Summary
Существует много различных методов для измерения внеклеточной пузырьков (EVS) с помощью проточной цитометрии (FCM). Некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использования. Два протокола для измерения электромобилей представлены, используя либо отдельные обнаружения или подход шарик на основе.
Abstract
Внеклеточной Пузырьки (EVS) малы, мембранные, полученных пузырьки, найденные в жидкостях организма, что активно вовлечены в межклеточной коммуникации и помогают регулировать широкий спектр биологических процессов. Анализ электромобилей с помощью проточной цитометрии (FCM) был крайне сложно из-за их небольшого размера и отсутствия дискретных групп населения положительных маркеров, представляющих интерес. Методы EV анализа, в то время как значительно улучшилось за последнее десятилетие, по-прежнему в стадии разработки. К сожалению, нет один-размер-подходит-всем протокол, и некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использования. Здесь представлены несколько различных методов для обработки электромобилей и два протокола для анализа электромобилей с использованием либо индивидуального обнаружения или подход шарик на основе. Методы, описанные здесь, поможет с устранением агрегаты антител обычно встречаются в коммерческих препаратов, увеличение отношения сигнал-шум и настройки ворота в рациональном FАшион, что сводит к минимуму обнаружение фоновой флуоресценции. Первый протокол использует индивидуальный метод обнаружения, который особенно хорошо подходит для анализа большого объема клинических образцов, в то время как второй протокол использует подход шарик на основе захватить и обнаружить более мелкие электромобилей и экзосомы.
Introduction
Внеклеточной Пузырьки (EVS) малы, мембранные, полученных пузырьки, найденные в жидкостях организма, что активно вовлечены в межклеточной коммуникации и помогают регулировать широкий спектр биологических процессов. Анализ электромобилей с помощью проточной цитометрии (FCM) был крайне сложно из-за их небольшого размера и отсутствия дискретных групп населения положительных маркеров, представляющих интерес. Методы EV анализа, в то время как значительно улучшилось за последнее десятилетие, по-прежнему в стадии разработки. К сожалению, нет один-размер-подходит-всем протокол, и некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использования. Здесь представлены несколько различных методов для обработки электромобилей и два протокола для анализа электромобилей с использованием либо индивидуального обнаружения или подход шарик на основе. Методы, описанные здесь, поможет с устранением агрегаты антител обычно встречаются в коммерческих препаратов, увеличение отношения сигнал-шум и настройки ворота в рациональном FАшион, что сводит к минимуму обнаружение фоновой флуоресценции. Первый протокол использует индивидуальный метод обнаружения, который особенно хорошо подходит для анализа большого объема клинических образцов, в то время как второй протокол использует подход шарик на основе захватить и обнаружить более мелкие электромобилей и экзосомы.
Электромобили, также известный как микрочастиц, небольшие, мембранные, полученных пузырьки, найденные в жидкостях организма, которые участвуют в межклеточной коммуникации и помогают регулировать широкий спектр биологических процессов 1. Через экспрессии различных поверхностных маркеров и / или прямой передачи биологического материала, электромобили способны изменить функцию клеток-реципиентов играть либо активации или подавления роль в межклеточной коммуникации 2 - 4. Клинически, тромбоцитарный электромобилей, как известно, имеют сильную антикоагулянтной активностью 5, в то время как другие, как было показано, чтобы способствовать в широком диапазоне условий, от продвижения опухоли metastaSIS 6 к защите от болезней 7. Электромобилей могут быть разделены на более мелкие категории клеток, полученных везикул, такие как экзосом и микропузырьки (MVS), в зависимости от их размера и механизма генерации 8. Номенклатура клеток, полученных субпопуляций пузырьков продолжает оставаться темой продолжающейся дискуссии 8,9, однако, экзосомы как правило, описываются как маленькие, от 40 до 100 нм частицы, полученные из эндосомный слияния с плазматической мембраной, в то время как MVs больше, от 100 до 1000 нм частицы формируется пролития мембраны плазмы 10. Здесь общий термин "электромобилей" будет использоваться для обозначения всех типов внеклеточных биологических везикул, опубликованным клеток.
Выделение электромобилей из цельной крови является многоступенчатой процедуры и многие различные переменные обработки было показано, что повлияет EV содержание, в том числе температуры и продолжительности хранения 11,12, антикоагулянта / консерванта, используемого 13 иМетод центрифугирования используется 14. Необходимость в стандартизации этих переменных привело к рекомендациям Международного общества по изучению тромбозов и обработки крови и выделения EV процедур гемостаза научных и комитет по стандартизации (ISTH SSC) для правильного 15,16, но не существует консенсуса среди исследователей по оптимальной протокола использовать 12. Большинство согласится с тем, однако, что жестким контролем преаналитического переменные имеют решающее значение для точных и воспроизводимых данных.
Для того чтобы проанализировать электромобилей, исследователи использовали различные методы, в том числе просвечивающей электронной микроскопии 17, сканирующей электронной микроскопии 18,19, атомно-силовой микроскопии, динамического рассеяния света 20,21 и Вестерн-блоттинга 22,23. В то время как FCM является методом выбора для многих исследователей 9,24 - 26 из-за его высоких возможностей пропускной способности, анализ электромобилей с использованием ТСМ былкак известно, трудно из-за их размера и отсутствия дискретных положительных населения 27 - 32. По сравнению с анализом клеток, небольшой размер EVs приводит 1) меньше флуоресценции, испускаемой из-за меньшего числа антигенов на частицу, и 2) ограничено осуществимость после промывки пятен, которые необходимо уменьшить фоновой флуоресценции. Общие проблемы среди исследователей относятся сигналы, возникающие в связи с иммуноглобулина агрегатов 27,28 и самоагрегации антител 29. Кроме того, длительное время обработки и длительные процедуры стирки / изоляции, используемый многими из нынешних протоколов 33,34 требуют обязательства времени многодневные анализировать небольшое количество образцов, что делает их менее идеально подходит для применения при высоких пропускную способность. Некоторые исследователи отказаться шаг стирки в целом, оказание традиционно используются ТСМ негативные элементы управления, такие как флуоресценция минус один (FMO) и изотипов антител бесполезной для точной оценки концентрации алкоголя в кровиkground флуоресценции 30.
