Protocol
Declaração de Ética: O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da IUCPQ antes de recrutamento de pacientes. Para efeitos deste artigo / vídeo, obtivemos tecidos a partir de 2 pacientes: 1) um paciente do sexo masculino 62 anos de idade, com um IMC de 50,7 kg / m 2 e 2) uma paciente de 35 anos de idade, com um IMC de 57 kg / m 2. Experiências pode ser feito com ambos os compartimentos de gordura, mas têm sido limitadas a um compartimento de gordura para o propósito deste vídeo. Aspectos técnicos do vídeo foram realizadas com o paciente 1 e FABP4 imunofluorescência foi realizada com células indiferenciadas de paciente 2.
Processamento 1. Amostra
- Peça cirurgiões para coletar tecido adiposo dos compartimentos de gordura omental e subcutâneas, no momento da cirurgia bariátrica laparoscópica.
- Rapidamente trazer amostras de tecido adiposo para o laboratório da RT e processar imediatamente.
- Executar a digestão no laboratório, numa atmosfera não-estéril. Océlulas acabará por ser transferida para a sala de cultura e cultivado em condições estéreis. Para evitar a contaminação, preparar tampão de KRH com água destilada e filtrou-se e seguir por filtração (filtro de 0,22 um) antes da digestão. Tubos cuidadosamente limpos com etanol prévia de transferência na capa de cultura celular para frasco e placa preparação.
- Coloque o tecido adiposo em um prato pré-pesados e peso recorde. Fixar um pequeno pedaço de cada amostra de tecido (menos de 1 cm 2) em tampão de formalina a 10% à temperatura ambiente durante pelo menos 24 horas antes do bloco de parafina. Utilize esta amostra embutido para experimentos de imunohistoquímica (técnica não apresentado).
- Coloque outra peça em um tubo de 50 ml e flash por congelação em azoto líquido antes do armazenamento a -80 ° C para estudos posteriores sobre os tecidos adiposos inteiros (por exemplo, a expressão do gene - técnica não mostrado).
2. Collagenase Digestão
- Coloque o pedaço de tecido adiposo remanescente em 50 ml de um tuser para a digestão.
- Adicionar 4 ml de KRH-WB suplementados com colagenase (350 U / ml) por grama de amostra no tubo de digestão.
- Picar o tecido adiposo com uma tesoura.
- Coloque suspensão de tecido adiposo picada num agitador, 37 ° C, máximo de 90 rpm, durante um período de incubação de 45 minutos (máximo 1 h).
3. Purificação de adipócitos e pré-adipócitos
- Despeje a solução translúcida com alguns pedaços de gordura através de um nylon 400? M malha em um copo de plástico.
- Com uma pinça, esfregue a preparação de células na malha de nylon e lavar com 5 ml de KRH-WB.
- Delicadamente transferir a suspensão de células filtrada para um tubo de 50 ml com o tubo de plástico em que uma seringa de 60 cc e ligado na extremidade de tubos.
- Deixe a suspensão com adipócitos maduros repouso durante aproximadamente 10 min, permitindo que as células atingissem a parte superior do tampão por flutuação.
- Lentamente aspirar o tampão na parte inferior do tubo por meio de 60cc Syrinsucção ge.
- Adicionar 20 ml de KRH-WB para lavar. Repita a partir do passo 3.4 para 2 lavagens adicionais.
- Recolhe-se o tampão para trazer a suspensão dos adipócitos para um volume final de 5 ou 10 ml, dependendo da quantidade de células. Prosseguir com etapas na seção 5.
- Recuperar a fracção do estroma vascular do tampão recolhido com a seringa de 60 cc por centrifugação (3000 rpm, TA, 5 min), para posterior cultura de células primária, se desejado (técnica não mostrado).
4. adipócito maduro Contagem de Células
- Carregar 10 ml de suspensão de adipocitos suavemente agitada em uma câmara de contagem (hemocitómetro). Efectuar a contagem de células em quadruplicado.
- Calcular o número de células maduras isoladas.
5. maduro adipócito Dedifferentiation em T-25 Flask
- Encha a 25 cm2 de cultura de tecidos frasco a ¾ do volume com DMEM / F12-20% de soro.
- De acordo com a contagem de células, despeje 500.000 células maduras no balão. Encher o balão completamente através de um tubo de 50 ml com meio e retire o máximo de bolhas possível.
- Colocar a tampa não ventilado no frasco.
- Limpar o balão com etanol antes da incubação para evitar a contaminação.
- Incubar o frasco de cabeça para baixo por uma semana sem tocá-lo para evitar o movimento na cultura que possa interromper a adesão celular.
- Antes de inverter o frasco a 7 dias de cultura invertido, manipular suavemente o frasco e remover todo o meio no frasco por aspiração, evitando movimentos bruscos.
- Adicionar 12 ml de DMEM-F12-20 soro% bezerro e cultivar células com técnicas convencionais. Um filtrada, tampa ventilada pode ser adicionado ao frasco.
6. adipócito maturo desdiferenciação em uma placa de 6 poços
- Coloque uma lamela sobre o fundo de cada poço de uma placa de 6 poços
- Adicionar um ½ "bucha de plástico em cima de cada lamela.
- Encha os poços com 8 ml de 20% de meio de soro de vitelo-DMEM.
- Coloque uma lamela em cada bucha de plástico.
- Insira ponta da pipeta entre a lâmina e o tubo para injetar células sob o slide (50.000 células por poço).
