Summary
Många olika metoder finns för mätning av extracellulära vesiklar (EVT) med användning av flödescytometri (FCM). Flera aspekter bör beaktas vid fastställandet av den lämpligaste metoden att använda. Två protokoll för mätning elbilar presenteras, antingen enskilt upptäckt eller en pärla baserat tillvägagångssätt.
Abstract
Extracellulär Blåsor (EVS) är små, membran härledda vesiklar som finns i kroppsvätskor som är mycket engagerade i cell-cellkommunikation och hjälper till att reglera ett varierat utbud av biologiska processer. Analys av elbilar använder flödescytometri (FCM) har varit notoriskt svårt på grund av sin ringa storlek och brist på diskreta populationer positiva för markörer av intresse. Metoder för EV analys, medan betydligt förbättrats under det senaste årtiondet, är fortfarande ett pågående arbete. Tyvärr, det finns ingen one-size-fits-all protokoll, och flera aspekter måste beaktas vid bestämning av lämpligaste metoden att använda. Presenteras här finns flera olika tekniker för bearbetning elbilar och två protokoll för att analysera elbilar använder antingen enskilt upptäckt eller en pärla baserat tillvägagångssätt. De metoder som beskrivs här kommer att hjälpa till med att eliminera de aggregat antikropps vanliga i kommersiella beredningar, ökar signal-brusförhållande, och inställningsgrindar i en rationell fashion som minimerar detektering av bakgrundsfluorescens. Den första protokollet använder en individuell detektionsmetod som är särskilt väl lämpad för att analysera en stor mängd kliniska prover, medan den andra protokollet använder en pärla baserad metod för att fånga och upptäcka mindre elbilar och exosomes.
Introduction
Extracellulär Blåsor (EVS) är små, membran härledda vesiklar som finns i kroppsvätskor som är mycket engagerade i cell-cellkommunikation och hjälper till att reglera ett varierat utbud av biologiska processer. Analys av elbilar använder flödescytometri (FCM) har varit notoriskt svårt på grund av sin ringa storlek och brist på diskreta populationer positiva för markörer av intresse. Metoder för EV analys, medan betydligt förbättrats under det senaste årtiondet, är fortfarande ett pågående arbete. Tyvärr, det finns ingen one-size-fits-all protokoll, och flera aspekter måste beaktas vid bestämning av lämpligaste metoden att använda. Presenteras här finns flera olika tekniker för bearbetning elbilar och två protokoll för att analysera elbilar använder antingen enskilt upptäckt eller en pärla baserat tillvägagångssätt. De metoder som beskrivs här kommer att hjälpa till med att eliminera de aggregat antikropps vanliga i kommersiella beredningar, ökar signal-brusförhållande, och inställningsgrindar i en rationell fashion som minimerar detektering av bakgrundsfluorescens. Den första protokollet använder en individuell detektionsmetod som är särskilt väl lämpad för att analysera en stor mängd kliniska prover, medan den andra protokollet använder en pärla baserad metod för att fånga och upptäcka mindre elbilar och exosomes.
Elbilar, även känd som mikropartiklar, är små, membran härledda vesiklar som finns i kroppsvätskor som är involverade i cell-cellkommunikation och hjälper till att reglera ett varierat utbud av biologiska processer 1. Genom uttryck av olika ytmarkörer och / eller direkt överföring av biologiskt material, elbilar kan ändra funktionen hos mottagarceller för att spela antingen aktivera eller undertrycka roller i kommunikationen mellan 2-4. Kliniskt, elbilar trombocytrelaterade är kända för att ha en stark antikoagulerande aktivitet 5, medan andra har visat sig bidra till ett brett spektrum av förhållanden, från att främja tumör metastasis 6 att skydda mot sjukdomar 7. Elbilar kan delas in i mindre grupper av celler erhållna vesiklar såsom exosomes och mikrovesiklar (MV), beroende på deras storlek och mekanismen för generering 8. Nomenklaturen för-cellerna vesikler subpopulationer fortsätter att vara ett ämne för pågående debatten 8,9 dock exosomes generellt beskrivs som små, 40 till 100 nm partiklar härrörande från endosomal fusion med plasmamembranet, medan MV är större 100 till 1.000 nm partiklar som bildas genom att kasta av plasmamembranet 10. Här kommer den allmänna termen "elbilar" användas för att hänvisa till alla typer av extracellulära biologiska vesiklar släpptes av celler.
Isolering av elbilar från helblod är ett förfarande i flera steg och många olika behandlingsvariabler har visats påverka EV innehåll, inklusive lagringstemperatur och varaktighet 11,12, antikoagulantia / konserveringsmedel som används 13 ochcentrifuge metod som används 14. Ett behov av standardisering av dessa variabler har lett till rekommendationer från International Society om Thrombosis and Haemostasis Vetenskapliga och standardiseringskommitté (ISTH SSC) för korrekt bearbetning blod och EV isoleringsförfaranden 15,16, men det finns ingen enighet bland forskare om den optimala protokollet att använda 12. De flesta är dock överens om att hårt kontrollerade pre-analytiska variabler är avgörande för exakta och reproducerbara data.