Наши протоколы решить три общие проблемы, которые могут препятствовать надлежащего анализа ТСМ электромобилей: Сигналы, возникающие на основе агрегатов антител и других не-пузырьков, трудности при удалении несвязанного антитела и отсутствия заметных положительных населения. Методы, описанные здесь, поможет с устранением агрегаты антител обычно встречаются в коммерческих препаратов, увеличение отношения сигнал-шум и настройки ворота в рациональным образом, чтобы минимизировать обнаружение фоновой флуоресценции. Два разных методов обнаружения представлены здесь: Первый протокол использует индивидуальный метод обнаружения, который особенно хорошо подходит для анализа большого объема клинических образцов, в то время как второй протокол использует подход шарики на основе, чтобы захватить и обнаружить более мелкие электромобилей и экзосомы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие протоколы были выполнены в соответствии со всеми институциональном, национальном и международных руководящих принципов для благосостояния человека. Все образцы человеческого субъекта были протестированы в соответствии с этическим комитетом (IRB) -approved протокола и информированного согласия субъектов.
1. МЕТОД: Индивидуальное Метод обнаружения
1.1) переработки крови образца / Изоляция электромобилей
- Нарисуйте кровь из донорской / пациента в двух 10 мл стеклянных пробирок, содержащих 1,5 мл ACD-раствора А или другой подходящий антикоагулянт и процесс немедленно (в течение 30 мин макс), используя следующий протокол дифференциального центрифугирования 2 этапов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол даст примерно 10 мл обедненной тромбоцитами плазмы (РРР) из объединенных ~ 17 мл крови, отобранной. Если более или менее ППС необходимо, количество трубок в крови, собранной может быть соответствующим образом скорректированы. - Центрифуга образцов при 1500 х г в течение 10 мин при комнатной температуреотделить плазму от светлого сгустка крови и эритроцитах. Перевести 1,2 мл аликвоты плазмы супернатанта 1,5 мл центрифужные пробирки, стараясь не потревожить нижние слои, содержащие Баффи пальто и красные клетки.
- Спин при 13000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы удалить тромбоцитов и большие фрагменты клеток. Тщательно передачи PPP, оставив 200 мкл, чтобы не мешать осадок и добавить PPP в новую пробирку.
- На данный момент, используйте PPP немедленно для анализа или передачи в 1,0 мл аликвоты к новым 1,5 мл центрифужные пробирки и хранят при -80 ° С в течение до двух лет для последующего анализа (обратитесь к рисунку 1А для обзора).
- Если очищенные электромобилей необходимы для функциональных экспериментов, передача 6 мл ППС по ультрацентрифужную пробирку и добавить 28 мл 0,2 мкм фильтрованной фосфатно-солевом буфере (PBS). Спин в течение 60 мин при 100000 х г при комнатной температуре с использованием ультрацентрифуги оборудованной ротором Бакет. Отберите супернатант и ресуспендируют EV пикселпусть в 1,5 мл среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения воспроизводимости, образцы крови должны быть обработаны как последовательно, как можно дальше от донора к донору. Любое изменение в методе изоляции EV может существенно повлиять на количество и тип электромобилей обнаружены.
1.2) Подготовка образцов для анализа
ПРИМЕЧАНИЕ: С этой точки зрения, шаги объясняют высокую протокол пропускную способность для анализа 12 образцов для 14 маркеров в 3-панелей. Тем не менее, другие комбинации антител могут быть использованы здесь; Протокол может быть адаптирован для изучения других групп EV путем замены предлагаемые маркеров для тех интерес.
- Удалить 12 образцов из морозильной камеры (при хранении при -80 ° С) и оттаивания при 37 ° С.
- Пипеток содержание вверх и вниз несколько раз перемешать. Удалить 320 мкл из каждого образца и добавить в верхнем ряду 96-луночного планшета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Регулируемый по ширине многоскважинных пипетки является чрезвычайно полезным для этого и многих других шагов по всей задницеай, особенно при анализе нескольких образцов сразу.
1,3) Образцы Окрашивание EV
- Перед окрашиванием, фильтровать все антитела (ABS), чтобы удалить агрегаты, которые могут вызвать положительные сигналы.
- Комбинирование антитела, которые будут использоваться в каждом из 3 панелей на отдельные 0,22 мкм центробежных труб фильтров и центрифуг с использованием фиксированным углом одной скорости центрифуги (~ 750 мкг) при КТ в течение 2 мин, или пока все смеси AB не прошел через фильтр и ни антитела жидкость не остается на поверхности фильтра. Магазин Ab коктейли в холодильнике до двух недель, но повторно фильтр каждый раз перед использованием.
