लिए ज्यामितीय मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) की गणना और नकारात्मक नियंत्रण के एमएफआई के साथ तुलना करें।

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Representative Results

चित्रा 1 अलगाव और मनका आधारित पद्धति या व्यक्ति का पता लगाने की विधि का उपयोग ईवीएस का पता लगाने के लिए समग्र प्रसंस्करण योजना की रूपरेखा। FCM बड़ा ईवीएस विश्लेषण करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन सबसे cytometers अलग-अलग exosomes के रूप में कणों के रूप में छोटे पता लगाने में सक्षम नहीं हैं, का उपयोग कर ईवीएस की व्यक्तिगत पहचान। एक मनका-आधारित दृष्टिकोण तालिका 1 में उल्लिखित के रूप में छोटे ईवीएस, हालांकि, इस पद्धति का उपयोग के साथ जुड़े कमियां हैं पता लगाया जा करने की अनुमति देता है। आम तौर पर, के साथ (या एक sucrose ढाल विभाजन की प्रक्रिया के अलावा बिना) ultracentrifugation का उपयोग कर ईवीएस के अलगाव है ईवीएस कार्यात्मक assays के लिए आवश्यक हैं जब सिफारिश की। Ultracentrifugation सीरम प्रोटीन और कार्यात्मक प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, जो प्लाज्मा, से अन्य घुलनशील contaminants के सहित अशुद्धियों को हटाता है। हालांकि, ultracentrifugation समय लगता है और ईवी मात्रा और गुणवत्ता 12 को बदल सकता है।

"> दो पता लगाने assays के लिए परिणाम की उम्मीद आंकड़े 2-3 में चित्रित कर रहे हैं। इसी गैर lysed नमूना के लिए फाटकों (शीर्ष पंक्ति सेट करने के लिए प्रयोग किया जाता है व्यक्ति का पता लगाने की परख, lysed नियंत्रण (नीचे पंक्ति, चित्रा 2) के लिए, चित्रा 2)। घटनाओं के बहुमत ईवी फाटक के भीतर गिर चाहिए। चक्र फाटक डबल सकारात्मक घटनाओं का खुलासा नहीं करना चाहिए तुलना में दो मार्करों सामान्य रूप से एक ही सेल पर नहीं मिला रहे हैं। चित्रा 2 में सही biparameter भूखंडों मार्करों CD108a और CD235a दिखाने , कोशिकाओं पर एक समय में होना करने के लिए जाना जाता है दो लाल रक्त कोशिका मार्करों जो कर रहे हैं। यहाँ, ईवीएस पर, उम्मीद के रूप में सकारात्मक घटनाओं के आधे से अधिक, दोनों मार्करों के लिए सकारात्मक रहे हैं। उसी तरह, जाना जाता कोशिका की सतह मार्कर एक ही सेल पर निवास करने के लिए करना चाहिए ईवीएस पर डबल सकारात्मकता के समान पैटर्न दिखा। केंद्र biparameter भूखंडों की कोशिकाओं पर एक समय में होना करने के लिए नहीं जाना जाता है कि दो मार्करों के ईवी अभिव्यक्ति दिखा। CD235a के इस विश्लेषण में (एक लाल Blooडी सेल मार्कर) और CD41a (एक प्लेटलेट मार्कर), ईवीएस वे विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से बाद में आने की उम्मीद है, जो अलग, अलग, सकारात्मक आबादी, दिखाते हैं। Lysed करते हैं, सकारात्मक घटनाओं गायब हो जाना चाहिए। सामान्य में, सेल के बाद शेष किसी भी सकारात्मक घटनाओं गैर पुटिका कणों, समुच्चय, और / या डिटर्जेंट प्रतिरोधी ईवीएस से आने के संकेत की उपस्थिति का संकेत। मनका-आधारित पहचान पद्धति का उपयोग कर परिणाम की उम्मीद 3 से पता चलता है। व्यक्ति का पता लगाने की विधि के विपरीत, इन आंकड़ों / द्वि-पैरामीटर भूखंडों में नहीं देखा जाना चाहिए नहीं कर सकते। ऊपरी डॉट भूखंडों में, सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के बीच कोई जुदाई मौजूद हैं, और घटनाओं है कि वे सामान्य रूप से होने के कारण ईवीएस के दोनों प्रकार के एक करने के लिए बाध्य होगा तथ्य यह है कि एक ही प्रकार की कोशिकाओं पर नहीं पाए जाते हैं, भले ही डबल सकारात्मक quadrants में दिखाई देते हैं एकल मनका। मनका-आधारित पहचान पद्धति के लिए, डेटा सबसे अच्छा (डॉट भूखंडों के नीचे दर्शाया) नकारात्मक नियंत्रण के साथ हिस्टोग्राम ओवरले का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं। सकारात्मकता मैंएक मार्कर के एमएफआई (प्रतिदीप्ति तीव्रता मतलब है) का उपयोग करके मापा और नकारात्मक नियंत्रण के साथ सीधे तुलना में है। एक नमूना प्रश्न में मार्कर के लिए सकारात्मक है, तो इसकी एमएफआई नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में अधिक हो जाएगा। मनका विधि के लिए नकारात्मक नियंत्रण बस एक ही एंटीबॉडी के साथ दाग और EV लिपटे मोतियों के साथ धोया गया है जो बीएसए के साथ बंद मोती (कोई ईवीएस) जोड़ा गया है। दो तरीकों का उपयोग कर परिणाम की उम्मीद की तुलना में चित्रा 4 में देखा जा सकता है।

