Summary
Existem muitos métodos diferentes para a medição de vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometria de fluxo (FCM). Vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Dois protocolos de VE de medição são apresentadas, usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão.
Abstract
Vesículas extracelular (VE) são pequenas, vesículas derivadas de membrana encontrados nos fluidos corporais que são altamente envolvido na comunicação célula-célula e ajudam a regular uma variada gama de processos biológicos. Análise de EVs usando citometria de fluxo (FCM) tem sido notoriamente difícil devido ao seu pequeno tamanho e falta de populações discretas positivas para os marcadores de interesse. Métodos de análise EV, enquanto melhorou consideravelmente na última década, ainda são um trabalho em andamento. Infelizmente, não há one-size-fits-all protocolo, e vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Apresentado aqui estão várias técnicas diferentes para o processamento de EVs e dois protocolos para a análise de EVs usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão. Os métodos descritos aqui vai ajudar com eliminando os agregados de anticorpos normalmente encontrados em preparações comerciais, aumentando a relação sinal-ruído, e portões configuração em um f racionalashion que minimiza a detecção de fluorescência de fundo. O primeiro protocolo utiliza um método individual de detecção que é especialmente adequado para a análise de um grande volume de amostras clínicas, enquanto que o segundo protocolo utiliza uma abordagem baseada no grânulo para capturar e detectar os VE e exossomas menores.
Introduction
Vesículas extracelular (VE) são pequenas, vesículas derivadas de membrana encontrados nos fluidos corporais que são altamente envolvido na comunicação célula-célula e ajudam a regular uma variada gama de processos biológicos. Análise de EVs usando citometria de fluxo (FCM) tem sido notoriamente difícil devido ao seu pequeno tamanho e falta de populações discretas positivas para os marcadores de interesse. Métodos de análise EV, enquanto melhorou consideravelmente na última década, ainda são um trabalho em andamento. Infelizmente, não há one-size-fits-all protocolo, e vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Apresentado aqui estão várias técnicas diferentes para o processamento de EVs e dois protocolos para a análise de EVs usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão. Os métodos descritos aqui vai ajudar com eliminando os agregados de anticorpos normalmente encontrados em preparações comerciais, aumentando a relação sinal-ruído, e portões configuração em um f racionalashion que minimiza a detecção de fluorescência de fundo. O primeiro protocolo utiliza um método individual de detecção que é especialmente adequado para a análise de um grande volume de amostras clínicas, enquanto que o segundo protocolo utiliza uma abordagem baseada no grânulo para capturar e detectar os VE e exossomas menores.
VE, também conhecidos como micropartículas, são pequenas, vesículas derivadas de membrana encontrados nos fluidos corporais que estão envolvidos na comunicação célula-célula e ajudam a regular uma variada gama de processos biológicos 1. Através da expressão de vários marcadores de superfície e / ou a transferência directa de material biológico, VE é capaz de alterar a função das células receptoras para jogar ou activação ou supressão de funções na comunicação intercelular 2-4. VE, derivados de plaquetas Clinicamente são conhecidas por terem forte actividade anticoagulante 5, enquanto outros têm sido mostrados para contribuir para uma vasta gama de condições, de promoção do tumor metastasis 6 a proteger contra a doença 7. EVs podem ser classificados em categorias menores de vesículas derivadas de células, tais como exossomos e microvesículas (MVs), dependendo do seu tamanho e do mecanismo da geração 8. A nomenclatura de subpopulações de vesículas derivadas de células continua a ser um tema de debate em curso 8,9, no entanto, exossomos são geralmente descritos como pequena, 40 a 100 nm partículas derivadas da fusão endosomal com a membrana plasmática, enquanto MVs são maiores de 100 a 1.000 partículas nm formado por derramamento da membrana plasmática 10. Aqui, o termo geral "EVs" será usado para se referir a todos os tipos de vesículas extracelulares biológicos liberadas pelas células.
Isolamento de VE de sangue total é um processo multi-passo e muitas variáveis de processamento diferentes têm sido demonstrado que afectam o conteúdo EV, incluindo a temperatura e duração de armazenamento 11,12, anticoagulante / conservante utilizado e 13método de centrifugação usado 14. A necessidade de padronização dessas variáveis levou a recomendações da Sociedade Internacional sobre Trombose e processamento de sangue e isolamento EV procedimentos Haemostasis Comité Científico e Normalização (ISTH SSC) para o bom 15,16, ainda não existe um consenso entre os pesquisadores sobre o protocolo ideal usar 12. A maioria concorda, no entanto, que as variáveis pré-analíticas rigidamente controladas são cruciais para a dados precisos e reprodutíveis.
A fim de analisar EVs, os pesquisadores têm utilizado vários métodos, incluindo microscopia eletrônica de transmissão 17, microscopia eletrônica de varredura 18,19, microscopia de força atômica, luz dinâmica de espalhamento 20,21 e western blot 22,23. Enquanto FCM é o método de escolha para muitos pesquisadores 9,24 - 26, devido às suas capacidades de alto rendimento, a análise de EVs usando FCM tem sidonotoriamente difícil devido ao seu tamanho e falta de populações positivas discretas 27-32. Em comparação com a análise de células, o tamanho pequeno das EVs resulta em 1) menos fluorescência emitida, devido ao menor número de antigénios por partícula e 2) viabilidade limitada de lavagem pós-mancha, a qual é necessária para reduzir a fluorescência de fundo. Desafios comuns entre os pesquisadores incluem sinais decorrentes de agregados de imunoglobulinas 27,28 e auto-agregação de anticorpos 29. Além disso, os tempos de processamento longos e procedimentos de lavagem / isolamento morosos utilizados por muitos dos protocolos actuais requerem 33,34 compromissos de tempo de vários dias para analisar um pequeno número de amostras, tornando-os menos do que ideal para aplicações de alto débito. Alguns pesquisadores renunciar a um passo de lavagem por completo, tornando tradicionalmente utilizados controles negativos FCM como uma fluorescência menos (FMO) e isotipos de anticorpos inútil para avaliar com precisão bacfluorescência kground 30.