- Добавить соответствующее количество отфильтрованной Ab смеси в каждую лунку в строке 2 (например, образцы в панели ввода окрашивают 2 мкл каждого AB, так в общей сложности 12 мкл фильтрованного Ab коктейль добавляют в каждую лунку к строке 2). Обратитесь к рисунку 1В для контура предложенной пластины карте. Повторите эти дополненияс к строкам расположенной ниже, если больше панели запуска (здесь, добавьте 8 мкл / лунку коктейля Группа II к строке 3 и 11 мкл / лунку коктейля Группа III в строке 4, см список материалов для конкретной информации панели).
- Использование многоканального пипетки, перемешать образцы ГЧП в строке 1 вверх и вниз и передать 100 мкл из скважин в строке 1 в лунки ряда 2. Смешайте вверх и вниз. Изменить советы и повторяю, передача 100 мкл из ряда 1 к строкам 3 и 4. инкубировать при 4 ° С в течение 30 мин.
1,4) Стиральная М.В. Образцы
- Удалить 96-луночного планшета от 4 ° C и трансфер в кабинете биологической безопасности. Используя многоканальную пипетку, добавьте 220 мкл PBS / лунку в строках 6-8 (который будет использоваться для промывки / промывки лунок, содержащих окрашенных PPP).
- Передача содержимого каждой лунки с заранее помечены центробежных труб фильтра с использованием ширины регулируемой многоканального пипетки (для 12 образцов с 3 панелей антител, 12 х 3 = 36 фильтр трубы будутпотребуется). Использование одних и тех же советов, удалить 200 мкл PBS от стирки строк и добавить к соответствующим скважин, из которых PPP был только что удалили.
- Смешайте вверх и вниз, чтобы ополоснуть скважин и передать промывочный раствор тех же фильтров, которые РРР ранее добавленных. Закрыть вершины центробежных фильтров. Изменить советы.
- Повторите этот процесс с остальными окрашенных образцов, пока все окрашенные образцы ППС не были переданы вместе с их промывки решений центробежных фильтров.
- Передача центробежные фильтры с фиксированной ротора центрифуги и спина при 850 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что жидкость не остается на вершинах фильтра. После центрифугирования, фильтр должен оказаться "сухой" без видимых слой жидкости оставаясь на вершине. Хотя это маловероятно, некоторые образцы ГЧП может потребоваться больше времени, центрифугирования эффективно двигаться через фильтр. - Удалить центробежные трубы фильтра и вернуться к бокса биологической безопасности.Использование многоканального пипетки, ресуспендируют вершины фильтров в 300 мкл PBS. Трансфер ресуспендированные содержимое, предварительно промаркированные пробирки для немедленного анализа ТСМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важно сохранить силы и количества пипетки плунжерных депрессий в соответствии среди образцов, чтобы избежать образца к образцу изменения. Это должно быть сделано в идеале с использованием электронной пипетки, который был запрограммирован, чтобы пипетки вверх и вниз определенного объема (например, 280 мкл) точное число раз (например, в 8 раз) в течение каждого образца.
1.5) Цитометр Setup
- Откройте программное обеспечение ТСМ. До экспериментировать установки, выполнять ежедневную калибровку прибора и настройки с помощью установки прибора бусы (следуя инструкциям изготовителя).
- Если образцы EV были окрашены более чем одного антитела и несколько флуорохромы, измеряются одновременно, вычисление значений компенсаций следующим образом:
- Добавить 2 капли компенсации бисером предварительномеченных трубы (1 пробирку для каждого флюорохром-конъюгированных антител) и добавить рекомендуемое количество антител. Добавить 2 капли негативных бисером компенсации в другую пробирку, чтобы использовать в качестве неокрашенных контроля компенсации.
- Выдержите при 4 ° С в течение 30 мин, смойте PBS и ресуспендируют в 400 мкл PBS.
- Использование цитометра Программное обеспечение в комплекте с прибором, запустить каждый компенсации трубку и настроить люминесцентные напряжения поместить каждую вершину примерно в 10 4 на логарифмической шкале 5 десятилетия. Убедитесь, что пик флуоресценции высокий (яркие) в своем собственном флуоресцентного канала по сравнению со всеми другими каналами и регулировки напряжения флуоресцентных параметров снова, если это необходимо. Запустите каждую отдельно окрашенных комп трубку и захватить по крайней мере 5000 событий в трубке.
- Выберите вкладку "Эксперимент", затем выберите "Компенсация", затем выберите "Рассчитать Компенсация", чтобы применить значения коррекции для всех образцов.
- Во время работы трубку 0,22 мкм фильтрованной PBS, отрегулируйте напряжение FSC и SSC к высшим ценностям, которые исключают большинство фонового шума (т.е., чуть ниже порога напряжения, при котором частота событий превосходит 5 события / с).
- Далее, запустите в пробирку, содержащую 0,2 мкм - 1,0 мкм бусы, разбавленные в PBS в случае необходимости. В ФТС против SSC участка, нарисуйте ворота вокруг населения борта для захвата событий от 0,2 мкм и 1,0 мкм. Кроме того, в гистограмме SSC-H, нарисуйте ворота относятся все события меньше, чем бисера 1,0 мкм.
- Указан расход цитометр на "Lo" (примерно 8-12 мкл / мин). Использование шариков трубки (или другой трубки, содержащей известную концентрацию шариков) не регулировать расход диск на цитометр до наканунеNT ставка достигает примерно 200 мероприятий / сек. Read все образцы трубки с той же скоростью потока и использовать такую же концентрацию шарик в будущих экспериментов обеспечить, чтобы скорость потока остаются неизменными между запусками.
