Protocol
הצהרת אתיקה: הפרויקט אושר על ידי ועדת האתיקה של מחקר IUCPQ לפני גיוס חולה. לצורך המאמר / הווידאו הזה, שהשגנו רקמות מ2 חולים: 1) מטופל זכר 62 שנים ישנות עם BMI של 50.7 קילוגרם / מ 2 ו- 2) מטופלת בת 35 עם BMI של 57 קילוגרם / M 2. ניתן לעשות ניסויים עם שני תאי השומן, אך היו מוגבלים לתא אחד שומן לצורך זה וידאו. היבטים טכניים של הווידאו בוצעו עם מטופל 1 וimmunofluorescence FABP4 בוצע בתאי dedifferentiated מחולה 2.
עיבוד 1. לדוגמא
- שאל מנתחים לאסוף רקמת שומן מתאי השומן תת עורי וomental בעת הניתוח בריאטרי לפרוסקופי.
- במהירות להביא דוגמאות שומן למעבדה בRT ולעבד באופן מיידי.
- בצע עיכול במעבדה, באווירה שאינה סטרילי.תאי סופו של דבר הועברו לחדר התרבות וטיפחו בתנאים סטריליים. כדי למנוע זיהום, להכין חיץ KRH עם מים מזוקקים וfiltrated ומעקב על ידי סינון (מסנן 0.22μM) לפני העיכול. צינורות לנקות ביסודיות עם העברה לפני אתנול במכסת מנוע תרבית תאים לבקבוק והכנת צלחת.
- הנח רקמת שומן במנה משוקללת מראש ומשקל שיא. תקן את חתיכה קטנה של כל דגימת רקמה (סנטימטר פחות מ 1 2) ב 10% חיץ פורמלין ב RT לפחות 24 שעות לפני הטבעת פרפין. השתמש בדוגמה זו הגלומה לניסויי אימונוהיסטוכימיה (טכניקה לא מוצגת).
- מניחים חתיכה בצינור 50 מ"ל ובזק-הקפאה בחנקן נוזלי אחרת לפני האחסון ב -80 ° C למחקרים נוספים ברקמות שומן שלמות (למשל, ביטוי גנים - טכניקה לא מוצג).
2. Collagenase עיכול
- מניחים את פיסת רקמת שומן שנותרה במיליליטר tu 50להיות לעיכול.
- הוסף 4 מיליליטר של KRH-WB בתוספת collagenase (350 U / ml) לגרם של מדגם בצינור העיכול.
- ברר ברקמת שומן במספריים.
- מניחים השעיה רקמת שומן טחון שייקרה, 37 ° C, 90 מקסימום סל"ד, לדגירה של 45 דקות (שעה 1 המרבית).
3. טיהור של תאי שומן וPreadipocytes
- יוצקים את הפתרון השקוף עם כמה נתחי השומן באמצעות ניילון 400 מיקרומטר רשת לתוך כוס פלסטיק.
- עם פינצטה, לשפשף את הכנת התא ברשת הניילון ולשטוף עם 5 מיליליטר של KRH-WB.
- בעדינות להעביר את ההשעיה תא filtrated לתוך צינור 50 מיליליטר עם צינורות פלסטיק בזה ומזרק 60cc המצורף בקצה הצינור.
- בואו ההשעיה עם adipocytes הבוגרת עומדת על כ 10 דקות, שמאפשרת לתאים כדי להגיע לחלק העליון של המאגר על ידי ציפה.
- לאט לאט לשאוב החיץ בחלק התחתון של הצינור באמצעות syrin 60ccיניקת ge.
- להוסיף 20 מיליליטר של KRH-WB לשטוף. חזור מצעד 3.4 ל -2 שוטף נוסף.
- לאסוף את החיץ להביא את ההשעיה adipocyte לנפח סופי של 5 או 10 מיליליטר, בהתאם לכמות תאים. להמשיך עם שלבים בסעיף 5.
- לשחזר את חלק סטרומה וכלי דם למאגר שנאסף עם מזרק 60cc ידי צנטריפוגה (3,000 סל"ד, RT, 5 דקות) לתרבית תאים עיקריות נוספת אם תרצה בכך (טכניקה לא מוצגת).