ठीक से ईवी phenotypes के आकलन करने के लिए व्यक्ति का पता लगाने की परख की क्षमता पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से अब-सकारात्मक घटनाओं को अलग करने के लिए सही gating पर काफी निर्भर करता है। इसलिए, यह सबसे उचित mimics / किसी नमूने के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति भविष्यवाणी की है कि एक नकारात्मक नियंत्रण का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। सना ईवीएस पढ़ने से पहले धोया नहीं कर रहे हैं, आमतौर पर (जैसे, आइसोटाइप) सही पृष्ठभूमि fluorescenc की भविष्यवाणी करने में विफल नकारात्मक नियंत्रण का इस्तेमाल कियासभी मार्करों के लिए ई (चित्रा 5A)। वाशिंग एक विकल्प नहीं है अगर इन मामलों में, lysed नमूनों पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की भविष्यवाणी के लिए बेहतर काम करने के लिए जाते हैं। सना ईवीएस पढ़ने से पहले धोया जाता है हालांकि, जब एक नमूना (चित्रा 5A) की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की भविष्यवाणी के लिए अच्छी तरह से काम नकारात्मक नियंत्रण (आइसोटाइप और lysed नमूने) दोनों, (इस मामले में, केन्द्रापसारक निस्पंदन का उपयोग)। लेकिन उसे यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि वे (जैसे, डिटर्जेंट प्रतिरोधी, गैर पुटिका से संबंधित घटनाओं और / या समुच्चय की उपस्थिति) एक नमूना के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करते हैं, क्योंकि सभी नकारात्मक नियंत्रण "काम" lysed नियंत्रण पसंद कर रहे हैं कि जब तक कि गैर ईवी सकारात्मक संकेतों में परिणाम और अनुचित तरीके से अब मायने रखता बढ़ सकता है। दाग नमूना मिलान कर निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ दाग ही नमूना की तुलना में कम सकारात्मक घटनाओं है जहां चित्रा 5 ब, के रूप में दिखाया इसके अलावा, निर्धारण नियंत्रण कभी कभी, यहाँ तक कि धोया नमूने में, अविश्वसनीय हो सकता है। अनबाउंड एंटीबॉडी की पूरी तरह से हटाने के बिना, कुछ ईवी मार्करों के FCM डॉट भूखंडों dimly फ्लोरोसेंट कणों के बादल उनके अत्यधिक फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि से पृथक रूप में प्रदर्शित होने, (चित्रा 6, शीर्ष साजिश) की व्याख्या करने के लिए लगभग असंभव है। पृष्ठभूमि और सकारात्मक मार्कर संकेतों के बीच अलगाव केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग दाग नमूने बढ़ाता वॉशिंग (चित्रा 6, नीचे साजिश); हालांकि, छोटे ईवीएस और exosomes फिल्टर के छिद्रों के माध्यम से खो दिया जा सकता है।