- Запустите трубку радужных частиц люминесцентных разводят в PBS. Приобретать 5000 событий. Запишите средние значения интенсивности для ФСБ, SSC, и каждый цветовой канал. Используйте эти значения для регулировки напряжения в будущих экспериментах чтобы гарантировать, что интенсивность флуоресценции остаются неизменными от эксперимента к эксперименту.
1.6) чтение образца
- Указан расход цитометр на "Lo" (примерно 8-12 мкл / мин) и запустить каждый образец для точности 1 или 2 мин.
- После первого чтения, добавить 20 мкл 10% NP-40 для каждого образца, пипетки вверх и вниз, и перечитал за тот же промежуток времени (1 или 2 мин), чтобы обеспечить вычитания положительных событий, обнаруженных в лизируют отбора проб в течение равного времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень импortant, что образцы будут смешаны с помощью пипетки, а не вихрь. По нашему опыту, вихревание может привести к самоагрегации некоторых антител, что приводит к EV, имитирующие позитивных событий. - После того, как все образцы были прочитаны, экспорт все .fcs файлов в отдельном файле, которые будут использоваться для дальнейшего анализа с помощью программного обеспечения FCM анализа.
1.7) Анализ данных
- Откройте программное обеспечение ТСМ анализа. Импорт всех файлов .fcs в новый файл эксперимента.
- Откройте бусы только трубки. В FSC-A против SSC-сюжет, нарисовать ворота вокруг все шарики размером от 0,2 мкм и 1,0 мкм. Это EV ворота. Перетащите, чтобы добавить ко всем пробам.
- Использование лизированных образцов в качестве отрицательного контроля, сделать ворота на краю фоновой флуоресценции в каждом канале флуоресценции, используемой. Перетащите люминесцентные ворота в EV ворот каждого соответствующего не-лизируют образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе также полезно изучить двойные люминесцентные участки би-параметров. Ракетные формы вдважды положительном квадранте (рисунок 8), особенно, если маркеры, как известно, находятся на неродственных типов клеток, может свидетельствовать о артефакта от агрегации или других пузырьков имитирующие событий. - Для каждого флуоресцентным маркером, вычесть количество событий в лизированных образца из числа событий в не-лизируют образца. Возможно, разделить это число на общее количество электромобилей в не-лизируют EV ворот, чтобы получить% положительных значений.
2. Способ B: шарики Способ
2.1) переработки крови образца / Изоляция электромобилей
- См способа обработки крови, описанной в способе А (раздел 1.1).
2.2) Подготовка образцов для анализа
- При желании, фракционирования PPP или ультрацентрифугируют электромобилей в экзосом и микровезикул. Добавить 250 мкл PPP или ультрацентрифугируют электромобилей 0,22 мкм центробежных фильтров и трансфер в фиксированной ротора центрифуги и спина в 750 хг в течение 2 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что жидкость не остается на вершинах фильтра. После центрифугирования, фильтр должен оказаться "сухой" без видимых слой жидкости оставаясь на вершине. Хотя это маловероятно, некоторые образцы могут потребовать несколько больше времени центрифугирования для жидкости для эффективного перемещения через фильтр. - Вымойте без покрытия 6 мкм шариков из пенополистирола (например, отрицательные бисер ABC) 2x с RPMI СМИ и ресуспендируют в 2 мл. Добавить 6000 бусы к каждому FACS трубы. К отрицательным трубки управления, добавить 400 мкл RPMI СМИ одиночку бисера. Для всех других труб, добавить 200 мкл PPP или ультрацентрифугируют электромобилей (или их фракций) и 200 мкл RPMI СМИ.
- Регулировка конечного объема всех труб в 400 мкл со средствами массовой информации и инкубировать в течение ночи при 4 ° С на качалке.
- Следующим утром, вымойте бусы с 2 мл среды. Аспирируйте надосадочную.
- Блок 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в средствах массовой информации (400 мкл) в течение 3 ч при 4 &# 176; С на качалке.
- Вымойте бисер с 2 мл среды. Отберите и ресуспендируют осадок в 100 мкл среды.
2,3) Окрашивание EV Образцы
- Фильтровать все антитела. Использовать одни и те же антитела панелей, используемых в способе A, или, если желательно, создавать различные комбинации антител тех пор, пока их флуорохромы совместимы друг с другом.
- Сочетают в себе все антитела, которые будут использоваться в одной панели в центробежным фильтром трубы 0,22 мкм. Центрифуга с использованием фиксированным углом одного скорости центрифуги в течение 2 мин, или пока все смеси Ab прошло через фильтр и не антитела жидкость не остается на поверхности фильтра.
- Добавить соответствующий объем отфильтрованной коктейль антитела во все пробирки и инкубируют в течение 30 мин при 4 ° С.
- Вымойте бисер с 2 мл среды, ресуспендируют в 400 мкл среды и запустить сразу (или в тот же день) на проточной цитометрии.
2.4) Цитометр настройки и чтение образца
- Откройте программное обеспечение ТСМ. До экспериментировать установки, выполнять ежедневную калибровку прибора и настройки с помощью установки прибора бусы (следуя инструкциям изготовителя).
- Если образцы EV были окрашены более чем одного антитела и несколько флуорохромы, измеряются одновременно, вычисление значений компенсаций следующим образом:
- Добавить 2 капли компенсации бисером предварительно промаркированные пробирки (1 пробирку для каждого флюорохром-конъюгированных антител) и добавьте рекомендованное количество антител. Добавить 2 капли негативных бисером компенсации в другую пробирку, чтобы использовать в качестве неокрашенных контроля компенсации. Выдержите при 4 ° С в течение 30 мин, смойте PBS и ресуспендируют в 400 мкл PBS.
