Protocol
Etik erklæring: Projektet er godkendt af IUCPQ Research etiske råd, før patientrekruttering. Med henblik på denne artikel / video, vi opnåede væv fra 2 patienter: 1) en 62-årig mandlig patient med en BMI på 50,7 kg / m 2 og 2) en 35-årig kvindelig patient med en BMI på 57 kg / m2. Eksperimenter kan gøres med begge fede rum, men har været begrænset til et fedt rum med henblik på denne video. Tekniske aspekter af videoen blev udført med patient 1 og FABP4 immunofluorescens blev udført med dedifferentierede celler fra patient 2.
1. Prøve Processing
- Stil kirurger at indsamle fedtvæv fra oment og spæk rum ved laparoskopisk fedmekirurgi.
- Hurtigt bringe adipose prøver til laboratoriet ved stuetemperatur og med det samme.
- Udfør fordøjelse i laboratoriet, i en ikke-steril atmosfære. Denceller i sidste ende vil blive overført til kultur rum og dyrket under sterile betingelser. For at undgå kontaminering forberedes KRH-buffer med destilleret og filtreret vand og følg med en filtrering (0,22 um filter) før fordøjelse. Grundigt rene rør med ethanol forudgående overførsel i cellekultur hætte til kolben og forberedelse plade.
- Placer fedtvæv på en pre-vægtet fad og optage vægt. Løs et lille stykke af hver vævsprøve (mindre end 1 cm2) i 10% formalin buffer ved stuetemperatur i mindst 24 timer før paraffinindlejring. Brug denne indlejret prøve til immunhistokemi eksperimenter (teknik ikke vist).
- Læg et andet stykke i en 50-ml rør og flash-freeze i flydende nitrogen før opbevaring ved -80 ° C i yderligere undersøgelser af hele fedtvæv (fx genekspression - teknik ikke vist).
2. collagenasefordøjelse
- Placer de resterende fedtvæv stykke i en 50 ml tuvære for fordøjelsen.
- Tilsæt 4 ml KRH-WB suppleret med collagenase (350 U / ml) per gram prøve i fordøjelsen røret.
- Hak fedtvæv med en saks.
- Placer hakket fedtvæv suspension i en shaker, 37 ° C, 90 rpm maksimum for en 45 minutters inkubation (højst 1 time).
3. Oprensning af adipocyter og præadipocytter
- Hæld gennemskinnelig opløsning med få klumper af fedt gennem en 400 um nylon mesh i et plastbæger.
- Med pincet, gnide præparatet celle i nylon mesh og vaskes med 5 ml KRH-WB.
- Fint overføre filtrerede cellesuspension i et 50 ml rør med plastrøret i det og en 60cc sprøjte fastgjort på slangen ende.
- Lad suspensionen med modne adipocytter står for ca. 10 min, hvilket tillader cellerne at nå toppen af bufferen ved flotation.
- Langsomt aspirere puffer ved bunden af røret ved hjælp af 60cc SyrinGE sugning.
- Der tilsættes 20 ml KRH-WB at vaske. Gentag fra trin 3.4 til 2 ekstra vaske.
- Opsaml buffer at bringe adipocyt suspension til et slutvolumen på 5 eller 10 ml, afhængig af celle mængde. Fortsætte med trin i afsnit 5.
- Opsaml fraktion stromale-kar fra bufferen indsamlet med 60cc sprøjten ved centrifugering (3000 rpm, RT, 5 min) for yderligere primær cellekultur, hvis det ønskes (teknik ikke vist).
4. Ældre fedtcellerne celletal
- Load 10 pi forsigtigt rystet adipocyt suspension i et tællekammer (hæmocytometer). Udfør celletal i fire eksemplarer.
- Beregn antal isolerede modne celler.
5. Ældre fedtcellerne dedifferentiering i T-25 kolbe
- Fyld en 25 cm 2 vævskulturkolbe at ¾ af volumen med DMEM / F12-20% kalveserum.
- Ifølge celletal, hæld 500.000 modne celler til kolben. Fyld kolben fuldstændigt ved hjælp af en 50 ml rør med medium og fjerne så mange bobler som muligt.
- Skru uventilerede hætten på flasken.
- Rengør kolben med ethanol før inkubation for at undgå forurening.
- Inkubér kolben på hovedet i en uge uden at røre den for at undgå bevægelse i den kultur, der kan forstyrre cellulære tilslutning.
- Forud for at vende kolben på 7 dage omvendt kultur, forsigtigt manipulere kolben og fjerne alle medium i kolben ved aspiration, undgå pludselige bevægelser.
- Tilsæt 12 ml DMEM-F12-20% kalveserum og dyrke celler med standardteknikker. En filtreret, udluftet hætte kan tilsættes til kolben.
6. Ældre adipocyt dedifferentiering i en 6-brønds plade
- Placer et dækglas på bunden af hver brønd i en 6-brønds plade
- Tilføj en ½ "plastik bøsning på toppen af hver dækglas.
- Fyld brøndene med 8 ml 20% kalveserum-DMEM-medium.
- Sæt et dækglas på hver plastik bøsning.
- Indsæt pipettespids mellem dias og røret at injicere celler under objektglasset (50.000 celler pr).