För att analysera elbilar, har forskarna utnyttjat olika metoder, inklusive transmissionselektronmikroskopi 17, svepelektronmikroskopi 18,19, atomkraftsmikroskopi, dynamisk ljusspridning 20,21 och western blotting 22,23. Medan FCM är metoden för många forskare 9,24 - 26 på grund av dess höga genomströmning kapacitet, har analyser av elbilar använder FCM varitnotoriskt svårt på grund av sin storlek och brist på diskreta positiva befolknings 27-32. Jämfört med analys av celler, till den lilla storleken hos EVS resulterar i en) mindre fluorescens som emitteras på grund av det färre antal antigen per partikel och 2) begränsad genomförbarhet av post-fläck tvättning, vilket är nödvändigt minska bakgrundsfluorescens. Gemensamma utmaningar bland forskare inkluderar signaler som härrör från immunglobulinaggregat 27,28 och själv aggregering av antikroppar 29. Dessutom de långa handläggningstider och långa tvätt / isoleringsförfaranden som används av många av de nuvarande protokollen 33,34 kräver flerdagars tid åtaganden för att analysera ett litet antal prover, vilket gör dem mindre än idealisk för hög genomströmning applikationer. Vissa forskare avstå ett tvättsteg helt och hållet, vilket gör traditionellt används FCM negativa kontroller såsom fluorescens minus ett (FMO) och antikroppsisotyper värdelös för exakt bedöma background fluorescens 30.
Våra protokoll upp tre vanliga problem som kan hindra ett korrekt FCM analys av elbilar: signaler som härrör från aggregat antikropps och andra icke-vesikler, svårt att ta bort obunden antikropp, och brist på både positiva befolkningar. De tekniker som beskrivs här kommer att hjälpa till med att eliminera de aggregat antikropps vanligen återfinns i kommersiella preparat, ökar signal-till-brusförhållande, och att sätta grindar på ett rationellt sätt som minimerar detektering av bakgrundsfluorescens. Två olika detektionsmetoder presenteras här: den första protokollet använder en individuell detektionsmetod som är särskilt väl lämpad för att analysera en stor mängd kliniska prover, medan den andra protokollet använder ett pärlor baserad strategi för att fånga och upptäcka mindre elbilar och exosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Följande protokoll har utförts i enlighet med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för mänsklig välfärd. Alla humana ämnesprover testades under en institutionell översyn ombord (IRB) -godkänd protokoll och med informerat samtycke av försökspersonerna.
1. METOD A: Individuell Detection Method
1.1) Behandling av blodprov / Isolering av elbilar
- Dra blod från donator / patienten i två 10 ml glasrör innehållande 1,5 ml ACD-lösning A eller annan lämplig antikoagulant och processen omedelbart (inom 30 min max) med användning av följande två-stegs differentiell centrifugering protokoll.
OBS: Detta protokoll kommer att ge ca 10 ml trombocytfattig plasma (PPP) från de kombinerade ~ 17 ml blod dras. Om mer eller mindre PPP behövs, kan antalet av rör med blod uppsamlat justeras därefter. - Centrifugera proverna vid 1500 xg under 10 min vid RTatt separera plasma från buffy coat och röda blodkroppar. Överför 1,2 ml portioner av plasma supernatanten till 1,5 ml centrifugrör, försiktigt så att inte störa bottenlagren innehåller lättcellskoncentratet och röda blodkroppar.
- Spin vid 13.000 xg under 10 min vid RT för att avlägsna trombocyter och stora cellfragment. Försiktigt överföra PPP, lämnar bakom 200 l för att undvika att störa pelleten och lägga PPP till ett nytt rör.
- Vid denna punkt, använd PPP omedelbart för analys eller överföring i 1,0 ml portioner till nya 1,5 ml centrifugrör och förvara vid -80 ° C i upp till två år för senare analys (se Figur 1A för översikt).
- Om renade elfordon behövs för funktionella experiment, överförings 6 ml av PPP till ett ultracentrifugrör och tillsätt 28 ml 0,2 | im-filtrerad fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Spin för 60 min vid 100.000 xg vid RT med användning av en ultracentrifug utrustad med en svängande hink rötor. Aspirera supernatanten och återsuspendera EV pelLåt i 1,5 ml medium.
OBS: För högsta reproducerbarhet, bör blodprov behandlas så konsekvent som möjligt från givare till donator. Alla variationer i EV isoleringsmetod kan avsevärt påverka antalet och typen av elbilar upptäckts.
1.2) Förbereda Prover för analys
OBS: Från och med nu, de steg förklarar en hög genomströmning protokoll för analys 12 prover för 14 markörer i 3 paneler. Emellertid kan andra kombinationer av antikroppar användas här; protokollet kan anpassas för att studera andra EV populationer genom att ersätta de föreslagna markörerna för de av intresse.
- Avlägsna 12 prover från frysen (om den förvaras vid -80 ° C) och tining vid 37 ° C.
- Pipette innehållet upp och ner flera gånger för att blanda. Ta 320 pl från varje prov och lägga till den översta raden i en 96 brunnar.
OBS: En bredd-inställbar flera brunnar pipett är till stor hjälp för detta och många andra steg i hela rövenay, särskilt vid analys flera prover på en gång.
1.3) Färgning EV Prover
- Före färgning, filtrera alla antikroppar (Abs) för att avlägsna aggregat, vilket kan orsaka positiva signaler.
- Skörde antikroppar som skall användas i var och en av de tre panelerna i separata 0,22 um centrifugal filterrör och centrifug med användning av en fast vinkel enda hastighet centrifug (~ 750 x g) vid RT under 2 minuter, eller tills all Ab blandningen har passerat genom filtret och ingen antikropp vätska kvar på ytan av filtret. Förvara Ab drinkar i kylskåpet i upp till två veckor, men återfiltret varje gång före användning.