- Использование программного обеспечения FCM, запустить каждый компенсации трубку и регулировки напряжения флуоресцентные разместить каждый пик приблизительно при 10 4 в логарифмическом масштабе 5-лет. Убедитесь, что пик флуоресценции высокий (яркие) в своем собственном флуоресцентного канала по сравнению со всеми другими каналами инастроить напряжения флуоресцентных параметров снова, если это необходимо. Запустите каждую отдельно окрашенных комп трубку и захватить по крайней мере 5000 событий в трубке.
- Выберите вкладку "Эксперимент", затем "возмещение", затем "Рассчитать Компенсация", чтобы применить значения коррекции для всех образцов.
- Изменение FSC и параметры SSC напряжения для входа масштаб и выбрать самые низкие пороговые значения, разрешенные цитометром (FSC = 200 и SSC = 200) для каждого.
- Запуск образцы, ворота на население синглетного бисером и приобрести 2000 событий в эти ворота. Экспорт .fcs файлы.
- Использование программного обеспечения FCM анализа для анализа .fcs файлов. Ворота на синглетными бисером. Вычислить среднее геометрическое интенсивность флуоресценции (MFI) для каждого флуорохромом и сравнить с MFI отрицательного контроля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 описывает общую схему обработки для выделения и обнаружения электромобилей, используя либо метод шарик на основе или индивидуальный метод обнаружения. Индивидуальный обнаружения электромобилей с использованием FCM работает хорошо для анализа больших электромобилей, но большинство цитометры не способны индивидуально обнаружения частиц размером экзосом. Шарик подход позволяет малым электромобилей, которые будут обнаружены, однако, существуют недостатки, связанные с использованием этого метода, как указано в таблице 1. Как правило, изоляция электромобилей с использованием ультрацентрифугирования (с или без добавления сахарозы процедуры фракционировани в градиенте) является рекомендуется при электромобилей необходимы для функциональных анализов. Ультрацентрифугирование удаляет загрязнения, включая сывороточных белков и других растворимых загрязняющих веществ из плазмы, которые могут повлиять на функциональные экспериментальных результатов. Тем не менее, ультрацентрифугирование занимает много времени и может изменить количество эВ и качество 12.
"> Ожидаемые результаты для двух анализов обнаружения изображены на рисунках 2-3. Для индивидуального анализа обнаружения, лизируют управления (нижний ряд, рис 2) используется для установки ворот для соответствующего не-лизированных образца (верхний ряд, Фигурное 2). Большинство мероприятий должны подпадать под EV ворот. Quadrant ворота не должны раскрывать двойные положительные события, когда два маркера в сравнении обычно не найти на той же клетке. Правильные biparameter участки на рисунке 2 показаны маркеры CD108a и CD235a , которые являются двумя красные маркеры клеток крови, как известно, существовать в клетках. Здесь, на электромобилей, более половины положительных событий положительны для обоих маркеров, как и ожидалось. Таким же образом, клеточные поверхностные маркеры, известные находятся на одной и той же клетке должно показывают, что аналогичные модели двойного положительности на электромобилей. В центре biparameter графики показывают EV выражение двух маркеров, которые, как известно, не сосуществовать на клетки. В этом анализе CD235a (красный Blood маркер клеток) и CD41a (маркер тромбоцитов), то электромобилей отчетливые, отдельный, положительные населения, которые, как ожидается, так как они приходят из разных типов клеток. Когда лизируют положительные события должны исчезнуть. В общем, какие-то позитивные события, оставшиеся после лизиса указывают на наличие сигнала, поступающего от не-пузырьков частиц, агрегатов и / или моющих устойчивостью электромобилей. Рисунок 3 показывает ожидаемые результаты, используя метод обнаружения шарик на основе. В отличие от метода индивидуального обнаружения, эти данные не могут / не должны рассматриваться в би-параметров участков. В верхних точек участков, разделения между положительными и отрицательными популяциями не существует, и события появляются в двойных положительных квадрантов, хотя они обычно не встречаются на одних и тех же типов клеток из-за того, что оба типа электромобилей будет связываться с один шарик. Для метода обнаружения борта основе, данные анализировали с использованием лучших гистограммы накладки с отрицательным контролем (изображенной под точечных участков). Позитивность яс, измеренную при помощи MFI маркера (средняя интенсивность флуоресценции) и по сравнению с непосредственно у отрицательного контроля. Если образец является положительным для маркера в вопросе, его MFI будет выше, чем в отрицательном контроле. Отрицательный контроль за метода бусинок просто шарики блокированные бычьим сывороточным альбумином (не электромобилей не добавлено), которые были окрашивали антителами же и промывают вместе с EV покрытием шариков. Сравнение ожидаемых результатов с использованием двух методов можно увидеть на рисунке 4.Возможность индивидуального анализа для обнаружения правильно оценить EV фенотипы в значительной степени зависит от правильного стробирования, чтобы отделить Ab-положительные события из фоновой флуоресценции. Таким образом, очень важно выбрать отрицательный контроль, что наиболее целесообразно имитирует / предсказывает фоновой флуоресценции для данного образца. При окраске электромобилей не мыть перед чтением, широко используется отрицательный контроль (например, изотипы) не точно предсказать фона fluorescencе для всех маркеров (5А). В этих случаях, если мыть не вариант, Лизированные образцы, как правило, лучше работать для прогнозирования фоновой флуоресценции. Тем не менее, при окраске электромобилей промывают перед чтением (с использованием центробежной фильтрации, в данном случае), оба отрицательные контроли (изотипы и лизированные образцы) работают хорошо для предсказания фоновой флуоресценции образца (фиг.5А). Следует, однако, отметить, что, хотя все отрицательные контроли "работа", лизированные управления являются предпочтительными, поскольку они обеспечивают дополнительную информацию о пробе (например, наличие моющих устойчивостью, без пузырьков, связанных с событиями и / или агрегатов), что может привести к не-EV позитивных сигналов и неправильно раздувать рассчитывает AB. Кроме того, контроль изотипа иногда может быть ненадежным, даже в промытых образцов, как показано на фиг.5В, где окрашивали образец меньше положительных событий, чем в том же образце, окрашенном подобранных антител изотипа контроля. Без тщательного удаления несвязанного антитела, FCM точечные участки некоторых EV маркеров почти невозможно интерпретировать, появляясь в виде облаков тускло люминесцентных частиц неотличимы от своих высоко люминесцентных слоев (рис 6, Верхний график). Стиральная окрашенных образцов с помощью центробежных фильтров повышает разделение между фоном и позитивных сигналов маркерных (рис 6, нижний график); Однако, небольшие электромобили и экзосомы могут быть потеряны через поры фильтра.
