Protocol
倫理声明:プロジェクトが前に患者の募集にIUCPQの研究倫理委員会によって承認されています。この記事/ビデオの目的のために、私たちは2人の患者から組織を得た:1)57キロのBMIが50.7キロ/ m 2であり、2)35歳の女性患者のBMIが62歳の男性患者/ m 2である 。実験は、両方の脂肪のコンパートメントで行うことができるが、このビデオの目的のために一種の脂肪区画に限られていた。ビデオの技術的側面は、患者1で行ったとFABP4免疫蛍光は、患者2からの脱分化細胞を用いて行った。
1.サンプル処理
- 腹腔鏡肥満手術の時に大網および皮下脂肪区画から脂肪組織を収集するために外科医に依頼。
- すぐに室温で実験室に脂肪のサンプルを持ってきて、すぐに処理します。
- 非無菌雰囲気の中で、研究室での消化を実行します。ザ·細胞は、最終的には培養室に移し、無菌条件下で培養される。汚染を避けるために、消化の前に蒸留し、濾過水をKRH緩衝液を調製し、濾過(0.22μmのフィルター)をたどる。フラスコとプレートの準備のための細胞培養フード中のエタノールの前に転送で十分にきれいなチューブ。
- 事前加重ディッシュとレコード重量に脂肪組織を置きます。パラフィン包埋の前に少なくとも24時間、室温で10%ホルマリン緩衝液中の各組織サンプル(1cm未満2)の小片を固定する。免疫組織化学実験(技術図示せず)のために、この埋め込まれたサンプルを使用してください。
- 全体の脂肪組織( -技術図示していない例えば 、遺伝子発現)上のさらなる研究のために-80℃で保存する前に、液体窒素中で50 mlチューブとフラッシュ凍結に別の作品を配置します。
2.コラゲナーゼ消化
- 50ミリリットルtuの中の残りの脂肪組織片を置き消化のためにも。
- 消化管中の試料のグラム当たりのコラゲナーゼ(350 U / ml)を補充したKRH-WBを4mlを加える。
- はさみで脂肪組織をみじん切りに。
- 45分のインキュベーション(最大1時間)のために、シェーカーで37℃、90回転数の最大値を、みじん切り脂肪組織懸濁液を置きます。
脂肪細胞および前脂肪細胞の精製
- プラスチック製のビーカーにメッシュ400のナイロンを通して脂肪の少ないチャンクと半透明のソリューションを注ぐ。
- ピンセットで、ナイロンメッシュ上の細胞調製をこするとKRH-WBの5ミリリットルで洗浄する。
- 微妙にその中にプラスチック管および管端に取り付けられた60ccのシリンジで50ミリリットルチューブに濾過し、細胞懸濁液を転送します。
- 成熟脂肪細胞との懸濁液を、細胞が浮遊することによって、バッファの先頭に到達することを可能にする、約10分間放置する。
- ゆっくりと60ccのsyrinを使用して、チューブの底にバッファを吸引GE吸引。
- 洗ってKRH-WBの20ミリリットルを追加します。 2追加の洗浄のためのステップ3.4から繰り返します。
- 細胞の量に応じて、5または10 mlの最終容積に脂肪細胞の懸濁液をもたらすためにバッファを集める。セクション5のステップで追求しています。
- 所望であれば、さらに、初代細胞培養の遠心分離によって60ccのシリンジ(3000回転、RT、5分)で集めバッファから間質 - 血管画分を回収し(技術が示されていない)。
4.成熟脂肪細胞細胞数
- 負荷の計数室(血球計)で穏やかに振盪脂肪細胞懸濁液10μl。四重に細胞数を実行します。
- 孤立した成熟細胞の数を計算します。
T-25フラスコに5.成熟脂肪細胞脱分化
- DMEM / F12-20%ウシ血清でボリュームの3/4に25cm 2の組織培養フラスコを埋める。
- 細胞数に応じて、フラスコに50万成熟細胞を注ぐ。 培地で50ミリリットルチューブを使用して完全にフラスコを記入し、できるだけ多くの気泡を除去。
- フラスコ上の未換気キャップをねじ込みます。
- 汚染を避けるためにインキュベーションの前にエタノールでフラスコを清掃してください。
- 細胞接着が中断される場合があり文化の動きを避けるために、それに触れることなく、週に逆さまにフラスコをインキュベートする。
- 反転した培養7日目に、フラスコを逆にする前に、静かにフラスコを操作し、突然の動きを避け、吸引によりフラスコ内のすべてのメディアを削除します。
- DMEM-F12-20%ウシ血清の12ミリリットルを追加し、標準的な技術を用いて細胞を養う。ろ過、ベントキャップフラスコに添加してもよい。
6ウェルプレートに6成熟脂肪細胞脱分化
- 6ウェルプレートの各ウェルの底にカバースリップを置き
- 各カバースリップの上に½ "プラスチックブッシングを追加します。
- 20%のウシ血清DMEM培地の8ミリリットルで井戸を埋める。
- 各プラスチックブッシングにカバースリップを置く。
- スライドとスライドの下で細胞を注入するチューブ(ウェル当たり50,000細胞)との間にピペットチップを挿入します。
- 週5%CO 2、37℃で標準的な細胞培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。
- 20%のウシ血清を補充した培地の各ウェルを含む2ミリリットル中に付着した細胞を用いた逆カバースリップと文化を追求する。
- 免疫蛍光(技術が示されていない)を含むいくつかの目的のために脱分化を受けている細胞でカバーガラスを使用してください。
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Representative Results
主な形態学的変化は、脱分化( 図1)の間に脂肪細胞を成熟起こる。 図2に示すように、脱分化を受けている細胞は、蛍光分析のために抗FABP4抗体で染色した。線維芽細胞様細胞の大部分はしなかったのに対し、丸い形態を有する細胞は、FABP4タンパク質を発現した。脱分化した後、DFAT細胞は数回の継代のための標準的な手順で培養することができる。我々は、ヒト大網および皮下DFAT細胞株のための15以上の継代に到達することができた(データは示さず)。