Nossos protocolos de enfrentar três problemas comuns que podem impedir a análise FCM adequada de EVs: Os sinais resultantes de agregados de anticorpos e outros não-vesículas, dificuldade em remover o anticorpo não ligado, e falta de populações positivos discerníveis. As técnicas descritas aqui irão auxiliar com eliminando os agregados de anticorpos normalmente encontradas em preparações comerciais, o aumento da razão sinal-para-ruído, e definindo portões de uma forma racional, que minimiza a detecção de fluorescência de fundo. Dois métodos diferentes de detecção são aqui apresentados: o primeiro protocolo utiliza um método de detecção individual que é especialmente bem adequado para a análise de um grande volume de amostras clínicas, enquanto que o segundo protocolo utiliza uma abordagem baseada em grânulos para capturar e detectar os VE e exossomas menores.
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Protocol
NOTA: Os seguintes protocolos foram realizados em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Todas as amostras de sujeitos humanos foram testados no âmbito de um Conselho de Revisão Institucional (IRB) protocolo -aprovado e com o consentimento informado dos sujeitos.
1. MÉTODO A: Método de Detecção Pessoa
1.1) Processamento de Amostra de Sangue / Isolamento de EVs
- Extrair o sangue do dador / paciente em duas 10 ml de tubos de vidro contendo 1,5 mL de solução ACD-A ou outro anticoagulante adequado e processo imediatamente (dentro de 30 min-max), utilizando o protocolo de centrifugação diferencial 2-passo seguinte.
NOTA: Este protocolo irá produzir aproximadamente 10 ml de plasma pobre em plaquetas (PPP) a partir dos combinadas ~ 17 ml de sangue extraído. Se mais ou menos PPP é necessário, o número de tubos de sangue recolhida pode ser ajustada em conformidade. - Centrifugar as amostras a 1500 xg durante 10 min a RTpara separar o plasma de buffy coat e glóbulos vermelhos. Transferir alíquotas de 1,2 ml do sobrenadante do plasma para tubos de 1,5 ml de centrífuga, tendo o cuidado de não perturbar as camadas do fundo contendo o buffy coat e glóbulos vermelhos.
- Girar a 13.000 xg durante 10 min à temperatura ambiente para remover plaquetas e fragmentos celulares grandes. Transferir cuidadosamente o PPP, deixando para trás 200 mL para evitar perturbar o sedimento e adicionar o PPP para um novo tubo.
- Neste ponto, usar PPP imediatamente para análise ou transferência em alíquotas de 1,0 ml a 1,5 ml novos tubos de centrífuga e armazenar a -80 ° C por até dois anos, para posterior análise (consulte a Figura 1A para visão geral).
- Se forem necessários VE purificados por experiências de transferência funcionais, 6 ml de PPP para um tubo de ultracentrífuga e adicionar 28 ml de salina tamponada com fosfato 0,2 micrometros de filtrado (PBS). Centrifugação durante 60 min a 100000 xg, à temperatura ambiente, usando uma ultracentrífuga equipado com um rotor de balde oscilante. Aspirar sobrenadante e ressuspender EV peldeixe em 1,5 ml de mídia.
NOTA: Para obter mais alta reprodutibilidade, amostras de sangue devem ser tratados de forma tão consistente quanto possível, do doador ao doador. Qualquer variação no método de isolamento de EV poderia impactar significativamente o número e tipo de EVs detectadas.
1.2) A preparação de amostras para análise
NOTA: A partir deste ponto, os passos explicar um protocolo de alto rendimento para a análise de 12 amostras por 14 marcadores em 3 painéis. No entanto, outras combinações de anticorpos podem ser usados aqui; o protocolo pode ser adaptado para estudar outras populações EV substituindo os marcadores sugeridas por aqueles de interesse.
- Retirar amostras de 12 congelador (se armazenados a -80 ° C) e descongelação a 37 ° C.
- Conteúdo da pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar. Remover 320 mL de cada amostra e adicionar ao topo da linha de uma placa de 96 poços.
NOTA: A largura ajustável multi-bem pipeta é extremamente útil para este e muitos outros passos em todo o burroay, particularmente quando se analisam amostras múltiplas de uma só vez.
1,3) As amostras de coloração EV
- Antes da coloração, filtrar todos os anticorpos (Abs) para remover os agregados, o que pode causar sinais positivos.
- Anticorpos combinam para ser utilizado em cada um dos três painéis separados em tubos de filtro de 0,22 um e centrifugar centrífugos usando um ângulo fixo única centrífuga de velocidade (~ 750 x g) à temperatura ambiente durante 2 minutos, ou até que toda a mistura Ab tenha passado através do filtro e o líquido não anticorpo permanece na superfície do filtro. Loja Ab cocktails na geladeira por até duas semanas, mas re-filtro antes de cada utilização.
- Adicionar a quantidade apropriada de mistura Ab filtrou-se para cada poço na fila 2 (por exemplo, no painel de amostras I são coradas com 2 ul de cada Ac, então um total de 12 ul de Ab cocktail filtrado é adicionado por poço com a linha 2). Consultar a Figura 1B para um esboço da placa mapa sugerido. Repita estes dissos para as linhas abaixo se mais painéis são executados (aqui, adicionar 8? l / poço do cocktail Painel de acordo com a linha II 3 e 11 ^ l / poço do cocktail Painel de acordo com a linha III 4 referem-se a Lista de Materiais para a informação de painel específico).