- Tillsätt en lämplig mängd filtrerad Ab blandning till varje brunn i rad 2 (t.ex. prover i panelen Jag är färgade med 2 pl av varje Ab, så totalt 12 pl av den filtrerade Ab cocktail läggs per brunn till rad 2). Se figur 1B för en översikt av den föreslagna plattkartan. Upprepa dessa tilläggs till raderna nedanför om fler paneler körs (här, lägg 8 l / brunn av Panel II cocktail till rad 3 och 11 l / brunn av Panel III cocktail till rad 4, se Materiallista för specifik information panel).
- Använda flerkanalig pipett, blanda proverna PPP i rad 1 upp och ner och överför 100 pl från brunnarna i rad 1 till brunnarna i rad 2. Blanda upp och ner. Ändra tips och upprepa, överföra 100 l från rad 1 till rad 3 och 4. Inkubera vid 4 ° C under 30 minuter.
1,4) Tvättning MV Prover
- Ta bort 96-brunnar från 4 ° C och transfer till biologisk säkerhet skåp. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 220 ul PBS / brunn till raderna 6-8 (att användas för sköljning / tvättning av brunnarna innehållande målat PPP).
- Överför innehållet i varje brunn för pre-märkta centrifugala filterrör använder bredden justerbara flerkanalig pipett (För 12 prover, med 3 paneler av antikroppar, 12 x 3 = 36 filterrör kommerbehövas). Med samma tips, ta bort 200 l av PBS från tvättraderna och lägga till motsvarande brunnar från vilka PPP var bara bort.
- Blanda upp och ner för att skölja brunnarna och överför skölj lösningen till samma filter till vilket PPP tidigare lagt. Stäng toppar centrifugalfilter. Ändra tips.
- Upprepa denna process med de återstående färgade prover tills alla prover färgade PPP har överförts tillsammans med sina sköljlösningar till centrifugalfilter.
- Överför centrifugalfilter till ett fast centrifugrotor och centrifugera vid 850 xg under 3 min vid RT.
OBS: Se till att ingen vätska kvar på filter tops. Efter centrifugering, bör filtret verkar vara "torr" med ingen synlig vätskelager kvar ovanpå. Även osannolikt, kan vissa prover PPP kräver längre centrifuge tid att effektivt gå genom filtret. - Avlägsna de centrifugala filterrör och återgå till den biologiska säkerhetsskåp.Använda flerkanalig pipett, resuspendera toppar av filtren i 300 fil PBS. Överför resuspenderade innehållet till redan märkta rör för omedelbar FCM-analys.
OBS: Det är mycket viktigt att hålla den kraft och antalet pipett kolv fördjupningar konsekventa bland prover för att undvika prov till prov variation. Detta bör helst göras med en elektronisk pipett som har programmerats för att pipettera upp och ner en specifik volym (t.ex. 280 pl) en exakt antal gånger (t.ex. åtta gånger) för varje prov.
1.5) Cytometer Setup
- Öppna FCM programvaran. Före experimentera installationen, utföra dagliga instrumentkalibrering och inställning med instrumentinställnings pärlor (efter tillverkarens instruktioner).
- Om EV prover har målat med mer än en antikropp och flera fluorokromer är att mätas på en gång, beräkna kompensationsvärden enligt följande:
- Tillsätt 2 droppar ersättnings pärlor till pre-märkta rör (1 rör för varje fluorokromkonjugerade antikropp) och lägg den rekommenderade mängden antikroppar. Tillsätt 2 droppar negativa ersättnings pärlor till ett annat rör som ska användas som ofärgade kompensationsstyrning.
- Inkubera vid 4 ° C under 30 minuter, tvätta med PBS och återsuspendera i 400 fil PBS.
- Använda flödescytometerns programvaran som följer med instrumentet, kör varje kompensationsröret och justera fluorescerande spänningar att placera varje topp vid ungefär 10 4 på en 5-decennium logskala. Se till att fluorescenstopp är högst (ljusast) i sin egen fluorescerande kanal jämfört med alla andra kanaler, och justera spänningar av fluorescerande parametrar igen om det behövs. Kör varje individuellt färgade comp röret och fånga minst 5.000 händelser per rör.
- Välj fliken "Experiment", välj sedan "Ersättning" och välj sedan "Beräkna Ersättning" att tillämpa kompensationsvärden för alla prover.
- När du kör en tub med 0,22 um-filtrerad PBS, justera FSC & SSC spänningar till de högsta värdena som utesluter de flesta bakgrundsljud (dvs strax under spänning tröskel vid vilken händelse takt träffar fem händelser / sek).
- Därefter kör ett rör innehållande 0,2 um - 1,0 um pärlor, utspädda i PBS vid behov. I en FCS mot SSC plot, rita en grind runt pärlan befolkningen att fånga händelser mellan 0,2 pm och 1,0 pm. Alternativt, i ett SSC-H histogram, rita en grind för att inkludera alla händelser mindre än 1,0 um pärlor.
- Ställ cytometern s flödeshastigheten till "Lo" (ca 8-12 | j, l / min). Använda pärlor röret (eller annat rör innehållande en känd koncentration av kulor) justera flödet ratten på cytometern tills straxnt takt når cirka 200 evenemang / sek. Läsa alla provrör med samma flödeshastighet och använda samma pärla koncentrationen i framtida experiment för att se till att flödena förblir konsekvent mellan körningarna.
- Kör ett rör av regnbåge fluorescerande partiklar utspädda i PBS. Förvärva 5.000 evenemang. För in genomsnittsintensitetsvärdena för FSC, SSC, och varje färgkanal. Använd dessa värden för att justera spänningar i framtida experiment för att se till att fluorescensintensiteter förblir konsekvent mellan experiment.