- Pladerne inkuberes i en standard cellekultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2 for en uge.
- Reverse dækglas med vedhæftede celler i hver brønd indeholdende 2 ml medier suppleret med 20% kalveserum og forfølge kultur.
- Brug dækglas med celler undergår dedifferentiering til flere formål, herunder immunofluorescens (teknik ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Større morfologiske ændringer forekommer at modne adipocytter under dedifferentiering (figur 1). Som vist i figur 2 blev celler undergår dedifferentiering farvet med et anti-FABP4 antistof til fluorescens-analyse. Celler med en rund morfologi udtrykte FABP4 protein mens hovedparten af de fibroblastlignende celler ikke gjorde. Efter dedifferentiering kan DFAT celler dyrkes med standardprocedurer for flere passager. Vi har været i stand til at nå mere end 15 passager for menneskelig oment og subkutane DFAT cellelinier (data ikke vist).
Figur 1. morfologi dedifferentiating modne adipocytter over tid (A) ved 4 dage (B) på 7 dage og (C) ved 12 dage i kultur. Der blev taget billeder på forskellige tidspunkter i løbet af inkubationen ved hjælp af en fase-kontrast mikroskopete. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Påvisning af FABP4 protein i adipocytter undergår dedifferentiering. Celler blev fikseret efter 13 dages dedifferentiering og farvet med anti-FABP4 antistof til immunofluorescens. Kerner blev visualiseret med DAPI-farvning. Venstre: Lysfelt billede af tilsvarende immunofluorescens. Til højre: Den fusionerede billede vises (FABP4-rød, Kerner-blå-10X). Adipocytter med rund morfologi udtrykkelig FABP4, en moden adipocyt markør, mens aflange celler ikke længere udtrykke det. Scale bar: 1 enhed = 0,25 mm Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dedifferentiering af modne adipocytter med loftet kultur teknik er en ny metode til opnåelse af adipøst stamceller fra en lille prøve af nativ fedtvæv. Baseret på vores erfaringer og andres 2, et gram væv er tilstrækkelig til plade 25 cm 2 kolbe og for at opnå en population af DFAT celler, for hvilke homogenitet er påvist af Poloni og samarbejdspartnere 3. Fedtcellerne dedifferentiering synes muligt med celler fra enhver donor, uanset deres alder, køn og andre karakteristika. Blandt de resulterende population af DFAT opnået, er der stadig et par runde eller delvis langstrakte celler, der ikke fuldt ud dedifferentiere. Disse celler er normalt kasseres gennem kulturen passage som de flyder i trypsinlignende mediemix.
Multipotency af disse celler er etableret, og støtter deres anvendelse til celleterapi 2,3. Deres høje proliferativ kapacitet er også blevet rapporteret, som jegsa værdifuld aspekt af cellekultur for stamcelle applikationer 2. Studier med humane DFAT celler viste, at de kan være mere effektiv end ASC fra samme donor, baseret på deres replikative og differentiering kapacitet 18. En nylig casestudie understøtter, at DFAT celler var mere effektive til at differentiere til adipocyter og osteoblaster, og havde højere telomerase niveauer end ASC fra samme individ, en donor med fedme og diabetes 18. Således kan anvendelsen af loftet kultur give mere effektive adipose stamceller end den allerede brugt ASC. Der er dog behov for yderligere eksperimenter klart at vurdere dette punkt.
Vores 6-brønds loftsplade kultur teknik giver mulighed for undersøgelse af dedifferentiering selve processen. Et minimalt antal celler kan udplades og giver mulighed for undersøgelse af specifikke tidspunkter. For eksempel har vi indsamlet objektglasset fra en 6-brønds plade til at udføre immunofluorescens fra adipocytter undergoing dedifferentiering (figur 2). Udførelse miscroscopy, med eller uden fluorescens, er yderst relevant at vurdere forskellige aspekter af dedifferentiering.
Ud over stamceller anvendelser kan DFAT celler repræsenterer en interessant model for fysiologiske studier. Kun få studier undersøgt genekspression og funktioner begge celletyper. I korte træk ASC og DFAT fra samme fedt rum viste ligheder i genekspression og sekretion 4. Flere sammenligninger mellem ASC og DFAT fra samme donor er nødvendige.
Sammenfattende viser vi i denne tekniske rapport, hvordan man opnår DFAT celler fra humant adipøst væv ved hjælp af den veletablerede teknik fedtvæv collagenasefordøjelse og loftet dyrkningsteknik. Vores oprindelige 6-brønds plade format kan bidrage til at øge viden om dedifferentiering processen mens mere almindeligt anvendt kolbemetoden muliggør generering af større befolknerne i DFAT celler. Den største begrænsning i denne protokol er den adgang til humane fedtvæv, som bygger på et samarbejde med en operation team og etik ledelse for at opnå patient informeret og skriftligt samtykke. Modne celler er meget følsomme, som kræver forholdsregler i manipulation. Vi optimeret protokollen, især antallet af fedtceller, der skal forgyldt i T-25flask og 6 brønde format, for at opnå optimale resultater og kan forventes ingen større yderligere modifikationer eller fejlmelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892 (2013).
- Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
- Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
- Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
- Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
- Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
- Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
- Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
- Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
- Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
- Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
- Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).