- Usando a pipeta multicanal, misturar as amostras de PPP na linha 1 para cima e para baixo e transferir 100 ul dos poços na linha 1 para os poços em linha 2. Mix cima e para baixo. Alterar dicas e repetição, transferindo 100 l da linha 1 para as linhas 3 e 4. Incubar a 4 ° C por 30 min.
1.4) As amostras de lavagem de MT
- Remova a placa de 96 poços a partir de 4 ° C e a transferência câmara de segurança biológica. Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 220 ul de PBS / poço para linhas 6-8 (para ser utilizado na limpeza / lavagem dos poços contendo manchado PPP).
- Transferir o conteúdo de cada cavidade para tubos centrífugos de filtro pré-marcado, utilizando a pipeta multicanal largura-ajustável (Para 12 amostras, com três painéis de anticorpos, 12 x 3 = 36 tubos de filtroser necessária). Usando as mesmas pontas, remover 200 ul de PBS a partir das linhas de lavagem e adiciona-se aos poços correspondentes a partir do qual apenas PPP foi removido.
- Misturar cima e para baixo para lavar os poços e transferir a solução de enxaguamento para os mesmos filtros para que o PPP foi adicionada previamente. Fechar topos de filtros centrífugas. Alterar dicas.
- Repita este processo com as amostras manchadas restantes até que todas as amostras de PPP manchadas foram transferidos junto com suas soluções de lavagem de filtros centrífugos.
- Transferir os filtros centrífugos para uma centrifugadora de rotor fixo e centrifugação a 850 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente.
NOTA: Certifique-se de que nenhum líquido permanece nos topos de filtro. Após centrifugação, o filtro deve parecer "seca" sem camada de fluido restante visível na parte superior. Embora seja improvável, determinadas amostras de PPP pode exigir um longo tempo de centrifugação para se mover de forma eficaz através do filtro. - Retire os tubos de filtro centrífugo e retornar à câmara de segurança biológica.Utilizando a pipeta multicanal, ressuspender as partes superiores dos filtros em 300 ul de PBS. Transferir o conteúdo em suspensão para tubos pré-marcado para análise FCM imediato.
NOTA: É muito importante manter a força e número de depressões pipeta êmbolo consistentes entre as amostras para evitar variação de amostra para amostra. Isto deve idealmente ser feito usando uma pipeta eletrônica que foi programado para pipeta cima e para baixo um volume específico (por exemplo, 280 ul) um número exato de vezes (por exemplo, oito vezes) para cada amostra.
1.5) Setup Cytometer
- Abra o software FCM. Antes de experimentar a instalação, execute a calibração do aparelho diariamente e configuração usando esferas de Instalação instrumento (seguindo as instruções do fabricante).
- Se as amostras EV foram coradas com mais do que um anticorpo e vários fluorocromos que devem ser medidos ao mesmo tempo, calcular valores de compensação, como segue:
- Adicione 2 gotas de esferas de compensação para prétubos (marcado com um tubo para cada anticorpo conjugado com fluorocromo) e adicionar a quantidade recomendada de anticorpos. Adicione 2 gotas de esferas de compensação negativas para outro tubo para usar como o controlo de compensação unstained.
- Incubar a 4 ° C durante 30 minutos, lava-se com PBS e ressuspender em 400 ul de PBS.
- Usando o citômetro de fluxo software incluído com o instrumento, execute cada tubo de compensação e ajustar tensões fluorescentes para colocar cada pico em aproximadamente 10 4 em uma escala log 5 décadas. Certifique-se que o pico de fluorescência é maior (mais brilhante) em seu próprio canal fluorescente em comparação com todos os outros canais, e ajustar as tensões dos parâmetros fluorescentes novamente se necessário. Execute cada tubo comp-coradas individualmente e capturar pelo menos 5.000 eventos por tubo.
- Selecione a opção "Experiment", guia, em seguida, selecione "Compensação", em seguida, selecione "o cálculo das compensações" para aplicar os valores de remuneração para todas as amostras.
- Durante a execução de um tubo de 0,22 filtrada PBS, ajustar as voltagens do FSC e SSC para os maiores valores que excluem a maioria dos ruídos de fundo (ou seja, um pouco abaixo do limiar de tensão em que a taxa de eventos ultrapassa 5 eventos / seg).
- Em seguida, executado um tubo contendo 0,2 mm - 1,0 mm os grânulos, diluídas em PBS, se necessário. Em uma trama FCS vs. SSC, desenhe um portão em torno da população de esferas para capturar eventos entre 0,2 m e 1,0 m. Em alternativa, em um histograma SSC-H, desenhe um portão para incluir todos os eventos menores do que os 1,0 mm esferas.
- Ajustar a taxa de fluxo do citômetro de "Lo" (cerca de 8-12 l / min). Usando o tubo de esferas (ou outro tubo contendo uma concentração conhecida de contas) ajustar a taxa de fluxo de marcação no citómetro até a vésperant taxa atinge cerca de 200 eventos / seg. Ler todos os tubos de amostra com a mesma taxa de fluxo e utilizar a mesma concentração do grânulo em experiências futuras para assegurar que as taxas de fluxo permanecem consistentes entre corridas.
- Executar um tubo de partículas fluorescentes do arco-íris, diluídos em PBS. Adquirir 5.000 eventos. Registre os valores da intensidade média do FSC, SSC, e cada canal de cor. Use esses valores para ajustar tensões em experimentos futuros para garantir que a intensidade de fluorescência de manter a coerência entre os experimentos.
