Protocol
伦理学声明：该项目已通过IUCPQ的研究伦理委员会之前，患者招募。在这篇文章中/视频的目的，我们从2例患者获得组织：1）一名62岁的男性患者，50.7公斤/米2和2）35岁的女性患者体重指数与57公斤体重/米2。实验可以与脂肪车厢做，但都被限制在一个隔脂肪这部影片的目的。视频技术方面进行与患者1，并与去分化细胞来自患者2进行FABP4免疫。
1.样品处理
- 问医生从大网膜和皮下脂肪车厢收集脂肪组织，在腹腔镜减肥手术的时间。
- 迅速将脂肪样品送到实验室RT，并立即处理。
- 在实验室中进行消化，在非无菌的气氛中。该细胞，最终会转嫁到培养室并在无菌条件下培养。为了避免污染，准备KRH缓冲用蒸馏水，过滤水，并按照过滤（0.22μm的过滤器）之前消化。彻底清洁管与烧瓶和板制备在细胞培养罩乙醇之前传输。
- 放置脂肪组织上的预加权盘和记录重量。固定在10％福尔马林缓冲液中的小片的每个组织样本（小于1厘米2）的在RT石蜡包埋前至少24小时。使用免疫组织化学实验，这种嵌入式样品（未显示技术）。
- （ -技术未示出例如 ，基因表达）在-80℃下储存于整个脂肪组织进一步研究之前放置另一块在一个50毫升管和闪冻在液氮中。
2.胶原酶消化
- 将剩余的脂肪组织片在50毫升涂对于消化。
- 添加4毫升KRH-WB的补充有胶原酶（350单位/毫升）每克样品中的消化管。
- 直言不讳的脂肪组织用剪刀。
- 放置切碎的脂肪组织悬浮液在摇动器，37℃，90转最大，为45分钟的温育（最多1个小时）。
3.净化脂肪细胞和前脂肪细胞的
- 倾的脂肪少的块通过一个400微米的尼龙半透明溶液啮合到塑料烧杯中。
- 用镊子，擦上尼龙网细胞制剂和洗用5毫升KRH-WB的。
- 该过滤细胞悬液微妙转移到50毫升管的塑料管中，并附着在管末端一60毫升注射器。
- 让该悬浮液与成熟脂肪细胞静置约10分钟，使细胞通过浮选到达缓冲器的顶部。
- 使用60毫升syrin慢慢吸出缓冲在管的底部GE吸力。
- 添加20毫升KRH-WB的洗。从2额外的洗涤步骤3.4中重复。
- 收集在缓冲带来的脂肪细胞悬浮液中的5％或10 ml的终体积，这取决于细胞的数量。寻求与在第5个步骤。
- 从如果需要收集与离心进一步初级细胞培养物的60毫升注射器（3000转，室温，5分钟）缓冲恢复基质血管级分（技术未示出）。
4.成熟的脂肪细胞计数
- 负载10微升轻轻摇动脂肪细胞悬液在计数室（血球）。一式四份进行细胞计数。
- 计算分离的成熟细胞的数目。
5.成熟的脂肪细胞去分化为T-25瓶
- 填充的25cm 2组织培养瓶到¾用DMEM / F12-20％小牛血清的体积。
- 根据细胞计数，倾500000成熟细胞到烧瓶中。 填完全使用50毫升管介质烧瓶中并除去尽可能多的气泡尽可能。
- 拧上瓶不通风帽。
- 清洗之前用温育，以避免污染乙醇的烧瓶中。
- 孵育瓶倒了一个星期没有接触它，以避免可能破坏细胞粘附的文化运动。
- 前扭转烧瓶在第7天倒置培养，轻轻操纵烧瓶中并通过抽吸除去所有介质中的烧瓶中，避免了突然的动作。
- 添加12毫升DMEM-F12-20％小牛血清培养细胞的标准技术。滤波后，排出帽可以加入到该烧瓶中。
6.成熟脂肪细胞脱分化成6孔板
- 放置盖玻片上的6孔板的每个孔的底部
- 添加½“塑料套管每个盖玻片上。
- 填孔用8ml 20％小牛血清的DMEM培养基。
- 把盖玻片上的每个塑料套管。
- 插入幻灯片和管到滑动下注射细胞（每孔50,000个细胞）之间吸管尖。
- 孵育板在标准细胞培养孵化器在37℃，5％CO 2的一个星期。
- 反向盖玻片与附着细胞到每个孔中含有2毫升培养基补充有20％小牛血清和追求培养。
- 用盖玻片与细胞发生去分化为几个目的，包括免疫荧光（技术未示出）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
主要形态变化发生去分化（ 图1）中成熟脂肪细胞。 如图2中 ，细胞经历去分化染色用抗FABP4抗体进行荧光分析。细胞与圆形形态表达的FABP4蛋白，而大多数的成纤维细胞样细胞的没有。去分化后，DFAT细胞可以培养使用标准程序几个传代。我们已经能够达到超过15代对人网膜和皮下DFAT细胞系（数据未示出）。
图1.形态随时间的（A）中，以4天（B）中在第7天以及（C）在12天培养。图片去分化成熟脂肪细胞的用相差microscop的孵育期间在不同的时间点即请点击此处查看该图的放大版本。