ספירת תאים 4. למבוגרים adipocyte
- טען 10 μl של ההשעיה adipocyte מזועזעת בעדינות בתא ספירה (haemocytometer). לבצע ספירת תאים ארבע פעמים.
- לחשב מספר התאים בוגרים מבודדים.
5. מבוגרים adipocyte Dedifferentiation לT-25 Flask
- מלא בקבוק תרבות 2 רקמה 25 סנטימטרים עד ¾ מההיקף עם / F12-20% בסרום עגל DMEM.
- , על פי ספירת תאים לשפוך 500,000 תאים בוגרים לתוך הבקבוק. למלא את הבקבוק באמצעות צינור 50 מ"ל עם מדיום לחלוטין ולהסיר בועות רבות ככל האפשר.
- לדפוק את כובע unvented על הבקבוק.
- נקה את הבקבוק עם אתנול לפני דגירה, כדי למנוע זיהום.
- דגירה הבקבוק הפוך במשך שבוע מבלי לגעת בו כדי למנוע תנועה בתרבות שעלולה לשבש את הדבקות סלולרית.
- לפני היפוך הבקבוק ב 7 ימים של תרבות ההפוכה, בעדינות לתפעל את הבקבוק ולהסיר את כל המדיום בבקבוק על ידי שאיפה, הימנעות תנועות פתאומיות.
- להוסיף 12 מיליליטר של סרום עגל% DMEM-F12-20 ולטפח תאים עם טכניקות סטנדרטיים. כובע מסונן, פרק ניתן להוסיף לבקבוק.
6. למבוגרים adipocyte Dedifferentiation לתוך צלחת 6-גם
- מניחים coverslip על החלק התחתון של כל טוב של 6-גם צלחת
- הוסף "תותב פלסטיק ½ על גבי כל coverslip.
- מלא בארות עם 8 מיליליטר של 20% בינוניים עגל סרום-DMEM.
- שים coverslip על כל תותב פלסטיק.
- הכנס קצה pipet בין השקופיות והצינור להזרמת תאים שמתחת לסליידר (50,000 תאים לכל טוב).
- דגירה צלחות בתרבית תאי חממה סטנדרטית על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך שבוע.
- coverslip ההפוך עם תאים מצורפים לכל תרבות היטב המכיל 2 מיליליטר של תקשורת בתוספת 20% בסרום עגל ולהמשיך.
- השתמש coverslip עם התאים עוברים dedifferentiation למספר מטרות כוללים immunofluorescence (טכניקה לא מוצגת).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שינויים מורפולוגיים גדולים נוצרים להתבגר adipocytes במהלך dedifferentiation (איור 1). כפי שניתן לראות באיור 2, תאים עוברים dedifferentiation הוכתמו נוגדן אנטי FABP4 לניתוח הקרינה. תאים עם מורפולוגיה עגולה הביעו חלבון FABP4 בעוד רוב התאים כמו פיברובלסטים-לא. לאחר dedifferentiation, יכולים להיות מעובד תאי DFAT עם נהלים סטנדרטיים לכמה קטעים. אנחנו כבר יכולים להגיע ליותר מ -15 קטעים לomental אדם ושורות תאי DFAT תת-עורי (מידע לא מוצג).