1.6) A leitura das amostras
- Ajustar a taxa de fluxo do citômetro de "Lo" (cerca de 8-12 l / min) e executar cada amostra para exatamente 1 ou 2 min.
- Após a primeira leitura, adicionar 20 ul de 10% de NP-40 a cada amostra, pipeta cima e para baixo, e voltar a ler para o mesmo período de tempo (1 ou 2 minutos) para permitir a subtracção de eventos positivos detectados em a amostra lise sobre um período de tempo igual.
NOTA: É extremamente important que as amostras sejam misturadas utilizando uma pipeta, em vez de um vórtex. Em nossa experiência, vórtex pode causar auto-agregação de alguns anticorpos, levando a eventos positivos que imitam EV. - Uma vez que todas as amostras foram lidos, exportação de todos os arquivos .fcs em um arquivo separado para ser usado para análise utilizando o software de análise FCM.
1.7) Análise de Dados
- Abra o software de análise FCM. Importe todos os arquivos .fcs em um novo arquivo experimento.
- Abra o beads-somente tubo. No FSC-A vs. SSC-A trama, desenhar uma porta em torno todos os tamanhos esferas entre 0,2 mm e 1,0 mm. Esta é a porta EV. Arraste para adicionar a todas as amostras.
- Utilizando as amostras lisadas como controlos negativos, desenhar portas na extremidade de fundo de fluorescência em cada canal de fluorescência utilizado. Arraste portões fluorescentes no portão EV de cada amostra não-lisadas correspondente.
NOTA: Neste ponto, ele também é útil para examinar duas parcelas bi-parâmetro fluorescentes. Formas de foguetes emo quadrante duplo positivo (ver Figura 8), particularmente se os marcadores são conhecidos a residir em tipos de células não relacionadas, podem ser indicativos de artefacto de agregação ou outros eventos que mimetizam a vesícula. - Para cada marcador fluorescente, subtrai-se o número de eventos na amostra lisadas a partir do número de eventos na amostra não-lisadas. Opcionalmente, dividir esse número pelo número total de EVs dentro do portão não-lise EV obter% valores positivos.
2. Método B: Método Beads
2.1) Processamento de Amostra de Sangue / Isolamento de EVs
- Consulte o método de processamento de sangue descrito no Método A (Seção 1.1).
2.2) A preparação de amostras para análise
- Se desejar, fracionar PPP ou EVs ultracentrifugado em exossomos e microvesículas. Adicionar 250 mL de PPP ou EVs ultracentrifugado para 0,22 filtros centrífugos e transferir para uma centrífuga de rotor fixo e rotação a 750 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
NOTA: Certifique-se de que nenhum líquido permanece nos topos de filtro. Após centrifugação, o filtro deve parecer "seca" sem camada de fluido restante visível na parte superior. Embora seja improvável, certas amostras podem requerer um tempo ligeiramente mais longo por centrifugação o fluido a mover-se de forma eficaz através do filtro. - Lave não revestidos 6 mm esferas de poliestireno (por exemplo, contas negativas ABC) 2x com meio RPMI e ressuspender em 2 ml. Adicionar 6000 grânulos para cada tubo de FACS. Para o tubo de controlo negativo, adicionar 400 ul de meio RPMI sozinho para os grânulos. Para todos os outros tubos, adicionar 200 mL de PPP ou EVs ultracentrifugado (ou suas fracções) e 200 mL de meio RPMI.
- Ajustar o volume final de todos os tubos para 400 ul com meio e incubar durante a noite a 4 ° C num agitador.
- Na manhã seguinte, lavar os grânulos com 2 ml de meio. Aspirar o sobrenadante.
- Bloco com 5% de albumina sérica bovina (BSA) em meios (400 mL) durante 3 horas a 4 &# 176; C em um shaker.
- Lavar as pérolas com 2 ml de meio. Aspirar e ressuspender o sedimento em 100 ul de meio.
2.3) As amostras de coloração EV
- Filtro de todos os anticorpos. Usar os mesmos painéis de anticorpos utilizados no Método A, ou se desejado, criar uma combinação diferente de anticorpos, desde que as suas fluorocromos são compatíveis um com o outro.
- Combine todos os anticorpos a ser utilizados num único painel para um tubo de centrífuga de filtro de 0,22 um. Centrifugar usando um ângulo fixo de centrífuga de velocidade única durante 2 minutos ou até toda a mistura Ab tenha passado através do filtro e nenhum líquido anticorpo permanece na superfície do filtro.
- Adicionar o volume apropriado da mistura de anticorpos filtrada para todos os tubos e incubar durante 30 min a 4 ° C.
- Lavar as pérolas com 2 ml de meio, ressuspender em 400 ul de meio e executar imediatamente (ou no mesmo dia) no citómetro de fluxo.
2.4) Cytometer Setup e Sample Reading
- Abra o software FCM. Antes de experimentar a instalação, execute a calibração do aparelho diariamente e configuração usando esferas de Instalação instrumento (seguindo as instruções do fabricante).
- Se as amostras EV foram coradas com mais do que um anticorpo e vários fluorocromos que devem ser medidos ao mesmo tempo, calcular valores de compensação, como segue:
- Adicione 2 gotas de esferas de compensação para tubos pré-marcados (1 tubo para cada anticorpo conjugado com fluorocromo) e adicionar a quantidade recomendada de anticorpos. Adicione 2 gotas de esferas de compensação negativas para outro tubo para usar como o controlo de compensação unstained. Incubar a 4 ° C durante 30 minutos, lava-se com PBS e ressuspender em 400 ul de PBS.