Использование стадии лизиса детергента показывает положительные, везикул имитирующие события из иммунных комплексов и белковых агрегатов 21. Когда PPP анализируется с помощью индивидуального обнаружения, встречая позитивные события, которые не исчезают при лизиса довольно часто явление. Эти моющие устойчивостью события часто появляются как подозрительные, высоко люминесцентные диагональные сигналы в обоих одного параметра и biparameter участков (Рисунок7). Клинически, эти белковые комплексы и / или нерастворимые иммунные комплексы более распространены у пациентов, страдающих различными заболеваниями 21, таких как ревматоидный артрит 28, нефротический синдром, 19 и системной красной волчанки 29. Таким образом, в зависимости от цели исследования, можно пожелать, чтобы включить или удалить их с пути analysis.Another диагональные сигналы могут образовывать является вихревым образцы, особенно после добавления реактива для лизиса (Рисунок 8). Образцы всегда должны быть смешаны вверх и вниз с помощью пипетки, чтобы предотвратить образование агрегатов.
Рисунок 1: Общая схема обработки для выделения и обнаружения электромобилей с использованием либо метода шарик на основе индивидуального или метод обнаружения. (А) цельной крови сначала обрабатывается в ППС. Отповторно, PPP может быть либо дальнейшей обработки с помощью ультрацентрифугирования для получения изолированных электромобилей или использовать как есть в индивидуальной обнаружения или бортовых основе анализов. (B) Схема предлагаемой карте пластины для анализа проб с высокой пропускной способностью, используя метод индивидуального обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2:. Ожидаемые результаты для отдельных обнаружения проточной цитометрии точечных участков показать представительство окрашивание лизированных и unlysed образцов EV. Значения показывают процент положительных событий. Большинство событий попадают в EV ворот. События, показанные в правой biparameter участков находятся в пределах FSC / SSC EV ворот слева. Лизируют образец (нижний ряд) используется для установки люминесцентные основе ворота для EAч соответствующее (не лизису) образца. Quad ворота не должны раскрывать двойные положительные события, когда два маркера в сравнении обычно не найти на той же клетке. Здесь biparameter CD235a и CD41a график показывает четкое разделение между электромобилей, выражающих красные маркеры клеток крови и тех, выражающих тромбоцитов клеточных маркеров. Кроме того, маркеры клеточной поверхности, как известно, находятся на одной и той же клетке должны показать аналогичные модели двойной положительности на электромобилей. Право biparameter График показывает, что более половины CD235a-положительных электромобилей и положительные для вторичного красных кровяных клеток (эритроцитов), штат CD108a. Когда лизируют положительные события должны исчезнуть. Положительные события, оставшиеся после лизиса указывают на наличие сигнала, поступающего от не-везикулы или моющих устойчивых частиц и / или агрегатов.
Рисунок 3: Ожидаемые результаты, используя обнаружение шарик на основеСпособ. проточной цитометрии точечные графики показывают репрезентативную окрашивание электромобилей в сочетании с гранулами, так как по сравнению с гранулами блокировали БСА, который служит в качестве отрицательного контроля. Значения показывают процент положительных событий. События, показанные в правой biparameter участков находятся в пределах FSC / SSC бисером ворот слева. Для метода обнаружения на основе шариков, данные анализировали с использованием лучших гистограммы накладки с отрицательным контролем (изображенной под точечных участков). Положительность измеряется с помощью MFI маркера (средняя интенсивность флуоресценции) и по сравнению с непосредственно у отрицательного контроля.
Рисунок 4:. Сравнение ожидаемых результатов с использованием шариков vs. индивидуальный обнаружения методом проточной цитометрии точка Графики показывают, представительство окрашивание электромобилей в сочетании с бисером (верхний ряд), по сравнению с электромобилей, анализирующих по индивидуальной обнаружения (нижний ряд). Событийпоказано справа biparameter участки находятся в пределах FSC / SSC бисером ворот слева.
Рисунок 5:. Сравнение различных отрицательных контролей в индивидуальном анализе для обнаружения значения показывают процент положительных событий. События, показанные в пределах ворот FSC / SSC EV. () Сравнение отрицательных контролей в немытой VS. отмытых образцов. Изотип или лизированные управления оценивали по их способности обеспечивать соответствующие признаки фоновой флуоресценции в двух различных маркеров в полностью цветного образца (нижний ряд). Ворота для каждого маркера были сделаны с помощью Лизированные образца (верхний ряд) и затем копируется в строках под. Промытые образцы промывали с помощью пост-пятно фильтрации. (B) Пример образца окрашенных изотипический контроль, имеющих более позитивные события, чем образец окрашивали Wiго фактического антитела.