एक डिटर्जेंट सेल कदम का उपयोग प्रतिरक्षा परिसरों से सकारात्मक, पुटिका-नकल उतार घटनाओं से पता चलता है और प्रोटीन 21 समुच्चय। पीपीपी सेल के साथ गायब नहीं है कि सकारात्मक घटनाओं का सामना, व्यक्ति का पता लगाने का उपयोग कर विश्लेषण किया गया है, जब एक काफी अक्सर घटना है। ये डिटर्जेंट प्रतिरोधी घटनाओं अक्सर दोनों एकल पैरामीटर और biparameter भूखंडों में के रूप में संदिग्ध, अत्यधिक फ्लोरोसेंट विकर्ण संकेतों दिखाई देते हैं (चित्रा7)। चिकित्सकीय, इन प्रोटीन परिसरों और / या अघुलनशील प्रतिरक्षा परिसरों ऐसे संधिशोथ 28, नेफ्रोटिक सिंड्रोम 19, और प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष 29 के रूप में विभिन्न रोगों के 21 से पीड़ित रोगियों में अधिक प्रचलित हैं। इसलिए, अनुसंधान के उद्देश्य पर निर्भर करता है, एक में शामिल हैं या विकर्ण संकेतों विशेष रूप से सेल अभिकर्मक के अलावा (चित्रा 8) के बाद, नमूने vortexing से है फार्म कर सकते हैं analysis.Another जिस तरह से उन्हें हटाने के लिए इच्छा हो सकती है। नमूने हमेशा समुच्चय के गठन को रोकने के लिए pipet से नीचे मिलाया जाना चाहिए।

चित्र 1
चित्रा 1: अलगाव और मनका आधारित पद्धति या व्यक्ति का पता लगाने की विधि का उपयोग ईवीएस का पता लगाने के लिए कुल मिलाकर प्रसंस्करण योजना। (ए) पूरे रक्त पहले पीपीपी में कार्रवाई की है। सेपीपीपी पृथक ईवीएस उपज के लिए ultracentrifugation का उपयोग कर आगे की कार्रवाई की या व्यक्ति का पता लगाने या मनका आधारित assays में है, के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, या तो फिर से। व्यक्ति का पता लगाने की विधि का उपयोग उच्च throughput नमूना विश्लेषण के लिए सुझाव दिया प्लेट नक्शा (बी) को रेखांकित करें। क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र 2
चित्रा 2:। व्यक्तिगत जांच के लिए अपेक्षित परिणाम डॉट भूखंडों प्रवाह cytometry lysed और unlysed ईवी नमूने के प्रतिनिधि धुंधला दिखा। मान सकारात्मक घटनाओं का प्रतिशत दिखाते हैं। घटनाओं के बहुमत ईवी फाटक के भीतर गिर जाते हैं। सही biparameter भूखंडों में दिखाया घटनाक्रम बाईं तरफ FSC / एसएससी ईवी फाटकों के भीतर हैं। lysed नमूना (नीचे पंक्ति) ईए के लिए फ्लोरोसेंट आधारित फाटक सेट करने के लिए प्रयोग किया जाता हैCH (गैर lysed) नमूना इसी। तुलना में दो मार्करों सामान्य रूप से एक ही सेल पर नहीं पाए जाते हैं जब ट्रैक्टर फाटकों डबल सकारात्मक घटनाओं का खुलासा नहीं करना चाहिए। इधर, biparameter CD235a और CD41a साजिश लाल रक्त कोशिका मार्करों व्यक्त ईवीएस और उन व्यक्त प्लेटलेट सेल मार्कर के बीच एक स्पष्ट जुदाई से पता चलता है। इसी तरह, एक ही सेल पर निवास करने के लिए जाना जाता है कोशिका की सतह मार्करों ईवीएस पर डबल सकारात्मकता के समान पैटर्न दिखाना चाहिए। सही biparameter साजिश CD235a पॉजिटिव ईवीएस की आधी से अधिक भी माध्यमिक लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) मार्कर, CD108a के लिए सकारात्मक रहे हैं कि पता चलता है। Lysed करते हैं, सकारात्मक घटनाओं गायब हो जाना चाहिए। सेल के बाद शेष सकारात्मक घटनाओं गैर पुटिका या डिटर्जेंट प्रतिरोधी कणों और / या समुच्चय से आने के संकेत की उपस्थिति का संकेत।