1.6) Prov Läsning
- Ställ cytometern s flödeshastigheten till "Lo" (ca 8-12 | j, l / min) och kör varje prov för exakt en eller två minuter.
- Efter den första behandlingen, tillsätt 20 | il av 10% NP-40 till varje prov, pipett upp och ner, och åter läsa för samma mängd tid (antingen 1 eller 2 min) för att medge subtraktion av positiva händelser som upptäcks i det lyserade provet över lika tidsramen.
OBS: Det är mycket important att proven blandas med användning av en pipett i stället för en virvel. Enligt vår erfarenhet kan virvel orsaka själv aggregering av vissa antikroppar, vilket leder till EV-härma positiva händelser. - När alla prover har läst, export alla .fcs filer till en separat fil som ska användas för vidare analys med hjälp FCM analysprogram.
1.7) Data Analysis
- Öppna FCM analysprogram. Importera alla .fcs filer till ett nytt experiment fil.
- Öppna pärlor enbart röret. I FSC-A mot SSC-En tomt, rita en grind runt alla pärlor dimensionerade mellan 0,2 pm och 1,0 pm. Detta är den EV grind. Dra för att lägga till alla prover.
- Använda lyserade proverna som negativa kontroller, rita grindar vid kanten av bakgrundsfluorescens i varje fluorescens kanal som används. Dra fluorescerande grindar i EV porten till varje motsvarande icke-lyserade prov.
OBS: På denna punkt är det också lämpligt att undersöka dubbla fluorescerande bi-parameter tomter. Rocket former idubbel-positiva kvadranten (se figur 8), särskilt om markörerna är kända för att finnas på obesläktade celltyper, kan tyda på artefakt från aggregering eller andra blåsliknande händelser. - För varje fluorescerande markör, subtrahera antalet händelser i lyserade provet från antalet händelser i den icke-lyserade prov. Eventuellt dividera detta antal med det totala antalet elbilar inom den icke-lyserade EV porten att få% positiva värden.
2. METOD B: Pärlor Method
2.1) Behandling av blodprov / Isolering av elbilar
- Se blodbehandlingsmetod som beskrivs i metod A (avsnitt 1.1).
2.2) Förbereda Prover för analys
- Om så önskas, fraktion PPP eller ultracentrifuger EO i exosomes och mikrovesiklar. Lägg 250 l av PPP eller ultracentrifuger elbilar till 0,22 um centrifugalfilter och överför till en fast centrifugrotor och snurra på 750 xg under 2 min vid rumstemperatur.
OBS: Se till att ingen vätska kvar på filter tops. Efter centrifugering, bör filtret verkar vara "torr" med ingen synlig vätskelager kvar ovanpå. Medan osannolikt, kan vissa prover kräva en något längre centrifugeringstid för vätskan för att effektivt förflytta sig genom filtret. - Tvätta obelagda 6 um polystyrenkulor (t.ex. negativa ABC pärlor) 2x med RPMI media och återsuspendera i 2 ml. Lägg 6000 pärlor till varje FACS-rör. Till den negativa kontrollen röret, tillsätt 400 | il RPMI-medium enbart till pärlorna. Till alla andra rör, tillsätt 200 pl PPP eller ultracentrifuger elbilar (eller fraktioner) och 200 pl RPMI media.
- Justera den slutliga volymen av alla rör till 400 | il med medier och inkubera över natten vid 4 ° C på en skakapparat.
- Nästa morgon, tvätta pärlor med 2 ml medium. Sug bort supernatanten.
- Blockera med 5% bovint serumalbumin (BSA) i medium (400 | il) under 3 h vid 4 &# 176; C på en shaker.
- Tvätta pärlor med 2 ml av media. Aspirera och återsuspendera pelleten i 100 | il medium.
2.3) Färgning EV Prover
- Filtrera alla antikroppar. Använd samma paneler antikropps används i metod A, eller om så önskas, skapa en annan kombination av antikroppar, så länge deras fluorokromer är kompatibla med varandra.
- Kombinera alla antikroppar som skall användas i en enda panel i en 0,22 ^ m centrifugal filterröret. Centrifug med användning av en fast vinkel enda hastighet centrifug under 2 minuter eller tills all Ab blandningen har passerat genom filtret och ingen antikropp vätska kvar på ytan av filtret.
- Lägg lämplig volym av filtrerad antikroppscocktail till alla rör och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta pärlor med 2 ml medium, resuspendera i 400 pl media och kör omedelbart (eller inom samma dag) på flödescytometer.
2.4) Cytometer Setup och prov läsning
- Öppna FCM programvaran. Före experimentera installationen, utföra dagliga instrumentkalibrering och inställning med instrumentinställnings pärlor (efter tillverkarens instruktioner).
- Om EV prover har målat med mer än en antikropp och flera fluorokromer är att mätas på en gång, beräkna kompensationsvärden enligt följande:
- Tillsätt 2 droppar ersättnings pärlor till redan märkta rör (1 tub för varje fluorokromkonjugerade antikropp) och lägg den rekommenderade mängden antikroppar. Tillsätt 2 droppar negativa ersättnings pärlor till ett annat rör som ska användas som ofärgade kompensationsstyrning. Inkubera vid 4 ° C under 30 minuter, tvätta med PBS och återsuspendera i 400 fil PBS.