Рисунок 6:. Влияние после окрашивания мытья в индивидуальном обнаружения значения показывают, проценты и количество положительных событий. События, показанные в пределах ворот FSC / SSC EV. Ворота для каждого образца были сделаны с помощью лизису коллегу каждого образца в (не показан, см предыдущем рисунке для ворот установления в немытыми против отмытых образцов). Высокая фон флуоресценции делает различия позитива от негативных событий трудно (Верхний график). При промывают, однако, положительный населения раскрывается как несвязанные флуоресцентные антитела были удалены, и фон флуоресценции уменьшается (нижний график).
Рисунок 7: моющее средство для лизиса подтверждает наличие не-EV сignals. События, показанные в пределах ворот FSC / SCC EV. Значения показывают процент положительных событий. Витражи образцы EV читали раньше (левая колонка) и после добавления моющего средства (правая колонка) выявлять позитивные сигналы, вызванные иммунными комплексами и других не-EV событий, связанных с.
Рисунок 8: вихревание вызывает появление не-EV сигналов События, показанные в пределах ворот FSC / SCC EV.. Значения показывают процент положительных событий. Витражи образцы EV читали раньше (левая колонка) и после добавления моющего средства (правая колонка). Использование вихрь микшировать может вызвать EV-имитации, диагональные населения, чтобы сформировать (верхний ряд). При смешивании мягко вверх и вниз с помощью пипетки, однако, формирование таких групп может быть избегать (нижний ряд). Вортексе не рекомендуется для смешивания, так как это может привести к агрегации в некоторых образцах, LeaДин к диагональному-появляться, положительные населения. В общем, номер события в позитивном ворота не должны увеличиваться после лизиса.
| Бусы на основе обнаружения | Индивидуальный обнаружения | |
| EV размеры | Рекомендуется для <100 нм | рекомендуется для> 100 нм только |
| Время | требуется инкубацию в течение ночи | может завершить в <1 день |
| Чувствительность | кластер обнаружения | Обнаружение одна частица |
| Результаты | качественный | количественный |
| Мойка | простой, стандартный центрифугирования | требуется центробежные фильтры |
| Отрицательный контроль | Бисер BSA покрытием | Лизированные образцы |
Таблица 1: Плюсы и минусы обоих методов обнаружения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Были представлены два различных протокола для выделения, обработки и анализа электромобилей, используя какой-либо отдельный обнаружения или бисером подход. Выбор наиболее подходящего метода для использования не всегда проста и требует понимания тестируемому образцу, а также отдельных групп населения, представляющих интерес. Кроме того, чувствительность цитометром используется для приобретения, должны быть рассмотрены при выборе наиболее подходящего метода. Часто нет единого оптимального используемый протокол, скорее, сочетание методов предоставляет больше информации о выборке, чем в одиночку либо одним способом. В идеале, несколько различных способов выделения и обнаружения должны быть оценены сначала в целях развития индивидуальный протокол, который учитывает индивида цитометром производительности по отношению к конкретной группе населения EV изучается. Альтернативные методы изоляции включают ультрацентрифугирование, плотности сахарозы фракционирование иммуномагнитный бEAD разделение, хроматография и аффинной очистки 12, в то время как альтернативные методы обнаружения включают сканирующей электронной микроскопии, просвечивающей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, динамического рассеяния света, а западные промокательной 8. Комбинируя различные методы, методы, представленные здесь могут быть адаптированы в целях создания протоколов лучше всего подходит для изучения различных EV населения, представляющих интерес.
В общем, индивидуальный обнаружения электромобилей с использованием FCM работает хорошо для анализа больших электромобилей, но теряет чувствительность, электромобили становятся все меньше. В то время как индивидуальный обнаружения является более последовательным в обнаружении больших электромобилей, обнаружение шарик на основе менее чувствителен для обнаружения больших электромобилей и более чувствительны к экзосом. Большие электромобилей можно мыть легко с помощью пост-пятно фильтрации и обнаружил однократно через ТСМ. Небольшие электромобили и экзосомы, с другой стороны, не обнаружено также индивидуально с помощью ТСМ и гораздо труднее мыть после окрашивание. Шарик захватаПротокол разрешает обе эти проблемы, позволяя электромобилей, чтобы быть легко мыть и несколько электромобилей для измерения вместе, чтобы создать большие позитивные сигналы, обнаруживаемых ТСМ. Тем не менее, есть и недостатки, связанные с использованием этого метода, как указано в таблице 1.
При работе с менее чувствительной цитометром, способность к индивидуальному обнаружения ограничено. Перед анализом EV, чувствительность цитометра должны быть определены с использованием смеси размеров гранул в пределах от 0,1-1,0 мкм. Отказ цитометра, чтобы обнаружить большинство частиц ниже 1,0 мкм потребует использование протокола борта основе. Очень выраженные маркеры легко обнаруживаются с использованием либо протокола. Реже населения иногда легче обнаружить с помощью единого протокола обнаружения частиц, а не протокола захвата шарик, однако, может меняться в зависимости от таких переменных, как: яркость флуорохрома, образец Е. В.: шарик RATIO и размер подшипника EV редкую клеточной поверхности маркер. Обнаружение нескольких маркеров на одной частицы требует использования метода индивидуального обнаружения. Метод шарик на основе не способен индивидуального обнаружения EV. Таким образом, протокол шарик на основе будет получать данные, которые более качественный характер, в то время как метод индивидуального определения даст больше количественных данных.