चित्र तीन
चित्रा 3: मनका-आधारित पता लगाने का उपयोग कर परिणाम की उम्मीदविधि। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है जो बीएसए, साथ अवरुद्ध मोतियों की तुलना में डॉट भूखंडों, मोती के लिए युग्मित ईवीएस के प्रतिनिधि धुंधला दिखाने के प्रवाह cytometry। मान सकारात्मक घटनाओं का प्रतिशत दिखाते हैं। सही biparameter भूखंडों में दिखाया घटनाक्रम बाईं तरफ FSC / एसएससी मोती फाटक के भीतर हैं। मोती आधारित पहचान पद्धति के लिए, डेटा सबसे अच्छा (डॉट भूखंडों के नीचे दर्शाया) नकारात्मक नियंत्रण के साथ हिस्टोग्राम ओवरले का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं। सकारात्मकता एक मार्कर के एमएफआई (प्रतिदीप्ति तीव्रता मतलब है) का उपयोग करके मापा और नकारात्मक नियंत्रण के साथ सीधे तुलना में है।

चित्रा 4
चित्रा 4:। मोतियों बनाम व्यक्ति का पता लगाने का उपयोग कर परिणाम की उम्मीद की तुलना व्यक्ति का पता लगाने (नीचे पंक्ति) का उपयोग का विश्लेषण करने ईवीएस की तुलना में cytometry, भूखंडों मोती (शीर्ष पंक्ति) के लिए युग्मित ईवीएस के प्रतिनिधि धुंधला दिखाने डॉट प्रवाह। आयोजनभूखंडों पर छोड़ दिया है FSC / एसएससी मोती फाटक के भीतर हैं biparameter सही में दिखाया गया है।

चित्रा 5
चित्रा 5:। व्यक्ति का पता लगाने के विश्लेषण में विभिन्न नकारात्मक नियंत्रण की तुलना मान सकारात्मक घटनाओं का प्रतिशत दिखाते हैं। दिखाया घटनाक्रम FSC / एसएससी ईवी गेट के भीतर हैं। मैला बनाम में नकारात्मक नियंत्रण (ए) तुलना नमूने धोया। निर्धारण या lysed नियंत्रण एक पूरी तरह से सना हुआ नमूना (नीचे पंक्ति) में दो अलग-अलग मार्करों भर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का उचित संकेत प्रदान करने की क्षमता के लिए मूल्यांकन किया गया। प्रत्येक मार्कर के लिए गेट्स के नीचे पंक्तियों के लिए नकल तो lysed नमूना (शीर्ष पंक्ति) और का उपयोग किया गया। निर्धारण नियंत्रण नमूना दाग वाई की तुलना में अधिक सकारात्मक घटनाओं के होने के साथ दाग एक नमूना की धोया नमूने के बाद दाग निस्पंदन का उपयोग कर धोया गया। (बी) उदाहरणवास्तविक एंटीबॉडी वें।

चित्रा 6
चित्रा 6:। व्यक्ति का पता लगाने में बाद के दाग धोने के प्रभाव दिखाने प्रतिशत और सकारात्मक घटनाओं की संख्या मूल्यों। दिखाया घटनाक्रम FSC / एसएससी ईवी गेट के भीतर हैं। प्रत्येक नमूने के लिए गेट्स (; धोया नमूने बनाम मैला में गेट-स्थापना के लिए पिछले आंकड़ा का उल्लेख नहीं दिखाया गया है) प्रत्येक नमूने की lysed समकक्ष का उपयोग किया गया। उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति नकारात्मक घटनाओं मुश्किल (ऊपर साजिश) से सकारात्मक भेद बनाता है। धोया जब अनबाउंड फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को हटा रहे हैं और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (नीचे साजिश) कम हो जाता है, के रूप में हालांकि, सकारात्मक जनसंख्या पता चला है।

चित्रा 7
चित्रा 7: डिटर्जेंट सेल गैर ईवी एस की उपस्थिति की पुष्टिदिखाया ignals। घटनाक्रम FSC / एस सी सी ईवी गेट के भीतर हैं। मान सकारात्मक घटनाओं का प्रतिशत दिखाते हैं। सना ईवी नमूने से पहले (बाएं स्तंभ) पढ़ रहे थे और डिटर्जेंट (सही कॉलम) के अलावा के बाद प्रतिरक्षा परिसरों और अन्य गैर-ईवी से संबंधित घटनाओं की वजह से सकारात्मक संकेतों की पहचान करने के लिए।