- Incubar as placas numa incubadora de cultura de células padrão, a 37 ° C com 5% de CO 2 durante uma semana.
- Lamela reverso com células ligadas em todos os poços contendo 2 ml de meio suplementado com 20% de soro de bezerro e perseguir cultura.
- Use lamela com células submetidos desdiferenciação para vários fins, incluindo a imunofluorescência (técnica não mostrado).
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Representative Results
As principais alterações morfológicas ocorrer a amadurecer adipócitos durante desdiferenciação (Figura 1). Como mostrado na Figura 2, as células submetidas a desdiferenciação foram coradas com um anticorpo anti-FABP4 para análise de fluorescência. As células com uma morfologia redonda expressa a proteína FABP4 enquanto a maioria das células semelhantes a fibroblastos não o fez. Depois de desdiferenciação, células DFAT pode ser cultivada com os procedimentos padrão para diversas passagens. Temos sido capazes de chegar a mais de 15 passagens para omental humano e linhagens de células subcutâneas DFAT (dados não mostrados).
Figura 1. Morfologia de dedifferentiating adipócitos maduros ao longo do tempo (A) a 4 dias (B) aos 7 dias e (C) aos 12 dias de cultura. As fotografias foram tomadas em diferentes pontos de tempo durante a incubação com um microscop de contraste de fasee. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A detecção da proteína FABP4 em adipócitos submetidos a desdiferenciação. As células foram fixadas após 13 dias de desdiferenciação e coradas com anticorpo anti-FABP4 por imunofluorescência. Os núcleos foram visualizados com coloração DAPI. Esquerda: Imagem Brightfield de imunofluorescência correspondente. Direita: A imagem mesclada é mostrado (FABP4-vermelho, Núcleos-blue-10X). Os adipócitos com morfologia redonda FABP4 express, um marcador de adipócitos maduros, enquanto que as células alongadas já não expressá-la. Barra de escala: 1 unidade = 0,25 milímetros Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Desdiferenciação de adipócitos maduros com a técnica de cultura de tecto é uma nova abordagem para a obtenção de células estaminais do tecido adiposo a partir de uma pequena amostra de tecido adiposo nativa. Com base em nossa experiência e na de outros dois, um grama de tecido é suficiente para a chapa um balão de 25 cm 2 e obter uma população de células DFAT para que homogeneidade tem sido demonstrado por Poloni e colaboradores 3. Adipócito desdiferenciação parece possível com células de qualquer dador, independentemente da sua idade, sexo e outras características. Entre a população resultante de DFAT obtido, restam alguns redonda ou células parcialmente alongadas que não dedifferentiate totalmente. Estas células são normalmente descartados através da passagem de cultura enquanto flutuam no mix de tripsina-media.
Multipotency destas células é estabelecida e apoia o seu uso para a terapia celular 2,3. A sua elevada capacidade proliferativa também tem sido relatado, o que isa aspecto valioso da cultura de células para aplicações de células-tronco 2. Estudos com células DFAT humanos indicaram que eles podem ser mais eficientes do que ASC do mesmo doador, com base na sua capacidade replicativa e a diferenciação 18. Um estudo de caso recente suporta que as células DFAT foram mais eficientes de se diferenciar em adipócitos e osteoblastos, e tinham níveis mais elevados do que telomerase ASC do mesmo indivíduo, um doador com obesidade e diabetes 18. Assim, o uso da cultura teto pode fornecer células-tronco adiposas mais eficiente que o ASC já utilizado. No entanto, experimentos adicionais são necessários para avaliar claramente este ponto.
A nossa técnica de 6 poços de cultura placa de tecto permite o estudo do processo de desdiferenciação si. Um número mínimo de células podem ser colocadas em placas e permite o estudo de pontos de tempo específicos. Por exemplo, foram colhidos a partir de uma lâmina de microscópio placa de 6 poços para executar imunofluorescência de adipócitos undergdesdiferenciação oing (Figura 2). Realizando miscroscopy, com ou sem fluorescência, é altamente relevante para avaliar vários aspectos da desdiferenciação.
Além de aplicações em células estaminais, células DFAT pode representar um modelo interessante para estudos fisiológicos. Apenas alguns estudos examinaram expressão e funções de ambos os tipos de células do gene. Em breve, ASC e DFAT do mesmo compartimento de gordura mostraram semelhanças na expressão gênica e secreção 4. Mais comparações entre ASC e DFAT do mesmo dador são necessárias.
Em conclusão, foi demonstrado nesse relatório técnico para a obtenção de células a partir de tecido adiposo DFAT humano utilizando a técnica bem estabelecida de digestão com colagenase de tecido adiposo e a técnica de cultura de tecto. A nossa formato original placa de 6 poços pode ajudar a aumentar o conhecimento sobre o processo de desdiferenciação enquanto que o método do frasco mais comummente utilizado permite a geração de maiores popuções de células DFAT. A principal limitação deste protocolo é o acesso ao tecido adiposo humano que se baseia em colaboração com uma equipe de cirurgia e ética de gestão para obter o consentimento informado por escrito do paciente. Células maduras são altamente sensíveis que requer cuidados na manipulação. Nós optimizada do protocolo, especialmente o número de adipócitos a ser plaqueadas em T-25flask e o formato de placa de 6 poços, para obter resultados óptimos e sem grandes modificações ou resolução de problemas adicionais podem ser antecipadas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
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