- Usando o software FCM, execute cada tubo de compensação e ajustar tensões fluorescentes para colocar cada pico em aproximadamente 10 4 em uma escala log 5 décadas. Certifique-se que o pico de fluorescência é maior (mais brilhante) em seu próprio canal fluorescente em comparação com todos os outros canais, eajustar os parâmetros de tensões fluorescentes novamente, se necessário. Execute cada tubo comp-coradas individualmente e capturar pelo menos 5.000 eventos por tubo.
- Selecione a aba "Experiment", depois "Compensação", então "o cálculo das compensações" para aplicar os valores de remuneração para todas as amostras.
- Alterar o FSC e SSC parâmetros de tensão a escala logarítmica e escolha os limites inferiores permitidas pelo citômetro (FSC = 200 e SSC = 200) para cada.
- Amostras de correr, portão sobre a população pérolas singlet e adquirir 2.000 eventos neste portão. Exportar arquivos .fcs.
- Use um software de análise FCM para analisar .fcs arquivos. Portão em esferas singletos. Calcular a intensidade fluorescente média geométrica (IMF) para cada fluorocromo e comparar com o MFI do controlo negativo.
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Representative Results
A Figura 1 apresenta o esquema de tratamento global para o isolamento e detecção de veículos eléctricos, utilizando quer o método baseado em grânulo ou método de detecção individual. Detecção individual de EVs usando FCM funciona bem para a análise de EVs maiores, mas a maioria dos cytometers não são capazes de detectar individualmente partículas tão pequenas como exossomos. Uma abordagem baseada em grânulo permite VE pequenas para serem detectados, no entanto, existem desvantagens associadas com a utilização deste método, conforme descrito na Tabela 1. Em geral, o isolamento do VE utilizando ultracentrifugação (com ou sem a adição de um procedimento de fraccionamento de gradiente de sacarose) é recomendada quando EVs são necessários para ensaios funcionais. Ultracentrifugação remove as impurezas, incluindo as proteínas do soro e outros contaminantes solúveis do plasma, o que pode afetar os resultados experimentais funcionais. No entanto, a ultracentrifugação é demorado e pode alterar a quantidade e qualidade EV 12.
"> Resultados esperados para os dois ensaios de detecção estão representados nas Figuras 2-3. Para o ensaio de detecção individual, o controlo lisada (fila inferior, Figura 2) é usado para definir portas para a amostra não-lisadas correspondente (linha de cima, Figura 2). A maioria dos eventos deve ser abrangida pelo portão EV. portões Quadrante não deve revelar eventos positivos de casal quando os dois marcadores em comparação não são normalmente encontrados na mesma cela. As parcelas biparameter direita na Figura 2 mostram os marcadores CD108a e CD235a , que são dois marcadores de células de sangue vermelhas conhecidas para coexistir em células. Aqui, no VE, mais de metade dos eventos positivos são positivas para ambos os marcadores, como seria de esperar. Na mesma maneira, os marcadores de superfície celular que se sabe residirem na mesma célula deve mostram padrões similares de dupla positividade em EVs. As parcelas centro biparameter mostrar expressão EV de dois marcadores que se sabe não coexistir em células. Nesta análise de CD235a (a bloo vermelhod marcador de células) e CD41a (um marcador de plaquetas), os EVs, mostrar, populações positivos separados distintos, o que é esperado uma vez que eles vêm de diferentes tipos de células. Quando lisadas, eventos positivos deve desaparecer. Em geral, quaisquer eventos positivos restantes após a lise indicam a presença de sinal proveniente de partículas não-vesículas, agregados e / ou veículos eléctricos resistentes a detergente. A Figura 3 mostra os resultados esperados usando o método de detecção com base em grânulo. Ao contrário do método de detecção individual, estes dados não pode / não deve ser visto em parcelas bi-parâmetros. Nos gráficos de pontos superiores, não há separação entre as populações positivas e negativas existir, e eventos aparecem nos quadrantes duplamente positivas, embora não sejam normalmente encontrados nos mesmos tipos de células, devido ao fato de que ambos os tipos de veículos eléctricos irão ligar-se a um talão único. Para o método de detecção com base em grânulo, os dados são analisados usando sobreposições melhor histograma com o controlo negativo (representado por baixo os gráficos de pontos). Positividade is, medida usando um MFI de marcador (intensidade de fluorescência média) e comparada directamente com a do controlo negativo. Se uma amostra for positiva para o marcador em causa, a sua IMF será maior do que o controlo negativo. O controlo negativo para o método das esferas é simplesmente grânulos bloqueadas com BSA (sem VE adicionado), que foram corados com os mesmos anticorpos e lavadas juntamente com as contas revestidas com EV. Uma comparação dos resultados esperados, utilizando os dois métodos pode ser visto na Figura 4.A capacidade do ensaio individual de detecção para avaliar correctamente fenótipos EV depende fortemente de gating correcta para separar eventos Ab-positivos a partir de fluorescência de fundo. Portanto, é importante escolher um controlo negativo que mais apropriadamente imita / prediz a fluorescência de fundo de uma determinada amostra. Quando EVs manchadas não são lavados antes de ler, comumente usado controles negativos (por exemplo, isotipos) não conseguem prever com precisão fundo fluorescence para todos os marcadores (Figura 5A). Nestes casos, se a lavagem não é uma opção, as amostras lisadas tendem a trabalhar melhor para a previsão de fluorescência de fundo. No entanto, quando os VE coradas são lavadas antes de ler (filtração centrífuga utilizando, neste caso), ambos os controlos negativos (isotipos e amostras lisadas) funcionam bem para prever a fluorescência de fundo de uma amostra (Figura 5A). Deve notar-se, contudo, que, embora todos os controlos negativos "trabalho", os controlos lisadas são preferidos porque proporcionam informação adicional sobre uma amostra (por exemplo, a presença de eventos e / ou agregados resistentes a detergente, não-relacionadas com vesícula) que pode resultar em sinais positivos não-EV e impropriamente inflar contagens AB. Além disso, os controlos de isotipo pode por vezes ser pouco fiável, mesmo nas amostras lavadas, como mostrado na figura 5B, onde a amostra corada tem menos efeitos positivos do que a mesma amostra corada com anticorpos de controlo de isotipo. Sem remoção completa de anticorpo não ligado, parcelas FCM ponto de alguns marcadores EV são quase impossíveis de interpretar, aparecendo como nuvens de partículas fluorescentes vagamente indistinguíveis de seus fundos altamente fluorescentes (Figura 6, top parcela). Lavar as amostras coradas utilizando filtros centrífugos aumenta a separação entre o fundo e os sinais de marcadores positivos (Figura 6, lote inferior); No entanto, pequenas VE e exossomas podem ser perdidos através dos poros do filtro.