आंकड़ा 8
चित्रा 8: vortexing गैर ईवी संकेतों की उपस्थिति का कारण बनता दिखाया घटनाक्रम FSC / एस सी सी ईवी गेट के भीतर हैं।। मान सकारात्मक घटनाओं का प्रतिशत दिखाते हैं। सना ईवी नमूने से पहले (बाएं स्तंभ) और डिटर्जेंट (सही कॉलम) के अलावा के बाद पढ़ रहे थे। नमूने मिश्रण करने के लिए एक भंवर का प्रयोग ईवी-नकल उतार, विकर्ण आबादी (शीर्ष पंक्ति) के लिए फार्म का कारण बन सकती है। धीरे से ऊपर और एक pipet का उपयोग कर नीचे मिश्रित करते हैं, हालांकि, इन आबादियों के गठन के नीचे (पंक्ति) से बचा जा सकता है। Vortexing यह, घास का मैदान कुछ नमूनों में एकत्रीकरण पैदा कर सकता है, के रूप में मिश्रण के लिए अनुशंसित नहीं हैडिंग विकर्ण दिखने के लिए, सकारात्मक आबादी। सामान्य में, एक सकारात्मक फाटक के भीतर घटना संख्या lysing बाद में वृद्धि नहीं करनी चाहिए।

मनका-आधारित पता लगाने व्यक्तिगत जांच
ईवी आकार <100 एनएम के लिए ही की सिफारिश की > 100 एनएम के लिए सिफारिश की है केवल
टाइम रातोंरात ऊष्मायन की आवश्यकता है एक दिन <में पूरा कर सकते हैं
संवेदनशीलता क्लस्टर का पता लगाने एकल कण का पता लगाने
परिणाम गुणात्मक मात्रात्मक
धुलाई सरल, मानक centrifugation केन्द्रापसारक फिल्टर की आवश्यकता है
नकारात्मक नियंत्रण बीएसए लिपटे मोतियों lysed नमूने

तालिका 1: पेशेवरों और दोनों तरीकों का पता लगाने के विपक्ष।

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Discussion

अलगाव, उपचार और ईवीएस के विश्लेषण के लिए दो अलग अलग प्रोटोकॉल एक व्यक्ति का पता लगाने या मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग, प्रस्तुत किए गए। उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि का चयन हमेशा सीधा नहीं है और ब्याज की अलग-अलग उप-जनसंख्या के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परीक्षण किया जा रहा नमूने की एक समझ की आवश्यकता है। सबसे उपयुक्त विधि का चयन करते समय इसके अलावा, अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया कोशिकामापी की संवेदनशीलता से विचार किया जाना चाहिए। बार बार नहीं बल्कि, तरीकों का एक संयोजन अकेले किसी भी एक विधि की तुलना में एक नमूना के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करता है, उपयोग करने के लिए कोई एक सबसे अच्छा प्रोटोकॉल नहीं है। आदर्श रूप में, कई अलग अलग अलगाव और पता लगाने की तकनीक विशिष्ट ईवी जनसंख्या अध्ययन किया जा रहा करने के लिए सम्मान के साथ प्रदर्शन कोशिकामापी विचार व्यक्ति में ले जाता है कि एक सिलवाया प्रोटोकॉल विकसित करने के क्रम में पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए। वैकल्पिक अलगाव तकनीक ultracentrifugation, सूक्रोज घनत्व विभाजन, immunomagnetic बी में शामिलEAD जुदाई, क्रोमैटोग्राफी, और आत्मीयता शुद्धि 12, वैकल्पिक तरीकों का पता लगाने स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी, गतिशील प्रकाश बिखरने, और पश्चिमी 8 सोख्ता शामिल हुए। विभिन्न तकनीकों के संयोजन से, यहाँ प्रस्तुत तरीकों हित के विभिन्न ईवी आबादी के अध्ययन के लिए सबसे उपयुक्त प्रोटोकॉल बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

