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Developmental Biology

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

Published: March 7, 2015 doi: 10.3791/52485

Protocol

윤리 문 :이 프로젝트는 이전에 환자 모집에 IUCPQ의 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 이 문서 / 비디오의 목적을 위해, 우리는이 환자의 조직을 얻을 : 1) 57kg의 체질량 지수 50.7 kg / m 2, 2) 35 세 여자 환자의 BMI와 62 세 남자 환자 / 2, m. 실험은 모두 지방 구획하여 수행 할 수 있지만,이 동영상의 목적을 위해 하나의 지방 구획에 한정되어왔다. 비디오의 기술적 인 측면은 환자 1 수행하고 FABP4 면역 형광이 환자 세포로부터 분화를 수행 하였다.

1. 시료 처리

  1. 복강경 비만 수술시의 대망과 피하 지방 구획에서 지방 조직을 수집하는 외과 의사에게 문의하십시오.
  2. 빠르게 RT에서 실험실로 지방 샘플을 가져 즉시 처리합니다.
  3. 비 멸균 분위기에서, 실험실에서 소화를 수행합니다.결국 세포 배양실에 옮기고 멸균 조건 하에서 배양한다. 오염을 방지하기 위해, 소화 이전에 증류 여과 물 KRH 버퍼를 준비하고 여과 (0.22μM 필터)에 의해 수행합니다. 플라스크 및 플레이트 제조를위한 세포 배양 후드에서 에탄올 전에 전송으로 깨끗하게 청소 튜브.
  4. 사전 가중 요리와 기록 체중에 지방 조직을 놓습니다. 파라핀 매립하기 전에 적어도 24 시간 동안 실온에서 10 % 포르말린 버퍼 내의 각 조직 샘플 (이하 1cm 2)의 작은 조각을 고정. 면역 조직 화학 실험이 포함 된 샘플 (도시하지 않음 기술)를 사용합니다.
  5. (- 기술 도시하지 않은 예는, 유전자 발현)이 전체 지방 조직에 대한 자세한 연구를 위해 -80 ° C에 저장하기 전에 액체 질소에 50 ml의 튜브와 플래시 동결의 다른 조각을 놓습니다.

2. 콜라게나 소화

  1. 50 ㎖ TU의 나머지 지방 조직 조각을 배치소화합니다.
  2. 소화 관에 시료의 g 당 콜라게나 제 (350 U / ml)로 보충 KRH-WB의 4 ML을 추가합니다.
  3. 가위로 지방 조직을 말하다.
  4. 45 분 배양 (최대 1 시간)에 대한 통에 37 ° C, 90 RPM의 최대, 다진 지방 조직 서스펜션을 놓습니다.

지방 세포 Preadipocytes 3. 정제

  1. 플라스틱 비커에 메쉬 400 μm의 나일론을 통해 지방의 몇 덩어리 반투명 솔루션을 붓는다.
  2. 핀셋, 나일론 메쉬에 셀 준비를 문질러 KRH-WB 5 ㎖로 세척한다.
  3. 섬세 그것에 플라스틱 배관 및 배관 말단에 부착 된 60cc 주사기에 50 ㎖ 튜브에 여과 세포 현탁액을 전송합니다.
  4. 성숙한 지방 세포 현탁액으로 세포가 부상하여 버퍼의 상단에 도달 할 수 있도록 약 10 분간 방치하자.
  5. 천천히 60cc의 syrin를 사용하여 튜브의 하단에있는 버퍼를 대기음GE의 흡입.
  6. KRH-WB 20 ml의 세척에 추가. 2 추가 세척을위한 단계 3.4에서 반복합니다.
  7. 셀의 양에 따라, 5 또는 10 ㎖의 최종 부피로 지방 세포 현탁액을 가지고 수집 버퍼. 섹션 5에서 단계를 추구한다.
  8. 원하는 경우 상기 일차 세포 배양 용 원심 60cc 주사기 (3000 RPM, RT, 5 분)으로 수집 버퍼로부터 간질 혈관 부분을 복구 (기술은 도시 생략).

4. 성숙한 지방 세포의 세포 수

  1. 부하 계산 챔버 (혈구)에 부드럽게 흔들리고 지방 세포 현탁액의 10 μL. 4 번씩 세포 수를 수행합니다.
  2. 격리 된 성숙한 세포의 수를 계산합니다.