A utilização de um passo de lise com detergente revela, eventos que mimetizam vesículas positivos de complexos imunes e proteína agrega 21. Quando PPP é analisada utilizando detecção individual, encontrando eventos positivos que não desaparecem com a lise é uma ocorrência bastante frequência. Estes eventos detergentes resistentes muitas vezes aparecem como suspeitos, sinais diagonais altamente fluorescentes em ambos os parâmetros e biparameter parcelas individuais (Figura7). Clinicamente, estes complexos de proteínas e / ou complexos imunitários insolúveis são mais prevalentes em doentes que sofrem de várias doenças, tais como 21 artrite reumatóide 28, síndrome nefrótica 19, e lúpus eritematoso sistémico 29. Portanto, dependendo do objectivo da pesquisa, pode desejar-se incluir ou retirá-los da maneira analysis.Another sinais diagonais pode formar é por vórtex as amostras, em particular após a adição do reagente de lise (Figura 8). As amostras devem sempre ser misturadas para cima e para baixo por pipeta para evitar a formação de agregados.
Figura 1: Esquema geral de processamento para o isolamento e detecção de veículos eléctricos, utilizando quer o método baseado em grânulo ou método de detecção individual. (A) Todo o sangue é processado primeiro em PPP. Dare, PPP pode ser processado por ultracentrifugação para produzir EVs isoladas ou usado como está na detecção individual ou ensaios baseados em talão. (B) Esboço de sugeriu mapa da placa para análise de amostras de alto rendimento utilizando o método de detecção individual. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Resultados esperados para detecção individual de citometria de fluxo gráficos de pontos mostram coloração representativo de amostras EV lisadas e não lisados. Os valores mostram percentuais de eventos positivos. A maioria dos eventos dentro do portal EV. Eventos mostrados nas parcelas biparameter certas estão dentro dos portões do FSC / EV SSC à esquerda. A amostra lisada (fila inferior) é utilizado para definir portões fluorescentes de base para eAch correspondente (não lisados) amostra. Quad portões não deve revelar eventos duplamente positivas quando os dois marcadores em comparação não são normalmente encontrados na mesma célula. Aqui, o CD235a biparameter e CD41a trama mostra uma nítida separação entre os EVs expressam marcadores de células vermelhas do sangue e aqueles que expressam marcadores de células de plaquetas. Da mesma forma, os marcadores de superfície celular conhecidos a residir na mesma célula deve mostrar padrões semelhantes de dupla positividade sobre EVs. O enredo biparameter direita mostra que mais da metade dos EVs CD235a-positivos também são positivas para o marcador secundário de glóbulos vermelhos (RBC), CD108a. Quando lisadas, eventos positivos deve desaparecer. Os eventos positivos restantes após a lise indicam a presença de sinal proveniente de não-vesículas ou detergentes partículas e / ou agregados resistentes.
Figura 3: Resultados esperados usando a detecção baseada em grânuloMétodo. A citometria de fluxo gráficos de pontos mostram a coloração representativo do VE acoplado a esferas, em comparação com grânulos bloqueadas com BSA, que serve como controlo negativo. Os valores mostram percentuais de eventos positivos. Eventos mostrados nas parcelas biparameter certas estão dentro do FSC / SSC contas portas do lado esquerdo. Para o método de detecção de pérolas e baseadas em dados são melhor analisados usando sobreposições histograma com o controle negativo (representado por baixo dos gráficos de pontos). A positividade é medida usando um MFI de marcador (intensidade de fluorescência média) e comparada directamente com a do controlo negativo.
Figura 4:. Comparação dos resultados esperados usando pérolas vs. detecção individual de citometria de fluxo dot gráficos mostram coloração representante de EVs acopladas a contas (top de linha), em comparação com EVs analisando usando a detecção individual (linha inferior). Eventosmostrado no direito biparameter parcelas estão dentro das FSC / SSC contas portas do lado esquerdo.
Figura 5:. Comparação de diferentes controles negativos em análises de detecção individual Valores mostrar porcentagens de eventos positivos. Eventos são apresentados dentro do portão FSC / SSC EV. (A) Comparação de controles negativos em vs. sujo lavado amostras. Isotype ou controles lisadas foram avaliados quanto à sua capacidade de fornecer indicações apropriadas de fluorescência de fundo através de dois diferentes marcadores em uma amostra totalmente manchado (linha de fundo). Os portões de cada marcador foram feitos utilizando a amostra lise (top de linha) e depois copiado para as linhas abaixo. Amostras lavadas foram lavados por meio da filtração pós-mancha. (B) Exemplo de uma amostra corada com o controle de isótipo tendo eventos mais positivos do que o wi amostra coradapo real de anticorpos.