- Med hjälp av FCM programvara, köra varje kompensationsröret och justera fluorescerande spänningar att placera varje topp vid ungefär 10 4 på en 5-decennium logskala. Se till att fluorescenstopp är högst (ljusast) i sin egen fluorescerande kanal jämfört med alla andra kanaler, ochjustera spänningar av fluorescerande parametrar igen om det behövs. Kör varje individuellt färgade comp röret och fånga minst 5.000 händelser per rör.
- Välj fliken "Experiment" och sedan "Ersättning" och sedan "Beräkna Ersättning" att tillämpa kompensationsvärden för alla prover.
- Ändra FSC och SSC spänningsparametrar för att logga skala och välj de lägsta tröskelvärden som tillåts av cytometern (FSC = 200 och SSC = 200) för varje.
- Kör prover, grind på singlet pärlor befolkningen och förvärva 2.000 händelser i denna port. Export .fcs filer.
- Använd FCM analysprogram att analysera .fcs filer. Gate på sing pärlor. Beräkna det geometriska medelvärdet fluorescensintensitet (MFI) för varje fluorokrom och jämför med MFI av den negativa kontrollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar det övergripande systemet för isolering och detektion av elbilar med antingen pärlan baserad metod eller enskilda detektionsmetod bearbetning. Individuell upptäckt av elbilar använder FCM fungerar bra för att analysera stora elbilar men de flesta cytometrar inte kan individuellt detektera partiklar så små som exosomes. En pärla baserat tillvägagångssätt gör små elbilar som ska upptäckas, men det finns nackdelar med att använda denna metod, som beskrivs i tabell 1. Generellt är isolering av elbilar som använder ultracentrifuge (med eller utan tillsats av en sackarosgradient fraktioneförfarande) rekommenderas när elbilar behövs för funktionella analyser. Ultracentrifuge tar bort orenheter, inklusive serumproteiner och andra lösliga föroreningar från plasma, vilket kan påverka funktionella experimentella resultat. Emellertid är ultracentrifugetidskrävande och kan förändra EV kvantitet och kvalitet 12.
"> Förväntade resultat för de två detektionsanalyser visas i figur 2-3. För den enskilde analys upptäckt, den lyserade kontrollen (nedersta raden, figur 2) används för att sätta grindar för motsvarande icke-lyserade prov (översta raden, figur 2). Majoriteten av händelser bör falla inom EV grinden. Quadrant portar ska inte avslöja dubbla positiva händelser när de två markörerna i jämförelse normalt inte finns på samma cell. Rätt biparameter tomter i figur 2 visar markörerna CD108a och CD235a , vilket är två röda blodcellmarkörer kända för att samexistera på celler. Här, på elbilar, över hälften av de positiva händelserna är positiva för båda markörerna, som väntat. På samma sätt, för att cellytmarkörer kända finnas på samma cell bör visar liknande mönster av dubbel positivitet på elbilar. Mitt biparameter tomter visar EV uttryck av två markörer som är kända att inte samexistera på celler. I denna analys av CD235a (en röd blood cellmarkör) och CD41a (en blodplättmarkör), EVS visar distinkta, separata, positiva populationer, vilket förväntas eftersom de kommer från olika celltyper. När lyserade, bör positiva händelser försvinna. I allmänhet, några positiva händelser som återstår efter lys indikera närvaron av signalen som kommer från icke-vesikler partiklar, aggregat, och / eller tvättmedel resistenta elbilar. Figur 3 visar förväntade resultat med hjälp pärlan baserade detektionsmetod. Till skillnad från den enskilda detektionsmetoden, dessa uppgifter kan inte / skall inte ses i bi-parameter tomter. I de övre punktdiagrammen, ingen separation mellan de positiva och negativa populationer existera, och händelser visas i de dubbla positiva kvadranter även om de normalt inte finns på samma celltyper på grund av det faktum att båda typerna av elfordon kommer att binda till en enstaka kula. För pärlan baserade detektionsmetod, är uppgifterna bäst analyseras med histogram överlägg med den negativa kontrollen (avbildad nedanför punktdiagram). Positivitet Is, uppmätt med hjälp av en markör s MFI (medelfluorescensintensitet) och jämfördes direkt med den för den negativa kontrollen. Om ett prov är positivt för markören i fråga, kommer dess MFI vara högre än den negativa kontrollen. Den negativa kontrollen för vulsten metoden är helt enkelt pärlorna blockerades med BSA (inga elfordon tillsatt), vilka har färgats med samma antikroppar och tvättades parallellt med de EV-belagda pärlor. En jämförelse av de förväntade resultaten med de två metoderna kan ses i figur 4.Förmågan hos den enskilda detektionsanalys för att korrekt bedöma EV fenotyper är starkt beroende av korrekt gating att separera Ab-positiva händelser från bakgrundsfluorescens. Därför är det viktigt att välja en negativ kontroll som lämpligast härmar / förutspår bakgrundsfluorescens för ett givet prov. När färgade elbilar inte tvättas innan du läser, som vanligen används negativa kontroller (t.ex. isotyper) misslyckas med att exakt förutsäga bakgrunds fluorescence för alla markörer (figur 5A). I dessa fall, om tvätt är inte ett alternativ, lyserade prover tenderar att fungera bättre för att förutsäga bakgrundsfluorescens. Men när färgade elbilar tvättas innan behandlingen (med hjälp centrifugalfiltrering, i det här fallet), både negativa kontroller (isotyper och lyserade prover) fungerar bra för att förutsäga bakgrundsfluorescens av ett prov (Figur 5A). Det bör dock noteras, att medan alla negativa kontroller "arbete" lyserade kontroller är att föredra eftersom de ger ytterligare information om ett prov (t.ex. förekomst av tvättmedelsresistent, icke-vesikel relaterade händelser och / eller aggregat) som kan resultera i icke-EV positiva signaler och felaktigt blåsa Ab räknas. Vidare kan isotypkontroller ibland vara opålitliga, även i tvättade prover, såsom visas i fig 5B, där det färgade provet har färre positiva händelser än samma prov färgades med matchade isotyp kontrollantikroppar. Utan grundlig borttagning av obunden antikropp, FCM dot tomter av vissa EV markörer är nästan omöjligt att tolka, uppträder som moln av dunkelt fluorescerande partiklar skiljas från sina mycket fluorescerande bakgrunder (Figur 6, övre tomt). Tvättning färgade prover med användning centrifugalfilter förstärker separationen mellan bakgrund och positiva markeringssignaler (figur 6, nedre kurva); emellertid kan små EO och exosomer förloras genom porerna i filtret.