T-25 플라스크에 5 성숙한 지방 세포 탈분화

  1. DMEM / F12-20 %의 혈청을 사용하여 볼륨의 3/4 25cm 조직 문화 플라스크를 입력합니다.
  2. 세포 수에 따라, 플라스크 500,000 성숙한 세포를 붓는다. 완전 배지로 50ML 튜브를 사용하여 플라스크를 채우고 가능한 많은 거품을 제거한다.
  3. 플라스크에 환기가 안되는 캡 나사.
  4. 오염을 방지하기 위해 배양하기 전에 에탄올로 플라스크를 청소합니다.
  5. 세포의 흡착을 방해 할 수있는 문화 운동을 방지하기 위해 그것을 건드리지 않고 거꾸로 일주일 동안 플라스크를 품어.
  6. 역 문화 7 일에서 플라스크를 반전하기 전에 부드럽게 갑작스러운 움직임을 방지, 플라스크를 조작하고 흡인하여 플라스크에 모든 매체를 제거합니다.
  7. DMEM-F12-20 %의 혈청 12 ML을 추가하고 표준 기술을 가진 세포를 배양. 여과 벤트 캡 플라스크에 첨가 될 수있다.

6 웰 플레이트에 6 성숙한 지방 세포 탈분화

  1. 6- 웰 플레이트의 각 웰의 바닥에 배치 커버 슬립
  2. 각 커버 슬립 위에 ½ "플라스틱 부싱을 추가합니다.
  3. 20 % 송아지 혈청 DMEM 매체의 8 ml로 우물을 입력합니다.
  4. 각 플라스틱 부싱에 커버 슬립을 넣습니다.
  5. 슬라이드 및 슬라이드에서 세포를 주입하는 튜브 (물론 당 50,000 세포) 사이의 피펫 팁을 삽입합니다.
  6. 주 5 % CO 2, 37 ℃에서 표준 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션 플레이트.
  7. 각 웰에 20 % 송아지 혈청 미디어 2 ㎖를 포함하고 추구하는 문화에 부착 된 세포와 역 커버 슬립.
  8. 세포가 면역 등 여러 가지 목적으로 탈분화를 겪고로 커버 슬립을 사용 (기술은 도시하지 않음).

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Representative Results

주요 형태 학적 변화는 탈분화 (그림 1) 동안 지방 세포를 성숙 발생합니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 탈분화을받은 세포는 형광 분석을위한 안티 FABP4 항체로 염색 하였다. 섬유 아세포 유사 세포의 대부분은하지 않았다 반면 라운드 형태로 세포 FABP4 단백질 발현. 탈분화 후 DFAT 세포는 여러 통로위한 표준 절차를 재배 할 수있다. 우리는 인간 피하 장간막 DFAT 세포주 대 이상의 통로 (15)에 도달 할 수 있었다 (결과 미도시).

그림 1
사일 (B) 칠일과 문화. 사진의 12 일에 (C)에서에서 시간 (A)을 통해 성숙한 지방 세포를 dedifferentiating 그림 1. 형태론은 위상차 microscop를 사용하여 배양 중에 다른 시간 지점에서 찍은전자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
지방 세포에서 FABP4 단백질의 그림 2. 감지 탈분화를 받고. 세포는 탈분화 13 일 후에 고정 및 면역 안티 FABP4 항체로 염색 하였다. 핵은 DAPI 염색으로 가시화되었다. 왼쪽 : 면역 대응의 명 시야 이미지. 오른쪽 : 병합 된 이미지가 표시됩니다 (FABP4 - 빨강, 핵 - 블루 10 배). 가늘고 긴 세포 반면 둥근 형태 명시 FABP4, 성숙한 지방 세포 마커와 지방 세포는 더 이상 그것을 표현하지 않습니다. 스케일 바 : 1 단위 = 0.25mm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

천장 배양법 성숙한 지방 세포의 탈분화 네이티브 지방 조직의 작은 샘플로부터 지방 줄기 세포를 얻기 위해 새로운 방식이다. 경험 등 (2)의 기준, 1g 조직은 25 cm-2 플라스크 판형하고 균질 Poloni 협력자 (3)에 의해 입증되었다 DFAT있는 세포 집단을 수득하기에 충분하다. 지방 세포의 탈분화는 독립적으로 연령, 성별 및 기타 특성, 어떤 기증자 세포 가능한 것 같다. DFAT는 얻어진 결과 인구 중 거의 원형 또는 완전히 탈분화하지 않은 연장 된 셀이 부분적으로 남아있다. 그들은 트립신 미디어 믹스에 떠 이러한 세포는 일반적으로 문화의 통로를 통해 삭제됩니다.