Figura 6:. Efeito da lavagem pós-mancha na detecção individual valores mostram percentagens e número de eventos positivos. Eventos são apresentados dentro do portão FSC / SSC EV. Os portões de cada amostra foram feitos usando a contrapartida de cada amostra de lise (não mostrado; referem-se a figura anterior para a definição de porta em unwashed vs amostras lavadas). Alta fluorescência de fundo faz distinção positiva de eventos negativos difícil (gráfico de cima). Quando lavada, no entanto, a população positiva é revelado como anticorpos fluorescentes não ligados são removidos e a fluorescência de fundo é reduzido (gráfico inferior).
Figura 7: a lise de detergente confirma a presença de não-EV signals. Events apresentados estão dentro do portão FSC / SCC EV. Os valores mostram percentuais de eventos positivos. EV amostras coradas foram lidos antes (coluna da esquerda) e após a adição de detergente (coluna da direita) para identificar sinais positivos causados por complexos imunes e outros eventos não relacionados-EV.
Figura 8: vórtex provoca o aparecimento de sinais não-EV Eventos mostrados estão dentro do portão FSC / SCC EV.. Os valores mostram percentuais de eventos positivos. EV amostras coradas foram lidos antes (coluna da esquerda) e após a adição de detergente (coluna da direita). Usando um vórtice para misturar amostras pode causar-imitando EV, populações diagonais para formar (linha superior). Quando misturado suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta, no entanto, a formação destas populações podem ser evitadas (linha inferior). Vórtex não é recomendado para a mistura, uma vez que pode provocar a agregação em algumas amostras, leading para Diagonal-aparecendo, as populações positivas. Em geral, o número de eventos dentro de um portão positivo não deve aumentar após lise.
| Detecção Bead-base | Detecção Individual | |
| EV Tamanhos | recomendada para <100 nm só | recomendado para> 100 nm apenas |
| Tempo | requer uma incubação | pode terminar em <1 dia |
| Sensibilidade | detecção de agrupamentos | detecção de partículas única |
| Resultados | qualitativo | quantitativo |
| Lavagem | simples centrifugação, padrão | requer filtros centrífugos |
| O controlo negativo | Grânulos revestidos com BSA | amostras lisadas |
Tabela 1: Prós e contras de ambos os métodos de detecção.
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Discussion
Dois diferentes protocolos para o isolamento, tratamento e análise de VE foram apresentados, utilizando quer uma individual de detecção ou de aproximação baseadas em esferas. Selecionando o método mais adequado para usar nem sempre é fácil e requer uma compreensão da amostra a ser testada, bem como as subpopulações de interesse individuais. Além disso, a sensibilidade do citómetro usado para a aquisição deve ser considerado quando se escolhe o método mais adequado. Muitas vezes não há melhor protocolo único de usar, em vez disso, uma combinação de métodos fornece mais informações sobre uma amostra do que qualquer um método sozinho. Idealmente, várias técnicas de isolamento e de detecção diferentes deve ser avaliada primeiro, a fim de desenvolver um protocolo adaptado, que tem em consideração indivíduo citómetro de desempenho no que respeita à população EV específico a ser estudado. As técnicas de isolamento alternativos incluem a ultracentrifugação, fraccionamento de densidade de sacarose, b imunomagnéticaseparação ead, cromatografia e afinidade purificação 12, enquanto que os métodos de detecção alternativos incluem a microscopia eletrônica de varredura, microscopia eletrônica de transmissão, microscopia de força atômica, espalhamento dinâmico de luz, e western blot 8. Através da combinação de diferentes técnicas, os métodos apresentados aqui podem ser adaptadas a fim de criar protocolos mais adequados para o estudo de várias populações de EV de interesse.
Em geral, a detecção individual de EVs usando FCM funciona bem para a análise de EVs maiores, mas perde a sensibilidade como EVs ficam menores. Enquanto detecção individual é mais consistente na detecção de EVs maiores, a detecção baseada em talão é menos sensível na detecção de EVs maiores e mais sensível para exossomos. EVs maiores podem ser lavados facilmente através de filtração pós-mancha e detectou isoladamente via FCM. VE e exossomas menores, por outro lado, não são detectados bem individualmente usando FCM e são muito mais difíceis de lavar pós-coloração. A captura de talãoprotocolo resolve esses dois problemas, permitindo que os EVs para ser facilmente lavado e vários EVs a ser medido em conjunto para criar sinais positivos maiores detectáveis por FCM. No entanto, existem desvantagens associadas com a utilização deste método, conforme descrito na Tabela 1.
Quando se trabalha com um citómetro menos sensível, a capacidade de detecção individual é limitado. Antes da análise EV, a sensibilidade do citómetro deve ser determinada utilizando uma mistura de tamanhos de grânulo variando 0,1-1,0 mm. A falha do citómetro de detectar a maioria das partículas abaixo de 1,0 um, seria necessário a utilização do protocolo com base em grânulo. Marcadores altamente expressas são facilmente detectados usando o protocolo. Populações mais raras são por vezes mais fáceis de detectar, utilizando o protocolo de detecção de partícula única, em vez de o protocolo de captura de grânulo, no entanto, isto pode variar dependendo de variáveis tais como: o brilho do fluorocromo, da amostra EV: r do grânuloacio, e o tamanho do EV tendo o marcador de superfície celular raro. Detecção de múltiplos marcadores numa única partícula que requer a utilização do método de detecção individual. O método baseia-grânulo não é capaz de detecção EV indivíduo. Portanto, o protocolo à base de grânulo irá produzir dados que são mais de natureza qualitativa, enquanto que o método de detecção individual vai dar mais dados quantitativos.