איור 1. מורפולוגיה של dedifferentiating adipocytes הבוגרת לאורך זמן () בשעה 4 ימים (ב ') בשעה 7 ימים ו- (ג) בשעה 12 ימים של התרבות. תמונות צולמו בזמן נקודות שונות במהלך הדגירה באמצעות microscop שלב בניגודדואר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. איתור חלבון FABP4 של בתאי שומן שעבר dedifferentiation. תאים היו קבועים לאחר 13 ימים של dedifferentiation ומוכתם עם נוגדן אנטי FABP4 לimmunofluorescence. גרעינים היו דמיינו עם מכתים DAPI. משמאל: תמונה של Brightfield מקביל immunofluorescence. מימין: התמונה הממוזגת מוצגת (FABP4-אדום, כחול גרעינים-10X). תאי שומן עם FABP4 מורפולוגיה עגולה מפורש, סמן adipocyte בוגר, ואילו תאים מוארכים כבר לא מביעים את זה. בר סולם: יחידה 1 = 0.25mm אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dedifferentiation של תאי שומן בוגרים עם טכניקת תרבות התקרה היא גישה חדשה להשגת תאי גזע שומן ממדגם קטן של רקמת שומן מקומית. בהתבסס על הניסיון שלנו ושל אחרים 2, גרם אחד של רקמה מספיקה לצלחת בקבוק 2 25 סנטימטר ולהשיג אוכלוסייה של תאי DFAT שהומוגניות הודגמה על ידי Poloni ומשתפי פעולה 3. dedifferentiation adipocyte נראה אפשרי עם תאים מכל תורם, באופן בלתי תלוי בגיל, המין והמאפיינים אחרים שלהם. בקרב האוכלוסייה של DFAT הושג התוצאה, נותר כמה עגול תאים מוארכים בחלק שלא dedifferentiate באופן מלא או. תאים אלה הם בדרך כלל מושלכים דרך מעבר התרבות כפי שהם צפים בתמהיל טריפסין-מדיה.
Multipotency של תאים אלה הוקם ותומך בשימוש שלהם לטיפול בתא 2,3. הקיבולת גבוהה שגשוגם כבר דווח, שבו אניהיבט sa היקר של תרבית תאים לתאי גזע יישומים 2. מחקרים בתאי DFAT אדם ציינו כי הם עשויים להיות יעילים יותר מASC מאותו התורם, המבוססים על קיבולת replicative ובידול שלהם 18. מקרה מחקר שנערך לאחרונה תומך שבתאי DFAT היו יותר יעילים להתמיין לתאי שומן וosteoblasts, והיו רמות גבוהות יותר מאשר הטלומרז ASC מאותו האדם, תורם להשמנה וסוכרת 18. לפיכך, השימוש בתרבות תקרה עשויה לספק תאי גזע שומן יעילים יותר מאשר ASC כבר בשימוש. עם זאת, יש צורך בניסויים נוספים כדי להעריך נקודה זו באופן ברור.
טכניקת תרבות תקרת 6-גם צלחת שלנו מאפשרת לחקר תהליך dedifferentiation עצמו. מספר מינימאלי של תאים יכול להיות מצופה ומאפשר לחקר נקודות זמן ספציפי. לדוגמא, אספנו את שקופית מיקרוסקופ מצלחת 6-גם לבצע immunofluorescence מunderg adipocytesdedifferentiation oing (איור 2). ביצוע miscroscopy, עם או בלי הקרינה, רלוונטי מאוד להערכת היבטים שונים של dedifferentiation.
בנוסף לגזע יישומים סלולריים, תאי DFAT עשויים לייצג מודל מעניין למחקרים פיסיולוגיים. רק מחקרים מעטים בחנו ביטוי גנים ופונקציות של שני סוגי התאים. בקיצור, ASC וDFAT מאותו תא השומן הראה דמיון בביטוי גנים והפרשה 4. יותר השוואות בין ASC וDFAT מאותו התורם נחוצות.
לסיכום, אנו מציגים בדו"ח טכני זה איך להשיג תאי DFAT מרקמת שומן אנושי באמצעות הטכניקה מבוססת היטב של עיכול collagenase רקמת שומן וטכניקת תרבות תקרה. פורמט הצלחת שלנו מקורי 6-גם עשוי לעזור להגדיל את הידע על תהליך dedifferentiation ואילו שיטת הבקבוק הנפוצה יותר מאפשרת לדור של popu הגדולlations של תאי DFAT. המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא הגישה לרקמת שומן אנושית הנשענת על שיתוף פעולה עם צוות ניהול ניתוח ואתיקה כדי להשיג הסכמה בכתב והודיע מטופל. תאים בוגרים רגישים מאוד אשר דורש אמצעי זהירות במניפולציה. אנו מותאמים הפרוטוקול, במיוחד מספר תאי השומן להיות מצופה בT-25flask ופורמט 6-גם צלחת, כדי להשיג תוצאות אופטימליות וללא שינויים מרכזיים נוספים או פתרון בעיות עשויים להיות צפויות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892 (2013).
- Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
- Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
- Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
- Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
- Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
- Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
- Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
- Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
- Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
- Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
- Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).