培養12日目に7日間および(C)で4日間(B)の時刻(A)上に成熟脂肪細胞の脱分化の図1形態。写真は、位相差microscopを用いたインキュベーションの間の異なる時点で採取したE。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
脱分化を受けている脂肪細胞におけるFABP4タンパク質の、図2の検出。細胞は、分化の13日後に固定し、免疫蛍光抗FABP4抗体で染色した。核はDAPI染色で可視化した。左:免疫蛍光の対応する明視野像。右:マージされた画像が表示されます(FABP4-赤、核 - 青 - 10X)。丸い形態学急行FABP4、成熟した脂肪細胞のマーカーで脂肪細胞、細長い細胞は、もはやそれを発現する。スケールバー:1ユニット= 0.25ミリメートル、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
天井培養技術と成熟脂肪細胞の脱分化は、天然の脂肪組織の小サンプルから脂肪幹細胞を得るための新たなアプローチである。我々の経験など2のそれに基づいて、組織の1グラムを25cm 2のフラスコにプレートし、均質性がPoloni及び共同研究者3によって実証されているDFAT細胞の集団を得るために十分である。脂肪細胞の脱分化は、独立して自分の年齢、性別、その他の特徴の、いずれかのドナーからの細胞では可能と思われる。 DFATの得られる集団得なかで、完全に脱分化しなかったいくつかのラウンドにまたは部分的に細長い細胞が残っている。彼らはトリプシンメディアミックスのfloatとしてこれらの細胞は、通常、培養通路を通って廃棄される。
これらの細胞の多能性を確立し、細胞療法2,3のためのそれらの使用をサポートしている。それらの高い増殖能力はまた、報告されている私幹細胞のアプリケーション2のための細胞培養のSA貴重な側面。ヒトDFAT細胞を用いた研究は、彼らの複製および分化能力18に基づいて、同一のドナーからASCよりも効率的であり得ることを示した。最近の事例では、DFAT細胞が脂肪細胞および骨芽細胞に分化することがより効率的であった、と同じ個体、肥満や糖尿病18とのドナーからASCよりも高いテロメラーゼレベルを有していたことをサポートしています。したがって、天井培養の使用は、既に使用ASCよりも効率的な脂肪幹細胞を提供することができる。しかし、追加の実験は明らかにこの点を評価するために必要とされる。
我々の6ウェルプレート天井培養技術は、脱分化プロセス自体の研究を可能にする。セルの最小数は、播種し、特定の時点の研究を可能にすることができる。例えば、我々は、脂肪細胞からのアンダーグラウンド免疫蛍光法を実行するために、6ウェルプレートの顕微鏡スライドを収集oing脱分化( 図2)。顕微鏡法を実行する、または蛍光なしでは、脱分化の様々な側面を評価することが非常に適切である。
電池用途幹に加えて、DFAT細胞は、生理学的研究のための興味深いモデルを表すことができる。少数の研究は、遺伝子発現の両方の細胞型の機能を調べた。簡単に述べると、同じ脂肪区画からASCとDFATは、遺伝子発現および分泌4に類似性を示した。同じドナーからのASCとDFAT間のより比較が必要である。
結論として、我々は、脂肪組織のコラゲナーゼ消化と天井培養技術のよく確立された技術を用いたヒト脂肪組織からDFAT細胞を得るためにどのようにこの技術レポートで表示されます。独自の6ウェルプレート形式は、より一般的に使用さフラスコ法が大きくPOPUの生成を可能にするのに対し、脱分化過程に関する知識を高めるのを助けることができるDFAT細胞のlations。このプロトコルの主な制限は、書かれた患者とインフォームドコンセントを得るために、手術チームと倫理管理とのコラボレーションに依存しているヒト脂肪組織へのアクセスです。成熟細胞は、操作中に予防措置を必要とする非常に敏感である。我々は、最適な結果を得るために、プロトコル、特にT-25flaskでめっきされる脂肪細胞の数は、6ウェルプレートフォーマットを最適化し、大きな追加の変更やトラブルが予想することはできない。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
Adenosine | Sigma | A4036 | |
Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
NaCl | Any brand can be used | ||
KCl | Any brand can be used | ||
CaCl2 | Any brand can be used | ||
MgCl2 | Any brand can be used | ||
KH2PO4 | Any brand can be used | ||
HEPES | Any brand can be used | ||
Glucose | Any brand can be used | ||
Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
Liquid nitrogen | Linde | ||
Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
Sterile tweezers | |||
Sterile scissors | |||
60 cc syringes | BD Syringe | ||
Plastic tubing | |||
Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
Sterile beakers |
References
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