सामान्य में, FCM बड़ा ईवीएस विश्लेषण करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है लेकिन ईवीएस छोटे मिल के रूप में संवेदनशीलता खो देता का उपयोग कर ईवीएस के व्यक्ति का पता लगाने। व्यक्ति का पता लगाने बड़ा ईवीएस का पता लगाने में और अधिक सुसंगत है, मनका-आधारित पता लगाने बड़ा ईवीएस और exosomes के लिए अधिक संवेदनशील पता लगाने में कम संवेदनशील है। बड़ा ईवीएस के बाद दाग छानने का काम के माध्यम से आसानी से धोया और FCM के माध्यम से अकेले का पता लगाया जा सकता है। छोटे ईवीएस और exosomes, दूसरे हाथ पर, FCM का उपयोग कर अच्छी तरह से व्यक्तिगत रूप से पता लगाया है और बहुत अधिक मुश्किल के बाद धुंधला धोने के लिए नहीं कर रहे हैं। मनका-कब्जाप्रोटोकॉल ईवीएस आसानी से धोया जा करने के लिए और कई ईवीएस FCM के द्वारा detectable बड़ा सकारात्मक संकेतों बनाने के लिए एक साथ मापा जा करने की इजाजत दी है, इन मुद्दों पर दोनों निराकरण करता है। हालांकि, 1 टेबल में उल्लिखित के रूप में, इस पद्धति का उपयोग के साथ जुड़े कमियां हैं।

एक कम संवेदनशील कोशिकामापी के साथ काम करते हैं, तो व्यक्ति का पता लगाने के लिए क्षमता सीमित है। ईवी विश्लेषण करने से पहले, कोशिकामापी की संवेदनशीलता को 0.1-1.0 माइक्रोन से लेकर मनका आकार के एक मिश्रण का उपयोग निर्धारित किया जाना चाहिए। कोशिकामापी की विफलता मनका आधारित प्रोटोकॉल के उपयोग की जरूरत होगी 1.0 माइक्रोन से नीचे कणों की एक बहुमत का पता लगाने के लिए। अत्यधिक व्यक्त मार्करों आसानी से या तो प्रोटोकॉल का उपयोग पता चला रहे हैं। Fluorochrome की चमक, नमूना के EV: मनका आर दुर्लभ आबादी मनका कब्जा प्रोटोकॉल के बजाय एक कण का पता लगाने प्रोटोकॉल का उपयोग पता लगाने के लिए कभी कभी आसान कर रहे हैं, हालांकि, इस तरह के रूप में चर के आधार पर भिन्न हो सकते हैंatio, और दुर्लभ कोशिका की सतह मार्कर असर ईवी का आकार। एक भी कण पर कई मार्करों की जांच व्यक्ति का पता लगाने की विधि का उपयोग जरूरी है। मनका आधारित पद्धति व्यक्ति ईवी का पता लगाने में सक्षम नहीं है। व्यक्तिगत पहचान पद्धति अधिक मात्रात्मक डेटा दे देंगे, जबकि इसलिए, मनका-आधारित प्रोटोकॉल, प्रकृति में और अधिक गुणात्मक हैं कि डेटा निकलेगा।

ईवीएस बहाव के अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हैं जब भी अतिरिक्त अलगाव की तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए। कार्यात्मक assays में इस्तेमाल किया ईवीएस प्लाज्मा में घुलनशील सीरम प्रोटीन कार्यात्मक प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, के बाद से 3 कदम अंतर centrifugation के प्रोटोकॉल का उपयोग ultracentrifuged किया जाना चाहिए। इस जोड़े कदम ईवी गुणवत्ता और मात्रा को प्रभावित कर सकता है के बाद से ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए, तथापि, ultracentrifugation वजह से कणों 12 पर दी उच्च बलों के लिए अनुशंसित नहीं है।

व्यक्ति का पता लगाने प्रोटोकॉल एस में शामिलसहित उच्च throughput परीक्षण के लिए अनुकूलित everal महत्वपूर्ण कदम,: अटल बिहारी समुच्चय की वजह से सकारात्मक घटनाओं का त्वरित और प्रभावी हटाने के लिए केन्द्रापसारक फिल्टर का 1) कार्यान्वयन, 2) ultracentrifugation या सूक्रोज ढाल विभाजन करने के लिए एक और अधिक व्यावहारिक विकल्प के रूप में फिल्टर का उपयोग ईवी नमूनों के बाद धुंधला हो जाना, और न केवल गैर-ईवीएस की वजह से सकारात्मक घटनाओं से पता चलता है, लेकिन पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का एक अच्छा सन्निकटन ड्राइंग के लिए नकारात्मक आबादी से सकारात्मक भेद करने के लिए प्रदान करता है जो एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में डिटर्जेंट सेल के 3) के उपयोग से अनबाउंड अब धोने के लिए फाटकों। व्यक्ति का पता लगाने प्रोटोकॉल यह एक ही दिन में किया जा सकता है के रूप में मनका आधारित पद्धति एक रात ऊष्मायन की आवश्यकता है, जबकि नमूनों की एक बड़ी संख्या है, परीक्षण की जरूरत है, जब भी सिफारिश की है।