Användningen av en tvättmedels lys steg avslöjar positiva, blåsliknande händelser från immunkomplex och proteinaggregat 21. När PPP analyseras med hjälp av individuell upptäckt, möter positiva händelser som inte försvinner med lys är en ganska ofta förekomst. Dessa tvättmedelsresistent händelser visas ofta som misstänkta, mycket fluorescerande diagonala signaler i både enstaka parameter och biparameter tomter (Figur7). Kliniskt är dessa proteinkomplex och / eller olösliga immunkomplex är vanligare hos patienter drabbade av olika sjukdomar 21, såsom reumatoid artrit 28, nefrotiskt syndrom 19, och systemisk lupus erythematosus 29. Därför, beroende på syftet med forskningen, kan man önska att inkludera eller ta bort dem från analysis.Another sätt diagonala signaler kan bilda är genom att vortexa proven, särskilt efter tillsats av lysisreagens (Figur 8). Proven bör alltid blandas upp och ned med pipett för att förhindra bildningen av aggregat.
Figur 1: Övergripande schema för isolering och detektion av elbilar med antingen pärlan baserad metod eller enskilda detektionsmetod bearbetning. (A) Helblod först bearbetas till PPP. Frånre, PPP kan antingen bearbetas ytterligare med hjälp av ultracentrifuge att ge enstaka elbilar eller användas som den är i den individuella detektering eller pärla baserade analyser. (B) Sammanfattning av föreslagna plattkarta för hög genomströmning provanalys med hjälp av enskilda detektionsmetoden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Förväntade resultat Individuell Detection Flödescytometri punktdiagram visar representativa färgning av lyserade och olyserade EV prover. Värden visar procentsatser av positiva händelser. Majoriteten av händelser faller inom EV grind. Händelser som visas i rätt biparameter tomter ligger inom FSC / SSC EV grindar på vänster. Den lyserade provet (nedersta raden) används för att ställa fluorescerande-baserade grindar för each motsvarande (icke-lyserade) prov. Quad grindar skall inte avslöja dubbla positiva händelser när de två markörerna i jämförelse normalt inte finns på samma cell. Här visar biparameter CD235a och CD41a plot en tydlig åtskillnad mellan de elbilar som uttrycker röda blodcellmarkörer och de uttrycker plättar cellmarkörer. Likaså bör cellytemarkörer kända för att uppehålla sig på samma cell visar liknande mönster av dubbel positivitet på elbilar. Rätt biparameter tomten visar att över hälften av CD235a-positiva elbilar är också positivt för den sekundära röda blodkroppar (RBC) markör, CD108a. När lyserade, bör positiva händelser försvinna. Positiva händelser som återstår efter lys indikera närvaron av signalen som kommer från icke-vesikel eller rengöringsmedel resistenta partiklar och / eller aggregat.
Figur 3: Förväntade resultat med hjälp pärlan baserade upptäcktmetod. Flödescytometri punktdiagram visar representativa färgning av elbilar kopplade till pärlor, jämfört med pärlor blockerade med BSA, som fungerar som den negativa kontrollen. Värden visar procentsatser av positiva händelser. Händelser som visas i rätt biparameter tomter ligger inom FSC / SSC pärlor grindar på vänster. För pärlor baserade detektionsmetod, är uppgifterna bäst analyseras med histogram överlägg med den negativa kontrollen (avbildad nedanför punktdiagram). Positivitet mäts med en markör s MFI (medelfluorescensintensitet) och jämfördes direkt med den för den negativa kontrollen.
Figur 4:. Jämförelse av förväntade resultat med hjälp av pärlor kontra individuell detektering Flödescytometri dot tomter visar representativa färgning av elbilar kopplade till pärlor (övre raden), jämfört med elbilar som analyserar med hjälp individuell detektering (nedersta raden). Händelservisas i den högra biparameter tomter är inom FSC / SSC pärlor grindar på vänster.
Figur 5:. Jämförelse av olika negativa kontroller i individuell analys upptäckt Värden visar att andelen positiva händelser. Evenemang som visas är inom FSC / SSC EV gate. (A) Jämförelse av negativa kontroller i otvättad vs. tvättade prover. Isotyp eller lyserade kontroller utvärderades för deras förmåga att tillhandahålla lämpliga indikationer på bakgrundsfluorescens över två olika markörer i en helt målat prov (nedersta raden). Gates för varje markör gjordes med hjälp av lyserade provet (övre raden) och sedan kopieras till raderna nedanför. Tvättade prover tvättas med post-bets filtrering. (B) Exempel på ett prov färgades med isotypkontroll har mer positiva händelser än provet färgas with faktiska antikropp.