图2.检测FABP4蛋白在脂肪细胞发生去分化。细胞固定13天后分化的和用抗FABP4抗体用于免疫荧光。细胞核可视化与DAPI染色。左：相应的免疫荧光明场图像。右：合并后的图像显示（FABP4红色，核蓝色-10X）。脂肪细胞圆形态快递FABP4，一个成熟的脂肪细胞的标记，而细长的细胞不再表达出来。比例尺：1单位=0.25毫米请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
成熟的脂肪细胞与天花板培养技术去分化是一种新的方法来从本地脂肪组织的一个小样本的获取脂肪干细胞。根据我们的经验和其他人2，一克组织足以在板25-cm 2的烧瓶中并以获得DFAT细胞的量的均匀性已被证实由波洛尼和合作者3群。脂肪细胞分化似乎独立他们的年龄，性别和其他特征可以与来自任何供体细胞。间所产生的DFAT获得人口，仍然存在一些圆形或部分细长的细胞没有完全去分化。这些细胞是通过培养通路通常被丢弃，因为它们在胰蛋白酶媒体组合浮动。
这些细胞的多能建立并支持它们用于细胞疗法2,3。它们的高增殖能力也有报道，这是我细胞培养干细胞的应用2 SA有价值的方面。研究与人DFAT细胞表示，它们可能会比来自相同供体的ASC更有效率的基础上，其复制性和分化能力18。最近的一个案例研究支持这一DFAT细胞更有效地分化成脂肪细胞和成骨细胞，并有较高的端粒酶的水平比来自同一个人，与肥胖症和糖尿病18施主的ASC。因此，使用天花板培养物可提供更高效的脂肪干细胞比已使用的ASC。然而，需要额外的实验清楚地评估了这一点。
我们的6孔板吊顶培养技术允许分化过程本身的研究。细胞的最小数量可镀并允许特定时间点的研究。例如，我们收集了来自6孔板所述显微镜载玻片，以从脂肪细胞期大学生进行免疫荧光卷板机去分化（ 图2）。执行miscroscopy，有或没有荧光，是高度相关的，以评估分化的各个方面。
除了干细胞的应用，DFAT细胞可能代表了生理研究一个有趣的模式。只有少数研究探讨基因表达和两种细胞类型的功能。简言之，ASC和DFAT从同一脂肪隔室显示出基因的表达和分泌4相似之处。来自同一供体ASC和DFAT之间有更多的比较是必要的。
最后，我们示出了本技术报告如何从使用成熟脂肪组织胶原酶消化的技术和天花板培养技术人脂肪组织获得DFAT细胞。我们最初的6孔板格式可能有助于增加对去分化过程的知识，而更常用的烧瓶方法允许较大珀普的代DFAT细胞的办法第十四。该协议的主要限制是进入人体脂肪组织依赖于协作手术团队和道德管理，以取得患者的书面知情同意。成熟细胞是高度敏感的，需要在操作的注意事项。我们优化了协议，脂肪细胞中的T-25flask待镀的特别的数量和6孔板格式中，以获得最佳的结果，并没有大的额外的修改或解决问题，可以预料到的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892 (2013).
- Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
- Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
- Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
- Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
- Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
- Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
- Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
- Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
- Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
- Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
- Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).