이러한 세포의 다 능성 설립 및 세포 치료 2,3에 대한 사용을 지원합니다. 높은 증식 능력은 또한,보고 된 I줄기 세포 응용 프로그램 2 세포 배양의 SA 가치 측면. DFAT 인간 세포 연구와 그들의 복제 성 및 분화 능력 (18)에 기초하여, 동일한 도너로부터 ASC보다 더 효율적일 수 있다는 것을 나타냈다. 최근의 사례 연구는 DFAT 세포는 지방 세포와 조골 세포로 분화하는 것이 더 효율적이었으며, 동일한 개인, 비만과 당뇨병 (18)와 기증자 ASC보다 더 높은 텔로 머라 아제 수준 있었다는 것을 지원합니다. 따라서, 천장 배양의 사용은 이미 사용 ASC보다 효율적 지방 줄기 세포를 제공 할 수있다. 그러나, 추가 실험은 분명히이 점을 평가하기 위해 필요하다.

우리의 6 웰 플레이트 천장 문화 기술은 탈분화 과정 자체의 연구를 위해 수 있습니다. 세포의 최소한의 도금 및 특정 시간 포인트의 연구를 허용 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 지방 세포에서 면역 형광 underg을 수행하는 6- 웰 플레이트를 현미경 슬라이드를 수집oing 탈분화 (그림 2). 또는 형광없이 miscroscopy 수행 탈분화의 다양한 양태를 평가하는 것이 매우 적합하다.

셀 애플리케이션 줄기 외에도 DFAT 세포는 생리 학적 연구를위한 모델 흥미를 나타낼 수있다. 단지 몇 연구는 유전자 발현과 두 종류의 세포 기능을 조사 하였다. 같은 지방 구획에서 간단한, ASC 및 DFAT에서 유전자 발현 및 분비 4의 유사성을 보여 주었다. 같은 기증자로부터 ASC 및 DFAT 사이에 더 많은 비교가 필요합니다.

결론적으로, 우리는 지방 조직의 콜라겐 소화 잘 확립 된 기술과 천장 배양 기술을 이용하여 인간의 지방 조직에서 DFAT 세포를 구하는 방법이 기술 보고서​​에 표시. 오리지널 6- 웰 플레이트 형식은 일반적으로 사용되는 방법은, 주 형틀 큰 popu의 생성을 허용하는 반면 탈분화 과정에 대한 지식을 높일 수있다DFAT 세포 lations. 이 프로토콜의 주요 제한은 환자 기록과 동의서를 얻을 수있는 수술 팀과 윤리 경영과의 협력에 의존하는 인간의 지방 조직에 대한 접근이다. 성숙한 세포 조작에주의를 요구하는 매우 민감하다. 우리는 최적의 결과를 얻기 위해, 프로토콜, 특히 T-25flask에서 도금 될 지방 세포의 수 및 6 웰 플레이트 포맷을 최적화하고 추가 수정 더 큰 문제는 없을 것으로 예상 될 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumine Sigma A7906
Adenosine Sigma A4036
Ascorbic acid Sigma A0278
NaCl Any brand can be used
KCl Any brand can be used
CaCl2 Any brand can be used
MgCl2 Any brand can be used
KH2PO4 Any brand can be used
HEPES Any brand can be used
Glucose Any brand can be used
Type I collagenase Worthington Biochemical Corp LS-004196
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red Gibco-Life Technologies 11039-021 Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml)
Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves Sigma C8056-500 ml
1/2 In plastic bushing Iberville 2704-CP SKU:1000120918 (Home Depot)
Liquid nitrogen Linde
Formalin soluton, neutral buffered, 10% SIGMA HT501128
Sterile tweezers
Sterile scissors
60 cc syringes BD Syringe
Plastic tubing
Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid
KRH-WB supplemented with Type I collagenase Add 350 U/ml of Type I collagenase
T25 unvented cap tissue culture flask Sarsted or other brand
6-well tissue culture plate BD Falcon or other brand
Microscope cover glass 22x22 Fisherbrand 12-542-B
Sterile beakers

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References

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발달 생물학 문제 97 지방 세포 탈분화 DFAT 콜라겐 지방 조직 세포 생물학 비만
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Lessard, J., Côté, J. A.,More

Lessard, J., Côté, J. A., Lapointe, M., Pelletier, M., Nadeau, M., Marceau, S., Biertho, L., Tchernof, A. Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures. J. Vis. Exp. (97), e52485, doi:10.3791/52485 (2015).

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