Figur 6:. Effekt av post-bets tvätt i individuell detektering värden visar procentsatser och antal positiva händelser. Evenemang som visas är inom FSC / SSC EV gate. Gates för varje prov gjordes med hjälp varje provs lyserade motsvarighet (visas, se föregående siffra för gate-inställningen i otvättad vs tvättade prover). Hög bakgrundsfluorescens gör skilja positiva från negativa händelser svårt (övre tomt). När tvättade dock den positiva befolknings avslöjas som obundna fluorescerande antikroppar avlägsnas och bakgrundsfluorescens minskar (nederst tomt).
Figur 7: Tvättmedels lys bekräftar närvaron av icke-EV signals. Evenemang visas är inom FSC / SCC EV gate. Värden visar procentsatser av positiva händelser. Färgade EV Prover läst innan (vänstra kolumnen) och efter tillsats av rengöringsmedel (högra kolumnen) för att identifiera positiva signaler som orsakas av immunkomplex och andra icke-EV-relaterade evenemang.
Figur 8: Vortexblandning orsakar uppkomsten av icke-EV signaler Evenemang visas är inom FSC / SCC EV gate.. Värden visar procentsatser av positiva händelser. Färgade EV Prover läst innan (vänstra kolumnen) och efter tillsats av rengöringsmedel (högra kolumnen). Med hjälp av en virvel för att blanda prover kan orsaka EV-härma, diagonala populationer att bilda (översta raden). När blandas försiktigt upp och ned med hjälp av en pipett, men bildning av dessa populationer kan undvikas (nedersta raden). Vortexblandning är rekommenderas inte för blandning, eftersom det kan orsaka aggregation i vissa prover, leading Diagonal-framträdande, positiva befolkningar. I allmänhet bör händelsenummer inom ett positivt grind inte öka efter lyse.
| Bead-baserad detektering | Individuell Detektion | |
| EV Storlekar | rekommenderas för <100 bara nm | rekommenderas för> 100 nm endast |
| Tid | kräver inkubation över natten | kan fylla i <1 dag |
| Känslighet | kluster detektion | enda detektionspartikel |
| Resultat | kvalitativ | kvantitativ |
| Tvättning | enkel, standard centrifugering | kräver centrifugalfilter |
| Negativ kontroll | BSA-belagda pärlor | lyserade prover |
Tabell 1: Fördelar och nackdelar med båda detektionsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Två olika protokoll för isolering, behandling och analys av elbilar presenterades, med antingen en individuell detektering eller pärla baserat synsätt. Välja den lämpligaste metoden att använda är inte alltid enkelt och kräver en förståelse av provet som testas samt individuella subpopulationer av intresse. Dessutom måste känslighet cytometern används för förvärv beaktas när man väljer den lämpligaste metoden. Ofta finns det inget enskilt bästa protokoll som ska användas, snarare en kombination av metoder ger mer information om ett urval än någon metod ensam. Helst bör flera olika isolerings- och detekteringsteknik utvärderas först för att utveckla en skräddarsydd protokoll som tar hänsyn individ cytometer prestanda med avseende på den specifika EV befolkningen som studeras. Alternativa isoleringstekniker inkluderar ultracentrifuge, sackaros densitet fraktionering, immunomagnetisk bead separation, kromatografi och affinitetsrening 12, medan alternativa detektionsmetoder inkluderar svepelektronmikroskopi, transmissionselektronmikroskopi, atomkraftsmikroskopi, dynamisk ljusspridning, och western blotting 8. Genom att kombinera olika tekniker, kan de metoder som presenteras här anpassas för att skapa protokoll är bäst lämpade för att studera olika EV populationer av intresse.
I allmänhet, individuell detektering av elbilar använder FCM fungerar bra för att analysera stora elbilar men förlorar känslighet som elbilar blir mindre. Även enskilda upptäckt är mer konsekvent i att upptäcka större elbilar, är pärla baserad detektering mindre känslig för att upptäcka större elbilar och känsligare för exosomes. Större elbilar kan tvättas enkelt via postfläck filtrering och upptäcks ensamma via FCM. Mindre EO och exosomer, å andra sidan, inte detekteras väl individuellt med FCM och är mycket svårare att tvätta efter färgning. Vulsten-captureprotokoll löser båda dessa frågor, så att elbilar kan lätt tvättas och flera elbilar som ska mätas tillsammans för att skapa större positiva signaler detekterbara av FCM. Det finns dock nackdelar med att använda denna metod, som beskrivs i tabell 1.
När du arbetar med en mindre känslig cytometer, begränsad kapacitet för individuell detektering. Före EV analysen bör känslighet cytometern bestämmas med hjälp av en blandning av pärla storlekar 0,1-1,0 um. Fel på cytometern att detektera en majoritet av partiklar under 1,0 | im skulle nödvändiggöra användningen av vulsten-baserat protokoll. Höguttryckta markörer lätt detekteras med användning av endera protokollet. Sällsynta populationer är ibland lättare att upptäcka med hjälp av enstaka partikel upptäckt protokoll stället pärlan capture-protokollet, men detta kan variera beroende på sådana variabler som: ljusstyrka fluorokrom, provets EV: pärla ratio, och storleken på EV bär den sällsynta cellytemarkören. Detektion av multipla markörer på en enda partikel nödvändiggör användningen av den individuella detekteringsmetoden. Vulsten baserad metod är inte i stånd att individuellt EV detektering. Därför kommer pärlan-baserat protokoll ger data som är mer kvalitativ karaktär, medan den individuella detektionsmetod ger mer kvantitativa data.