Дополнительные методы изоляции должны быть использованы, когда электромобилей необходимы для последующих применений. Электромобилей, используемые в функциональных анализах следует ультрацентрифугируют с использованием протокола дифференциальным центрифугированием 3-ступенчатый, так как растворимые белки сыворотки в плазме может повлиять на функциональные экспериментальные результаты. Для характеристики электромобилей, однако, ультрацентрифугирования не рекомендуется, так как это дополнительный этап может повлиять на EV качество и количество из-за высоких сил привитых на частицах 12.
Протокол индивидуальный обнаружения содержит Several ключевые шаги оптимизированы для обеспечения высокой пропускной тестирования, в том числе: 1) осуществление центробежных фильтров для быстрого и эффективного удаления положительных событий, вызванных Ab агрегатов, 2) использование фильтров в качестве более практичной альтернативой ультрацентрифугированию или градиенте сахарозы фракционирования для мытья несвязанного Ab от EV образцов после окрашивания, и 3) использование моющего средства лизиса в качестве отрицательного контроля, который не только показывает положительные события, вызванного использованием электромобилей, но обеспечивает хорошее приближение фоновой флуоресценции отличить позитив от негативных населения для рисования ворота. Протокол отдельные обнаружения рекомендуется, когда большое количество образцов необходимо тестирование, как оно может быть выполнено в течение одного дня, в то время как метод шарика основе требуется инкубации в течение ночи.
Негативные элементы управления в каждой протоколом имеют различные преимущества и недостатки, в зависимости от метода обнаружения используется. Одно из преимуществ использования бортового основе Assay в том, что одни и те же моноклональные антитела могут быть использованы для отрицательных и положительных труб и тот же отрицательный контроль может быть использован для всех образцов. Способ отдельные обнаружения, с другой стороны, требует отдельных элементов управления для чтения для каждого тестируемого образца. Отрицательный контроль используют протокол отдельного обнаружения использует лизируют образцы, которые не требуют использования / потребления дополнительных антител, но требуют, чтобы каждая трубка быть считаны во второй раз после добавления раствор ющим средством. Лизированные управления имеют дополнительное преимущество, которое позволяет определить долю позитивный сигнал, что можно отнести к не-везикулы, связанные с событиями, такими как иммунные комплексы 21. Шарик на основе анализа не обладают этой способностью todistinguish между положительными сигналами, вытекающих из настоящих электромобилей и тех, которые возникают от не-пузырьков.
Ограничения метода
В то время как нет никакого стандартного метода выделения электромобилей, дифференциалцентрифугирование широко используемый метод среди EV исследователей. Способ дифференциальным центрифугированием описано здесь, основаны на общих протоколов для выделения PPP, которые, как правило, требуют начального центрифугирования между 1200-1500 мкг в течение 10-20 мин для удаления клеток, за которым следует второй центрифугированием между 10,000-13,000 мкг в течение 10-30 мин удалить тромбоцитов 35. Протокол описано здесь используется центрифугирования при 1500 х г в течение 10 мин с последующим центрифугированием при 13000 х г в течение 10 мин. В то время как высшие силы 25000-100000 мкг обычно требуется для осаждения электромобилей, некоторые из самых больших электромобилей могут быть удалены с дифференциального центрифугирования протокола мы представили.
До 90% от электромобилей, обнаруженных FCM теряются с одного часа ультрацентрифугирования при 100000 х г (данные не показаны). Более длительное время центрифугирования следует рассматривать, хотя и осторожно, так как это может негативно повлиять на состав образца. Если дополнительная обработка необходима Fили характеристика исследования, фильтрация может выполняться после 2-стадии центрифугирования (до окрашивания) для дальнейшего фракционирования образцов на основе размера частиц. Как и в ультра-центрифугирования, фильтрации может привести к потере до 50% положительных событий маркеров и до 90% от общего объема частиц, обнаруженных FCM (данные не показаны). В то время как увеличение отношения сигнал-шум имеет очевидную пользу, потеря мелких электромобилей представляет собой существенное ограничение при рассмотрении любого метода стиральной или изоляции.
Наконец, антикоагулянт используется (например, гепарин, ACD, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и т.д.) во время сбора крови может повлиять на качество и количество контента EV. В то время как ACD оказался хороший и надежный антикоагулянт для наших исследований, тестирования нескольких решений рекомендуется убедиться, что наиболее подходящим антикоагулянтом для применения выбран. Это особенно важно, когда электромобили будут использоваться в последующих анализахгде антикоагулянт используется, может повлиять на исход. Например, некоторые антикоагулянты (например, ЭДТА и гепарин), как известно, мешают ПЦР-реакций, тогда как другие (например, теофиллин, аденозин и дипиридамол), как было показано, чтобы ингибировать высвобождение из EV тромбоцитов 12.
Методы EV анализа, в то время как значительно улучшилось за последнее десятилетие, по-прежнему в стадии разработки. В конечном счете, лучшие методы для анализа электромобилей будет зависеть от исследований, проводимых и инструментов, доступных для исследователя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никакого конфликта интересов раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Дейл Hirschkorn от кровеносной систем научно-исследовательского института за помощь в проточной цитометрии настройки прибора. Эта работа была поддержана NIH предоставляет HL095470 и U01 HL072268 и МО контракты W81XWH-10-1-0023 и W81XWH-2-0028.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
- Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
- Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
- Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
- Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
- Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
- Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
- Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
- Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
- Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
- Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
- Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
- György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
- György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
- Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
- Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).