Outras técnicas de isolamento devem ser utilizados sempre que EVs são necessários para aplicações a jusante. VE utilizados em ensaios funcionais devem ser ultracentrifugado usando o protocolo de centrifugação diferencial 3-passo, uma vez que as proteínas solúveis do soro no plasma podem afectar os resultados experimentais funcionais. Para a caracterização do VE, no entanto, não é recomendado ultracentrifugação, uma vez que este passo adicional pode afectar a qualidade e quantidade EV devido às elevadas forças transmitidas sobre as partículas 12.
O protocolo de detecção individual contém several passos chave para o teste optimizados de alto rendimento, incluindo: 1) a aplicação de filtros centrífugos para a remoção rápida e eficaz de eventos positivos causados por agregados Ab, 2) o uso de filtros como uma alternativa mais prático ou ultracentrifugação de gradiente de sacarose de fraccionamento para lavar desvinculado Ab a partir de amostras de EV pós-coloração, e 3) utilização de detergente de lise como controle negativo, o que não só revela acontecimentos positivos provocados pelo não EVs, mas fornece uma boa aproximação da fluorescência de fundo para distinguir positivo das populações negativas para desenho portões. O protocolo de detecção individual é recomendada sempre que um grande número de amostras de teste precisa como ela pode ser realizada num único dia, ao passo que o método à base de grânulo requer uma incubação de um dia para o outro.
Os controlos negativos em cada protocolo tem diferentes vantagens e desvantagens, dependendo do método de detecção que é utilizado. Uma vantagem de usar o um grânulo baseadossay é que os mesmos anticorpos monoclonais podem ser usados para tubos negativos e positivos e o mesmo controlo negativo pode ser usado para todas as amostras. O método de detecção individuais, por outro lado, exige controlos separados para serem lidas para cada amostra testada. O controlo negativo utilizado pelo protocolo de detecção individual utiliza amostras lisadas, as quais não requerem o uso / consumo de anticorpos adicionais, mas requerem que cada tubo de ser lido um segundo tempo após a adição do agente de lise. Os controlos lisadas têm a vantagem adicional de ser capaz de identificar a proporção de sinal positivo que pode ser atribuído aos eventos não relacionados de vesículas, tais como complexos imunes 21. O ensaio baseado em talão não tem essa capacidade todistinguish entre sinais positivos decorrentes de verdadeiros EVs e dos decorrentes de não-vesículas.
Limitações da técnica
Enquanto não existe um método padronizado para o isolamento de EVs, diferencialcentrifugação é uma técnica amplamente utilizada entre os pesquisadores de EV. O método de centrifugação diferencial descrita aqui baseia-se em protocolos comuns para o isolamento de PPP, o que normalmente requer uma centrifugação inicial entre 1200-1500 xg durante 10-20 minutos, para remover as células, seguido por uma segunda centrifugação entre 10,000-13,000 g durante 10-30 min para remover as plaquetas 35. O protocolo aqui descrito utiliza uma centrifugação a 1500 xg durante 10 min, seguido por uma centrifugação a 13.000 xg durante 10 min. Embora as forças mais elevadas de 25,000-100,000 xg são normalmente necessários para sedimentar os VE, alguns dos VE maiores podem ser removidos com o protocolo de centrifugação diferencial apresentamos.
Até 90% de VE detectadas pelo FCM são perdidos com uma hora de ultracentrifugação a 100000 xg (dados não mostrados). Tempos de centrifugação mais longos devem ser considerada, embora com cautela, pois isso pode afetar negativamente a composição da amostra. Se o processamento adicional é necessário fou estudos de caracterização, a filtração pode ser realizada após a centrifugação de 2 passos (antes da coloração) para fraccionar mais amostras baseadas no tamanho de partícula. Semelhante a ultra-centrifugação, filtração pode resultar em uma perda de até 50% dos eventos marcadores positivos e até 90% das partículas totais detectadas por FCM (dados não mostrados). Embora o aumento da razão sinal-para-ruído é de benefício óbvio, a perda de pequenas VE representa uma limitação significativa quando se considera qualquer método de lavagem ou de isolamento.
Finalmente, o anticoagulante utilizado (por exemplo, heparina, ACD, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), etc.) durante a recolha de sangue pode ter impacto na qualidade e quantidade de teor de VE. Enquanto ACD provou ser uma boa e fiável anticoagulante para os nossos estudos, testando várias soluções é recomendado para assegurar que o anticoagulante mais adequado para a aplicação é escolhida. Isto é especialmente importante quando os VE vai ser utilizado em ensaios de jusanteonde o anticoagulante utilizado pode afectar o resultado. Por exemplo, alguns anticoagulantes (por exemplo, EDTA e heparina) são conhecidos por interferir com as reacções de PCR, enquanto outros (por exemplo, teofilina, adenosina e dipiridamol) foram mostrados para inibir a libertação a partir de plaquetas de 12 EV.
Métodos de análise EV, enquanto melhorou consideravelmente na última década, ainda são um trabalho em andamento. Em última análise, os melhores métodos de análise de EVs dependerá da pesquisa que está sendo conduzida e ferramentas disponíveis para o pesquisador.
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Disclosures
Os autores não têm qualquer conflito de interesse de divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Dale Hirschkorn partir Systems Research Institute de sangue por sua ajuda com citômetro de fluxo configurações do instrumento. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede HL095470 e U01 HL072268 e contratos DoD W81XWH-10-1-0023 e W81XWH-2-0028.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
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