प्रत्येक प्रोटोकॉल में नकारात्मक नियंत्रण अलग फायदे और प्रयोग किया जाता है, जो पहचान पद्धति के आधार पर नुकसान है। मनका-आधारित का उपयोग करने का एक लाभssay एक ही मोनोक्लोनल एंटीबॉडी नकारात्मक और सकारात्मक ट्यूबों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक ही नकारात्मक नियंत्रण सभी नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। व्यक्ति का पता लगाने की विधि, दूसरे हाथ पर, प्रत्येक परीक्षण नमूने के लिए पढ़ा जा अलग नियंत्रण की आवश्यकता है। व्यक्ति का पता लगाने के प्रोटोकॉल के द्वारा प्रयोग किया नकारात्मक नियंत्रण अतिरिक्त एंटीबॉडी का उपयोग / खपत की आवश्यकता नहीं है, लेकिन प्रत्येक ट्यूब lysing एजेंट के अलावा के बाद एक दूसरी बार पढ़ा जा आवश्यकता होती है कि जो lysed नमूने, का उपयोग करता है। lysed नियंत्रण ऐसे प्रतिरक्षा परिसरों 21 के रूप में गैर पुटिका से संबंधित घटनाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि सकारात्मक संकेत के अनुपात की पहचान करने में सक्षम होने का जोड़ा लाभ है। मनका आधारित परख सकारात्मक सच ईवीएस से उत्पन्न होने का संकेत है और गैर-पुटिकाओं से उत्पन्न होने वाले उन लोगों के बीच इस क्षमता todistinguish नहीं है।

तकनीक की सीमाएं

ईवीएस के अलगाव के लिए कोई मानकीकृत विधि है, वहीं अंतरcentrifugation के ईवी शोधकर्ताओं के बीच एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है। यहाँ वर्णित अंतर centrifugation के विधि 10-30 मिनट के लिए 10,000-13,000 XG के बीच एक दूसरे centrifugation द्वारा पीछा किया, जो आम तौर पर 10-20 मिनट कोशिकाओं को दूर करने के लिए 1,200-1,500 XG के बीच एक प्रारंभिक centrifugation की आवश्यकता होती है जो पीपीपी, अलग-थलग करने के लिए आम प्रोटोकॉल पर आधारित है प्लेटलेट्स 35 को हटा दें। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल 10 मिनट के लिए 13,000 XG पर एक centrifugation द्वारा पीछा किया 10 मिनट के लिए 1500 XG पर एक centrifugation के उपयोग करता है। 25,000-100,000 XG के उच्च बलों आम तौर पर ईवीएस गोली के लिए आवश्यक हैं, वहीं बड़े ईवीएस के कुछ हम प्रस्तुत किया है अंतर centrifugation के प्रोटोकॉल के साथ हटाया जा सकता है।

100,000 XG पर एक घंटे ultracentrifugation के साथ खो रहे हैं FCM के द्वारा पता लगाया ईवीएस के 90% अप करने के लिए (डेटा) नहीं दिखाया। इस पर प्रतिकूल नमूना की संरचना को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में लंबे समय तक centrifugation के टाइम्स, सावधानी, हालांकि माना जाना चाहिए। अतिरिक्त संसाधन च की जरूरत हैया लक्षण वर्णन अध्ययन, छानने का काम आगे कण आकार के आधार पर नमूने fractionate करने के लिए (धुंधला) से पहले दो कदम centrifugation के बाद किया जा सकता है। अल्ट्रा centrifugation के लिए इसी प्रकार, निस्पंदन सकारात्मक मार्कर घटनाओं के ऊपर से 50% का नुकसान में परिणाम कर सकते हैं और FCM के द्वारा पता लगाया कुल कणों के 90% अप करने के लिए (डेटा) नहीं दिखाया। संकेत करने वाली शोर अनुपात में वृद्धि के स्पष्ट लाभ की है जबकि किसी भी धोने या अलगाव पद्धति पर विचार करते हैं, तो छोटे ईवीएस के नुकसान के एक महत्वपूर्ण सीमा का प्रतिनिधित्व करता है।