Ytterligare isoleringstekniker måste utnyttjas närhelst elbilar behövs för tillämpningar efter. Elbilar används i funktionella analyser skall ultracentrifugeras med hjälp av 3-stegs differentiell centrifugeprotokoll, eftersom de lösliga serumproteiner i plasma kan påverka funktionella experimentella resultat. För karakterisering av elbilar, dock ultracentrifuge rekommenderas inte, eftersom detta läggs steg kan påverka EV kvalitet och kvantitet på grund av de stora krafter som överförs på partiklarna 12.
Den individuella detekteringsprotokollet innehåller several viktiga steg optimerade för hög genomströmning tester, bland annat: 1) genomförande av centrifugalfilter för snabb och effektiv borttagning av positiva händelser som orsakas av Ab aggregat, 2) användning av filter som ett mer praktiskt alternativ till ultracentrifuge eller sukrosgradient fraktione för att tvätta obundet Ab från EV prover efter färgning, och 3) utnyttjande av tvättmedel lys som en negativ kontroll, som inte bara avslöjar positiva händelser som orsakas av icke-elbilar, men ger en god approximation av bakgrundsfluorescens att skilja positiva från negativa populationer för teckning grindar. Den individuella detekterings protokoll rekommenderas när ett stort antal prover behöver testning såsom den kan utföras på en enda dag, medan vulsten baserade metoden kräver en inkubation över natten.
De negativa kontrollerna i varje protokoll har olika fördelar och nackdelar beroende på vilken detekteringsmetod används. En fördel med att använda pärlan baserade enssay är att samma monoklonala antikroppar kan användas för den negativa och positiva rör och samma negativa kontrollen kan användas för alla prover. Den individuella detektionsmetoden, å andra sidan, kräver separata kontroller som skall läsas för varje testat prov. Den negativa kontrollen används av den enskilde upptäckt protokollet använder lyse prover, som inte kräver användning / konsumtion av ytterligare antikroppar men kräver att varje rör läsas en andra gång efter tillsats av lyseringsmedlet. De lyserade kontrollerna har den extra fördelen av att kunna identifiera den andel av positiv signal som kan hänföras till icke-blåsrelaterade händelser såsom immunkomplex 21. Pärlan-baserad analys har inte denna förmåga todistinguish mellan positiva signaler som härrör från verkliga elbilar och sådana som beror på icke-blåsor.
Begränsningar av tekniken
Det finns ingen standardiserad metod för isolering av elbilar, differentialcentrifugering är en allmänt använd teknik bland EV forskare. Differentialcentrifuge metod som beskrivs här bygger på gemensamma protokoll för att isolera PPP, som normalt kräver en initial centrifugering mellan 1,200-1,500 xg i 10-20 minuter för att avlägsna celler, följt av en andra centrifugering mellan 10,000-13,000 xg i 10-30 minuter för att avlägsna blodplättar 35. Protokollet som beskrivs häri använder en centrifugering vid 1500 xg under 10 minuter följt av en centrifugering vid 13.000 xg under 10 min. Medan högre krafter 25,000-100,000 xg krävs normalt att pelle elbilar, kan några av de större elfordon tas bort med differentialcentrifugeprotokollet vi har present.
Upp till 90% av elfordon detekterade av FCM förloras med en timmes ultracentrifugering vid 100.000 xg (data visas ej). Längre centrifugetider bör övervägas, om än försiktigt, eftersom detta negativt kan påverka provets sammansättning. Om det behövs ytterligare bearbetning feller karakteriseringsstudier, kan utföras filtrering efter den 2-stegscentrifugering (före färgning) för att ytterligare fraktionera prover baserade på partikelstorlek. Liknar ultracentrifugering, filtrering kan resultera i en förlust av upp till 50% av positiva markör händelser och upp till 90% av de totala partiklarna som detekteras av FCM (data ej visade). Medan ökningen av signal-brusförhållandet är av uppenbar nytta, förlust av mindre elbilar utgör en betydande begränsning när man överväger någon tvätt eller isoleringsmetoden.
Slutligen antikoagulant som används (t.ex. heparin, ACD, etylendiamintetraättiksyra (EDTA), etc.) under bloduppsamling kan påverka kvaliteten och kvantiteten av EV innehåll. Medan ACD har visat sig vara en bra och pålitlig antikoagulant för våra studier, testa flera lösningar rekommenderas för att säkerställa att den mest lämpade antikoagulant för tillämpningen väljs. Detta är särskilt viktigt när elfordon kommer att användas i analyser nedströmsdär antikoagulant som används kan påverka resultatet. Till exempel är vissa antikoagulantia (t.ex. EDTA och heparin) kända för att störa PCR-reaktioner medan andra (t.ex. teofyllin, adenosin och dipyridamol) har visats hämma EV frigivning från trombocyter 12.
Metoder för EV analys, medan betydligt förbättrats under det senaste årtiondet, är fortfarande ett pågående arbete. Ytterst är de bästa metoderna för att analysera elbilar kommer att bero på den forskning som bedrivs och verktyg tillgängliga för forskaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har någon intressekonflikt att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dale Hirschkorn från Blood Systems Research Institute för hans hjälp med flödescytometer instrumentinställningar. Detta arbete stöddes av NIH bidrag HL095470 och U01 HL072268 och DoD kontrakt W81XWH-10-1-0023 och W81XWH-2-0028.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
- Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
- Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
- Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
- Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
- Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
- Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
- Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
- Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
- Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
- Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
- Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
- György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
- György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
- Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
- Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).