अंत में, थक्कारोधी प्रयोग किया जाता है (जैसे, हेपरिन, एसीडी, ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), आदि) रक्त संग्रह के दौरान ईवी सामग्री की गुणवत्ता और मात्रा को प्रभावित कर सकता है। एसीडी हमारे अध्ययन के लिए एक अच्छा और विश्वसनीय थक्कारोधी साबित हो गया है, वहीं कई समाधान के परीक्षण के आवेदन के लिए सबसे उपयुक्त थक्कारोधी चुना जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है। ईवीएस बहाव के assays में इस्तेमाल किया जाएगा, जब यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैजहां परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं इस्तेमाल किया थक्कारोधी। उदाहरण के लिए, कुछ anticoagulants (जैसे, EDTA और हेपरिन) दूसरों (जैसे, थियोफाइलिइन, एडेनोसाइन और dipyridamole) प्लेटलेट्स 12 से ईवी रिहाई को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि पीसीआर प्रतिक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है।

काफी पिछले एक दशक से अधिक सुधार हुआ है, जबकि ईवी विश्लेषण के लिए तरीके, अभी भी प्रगति में एक काम कर रहे हैं। अंत में, अनुसंधान पर निर्भर करेगा ईवीएस का विश्लेषण करने के लिए सर्वोत्तम तरीकों का आयोजन किया और शोधकर्ता के लिए उपकरण उपलब्ध किया जा रहा है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों साधन सेटिंग्स प्रवाह के साथ उनकी मदद के लिए रक्त प्रणाली अनुसंधान संस्थान से डेल Hirschkorn को धन्यवाद देना चाहूंगा। एनआईएच द्वारा समर्थित किया गया यह काम HL095470 और U01 HL072268 और DoD ठेके W81XWH-10-1-0023 और W81XWH-2-0028 अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSR II benchtop flow cytometer BD Biosciences 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)
FACS Diva software  BD Biosciences PC version 6.0
FlowJo software  Treestar US Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particles BD Biosciences 556298 used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency 
Ultra Rainbow fluorescent particles  Spherotech URFP-10-5 used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beads Biocytex 7803 used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead Kit Life Technologies A-10344 used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) Santa Cruz  sc-281108 used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT Tubes BD Biosciences 340334 used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units Millipore  UFC30GVNB used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A BD Biosciences 364606
Facs tubes 12x75 polystrene BD Biosciences 352058
50 ml Reservoirs individually wrapped  Phenix RR-50-1s
Green-Pak pipet tips - 10 µl Rainin GP-L10S
Green-Pak pipet tips -200 µl  Rainin GP-L250S
Green -Pak pipet tips - 1,000 µl  Rainin GP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilized Rainin SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer  Rainin LA8-300XLS
96 well tissue culture plates E&K Scientific EK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes) UCSF Cell Culture Facility CCFAE001 media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered UCSF Cell Culture Facility CCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear BECKMAN COULTER INC 344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5 Biolegend 344808 2 µl
CD14 APC-Cy7 Biolegend 301820 2 µl
CD16 V450 BD Biosciences 560474 2 µl
CD28 FITC biolegend 302906 2 µl
CD152 APC BD Biosciences 555855 2 µl
CD19 A700 Biolegend 302226 2 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 340930 2 µl
CD62L APC Biolegend 304810 2 µl
CD108 PE  BD Biosciences 552830 2 µl
CD235a FITC biolegend 349104 2 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7 Biolegend 301322 2 µl
CD62p APC Biolegend 304910 2 µl
CD66b PE  Biolegend 305106 2 µl
CD15 FITC exalpha X1496M 5 µl
CD9 PE Biolegend 555372
CD63 APC Biolegend 353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ Biolegend 400230

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References

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फ्लो का प्रयोग कोशिकी vesicles के विश्लेषण के लिए तकनीक
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Inglis, H., Norris, P., Danesh, A.… More

Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (97), e52484, doi:10.3791/52484 (2015).

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